מאמר זה מתאר שיטה ליצירה והתפשטות של שיבוטי תאי T אנושיים המגיבים באופן ספציפי לאלואנטיגן מוגדר. ניתן להתאים פרוטוקול זה לשיבוט תאי T אנושיים ספציפיים למגוון ליגנדים של פפטיד-MHC.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
דור של תאי T האנושי Alloantigen ספציפיים מהדם היקפי
במאמר זה
סיכום
תקציר
חקר הביולוגיה של לימפוציטים מסוג T אנושי כרוך לעתים קרובות בבחינת תגובות להפעלת ליגנדים. תאי T מזהים ומגיבים לאנטיגנים פפטידיים מעובדים המוצגים על ידי מולקולות MHC (HLA אורתולוגי אנושי) דרך קולטן תאי T (TCR) בצורה רגישה וספציפית ביותר. בעוד שתפקידם העיקרי של תאי T הוא לתווך תגובות חיסוניות מגנות לאנטיגנים זרים המוצגים על ידי MHC עצמי, תאי T מגיבים בעוצמה להבדלים אנטיגניים ברקמות אלוגניות. ניתן לתאר את תגובות תאי T לאלואנטיגנים כפעילות ישירה או עקיפה. בפעילות אלוראטיבית, תא ה-T מגיב באמצעות זיהוי ספציפי ביותר הן של הפפטיד המוצג והן של מולקולת ה-MHC. התגובה האוליגוקלונלית החזקה של תאי T לגירוי אלוגני משקפת את המספר הגדול של אלואנטיגנים בעלי פוטנציאל לגירוי הקיימים ברקמות אלוגניות. בעוד שרוחב התגובות של תאי T אלוראקטיביים הוא גורם חשוב בייזום ותיווך הפתולוגיה הקשורה לתגובות אלוראקטיביות רלוונטיות מבחינה ביולוגית כגון מחלת השתל נגד המארח ודחיית אלוגרפט, זה יכול למנוע ניתוח של תגובות תאי T לליגנדים אלוגניים. לשם כך, פרוטוקול זה מתאר שיטה ליצירת תאי T אלוראקטיביים מלויקוציטים נאיביים של דם היקפי אנושי (PBL) המגיבים לאלואנטיגנים ידועים של פפטיד-MHC (pMHC). הפרוטוקול מיישם תיוג מולטימר pMHC, העשרת חרוזים מגנטיים וזרימה ציטומטרית על שיטות תרבית תא בודד במבחנה ליצירת שיבוטים של תאי T ספציפיים לאלואנטיגן. זה מאפשר מחקרים על הביוכימיה והתפקוד של תאי T המגיבים לגירוי אלוגני.
מבוא
לימפוציטים מסוג T הם רכיבים קריטיים של המערכת החיסונית אדפטיבית. תאי T אחראים ללא רק ישירות תיווך תגובות חיסוניים הגנתיות לפתוגנים באמצעות מגוון רחב של מנגנוני מפעיל, אלא גם באופן פעיל שמירה על סובלנות עצמית חיסונית ומכוון את התגובות של תאים אחרים במערכת החיסונית. פונקציות אלה מופנות דרך מספר האותות משולבים, כולל קולטן תא T קשירה (TCR), ציטוקינים וכמוקינים, ומטבוליטים 1. האותות הללו, TCR הוא בעלת חשיבות מיוחדת, כפי שהוא מספק את הספציפיות האופייניות שמגדירה את התפקיד של תאי T בחסינות אדפטיבית. TCR אינטראקציה עם אנטיגנים פפטיד ליניארי שהוצגו על ידי MHC (HLA ortholog אדם) מולקולות (מתחמי pMHC) באופן ספציפי ורגיש מאוד לת....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: פרוטוקול זה דורש שימוש בדגימות דם היקפיים ממתנדבים אנושיים. כל המחקר עם בני אדם צריך להיבדק ואושר על ידי דירקטוריון סקירה מוסדית אדם מחקרים כדי להבטיח עמידה בהצהרת הלסינקי (2013) וביטוח בריאות טלטלות הדין והחשבון Act משנת 1996.
1. בידוד של תאי T מדם מלא
- לפני שמתחיל, לחמם את מדיום שיפוע הצפיפות לטמפרטורת חדר. Aliquot 4 מיליליטר של מדיום שיפוע צפיפות לתוך צינורות צנטריפוגה חרוטי 2-4 15 מיליליטר סטרילי (צינור 1 ישמש לכל 10 מיליליטר נפח כולל של דם מדולל).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
פרוטוקול זה מתאר את הדור של תרביות תאי T אנושיות משובט עם מוגדר alloantigen ספציפי באמצעות העשרה מגנטית חרוז וזרימת תא בודד cytometry מיון אסטרטגיה. איור 1 מספק קווי המתאר של התהליך.
איור 1: סקירת פרוטוקול הפרוטוקול מתואר כאן מספק שיטה אמינה לייצור של שיבוטים של תאי .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פעילות תאי T היא תופעה שנחקרה זמן רב ורלוונטית מבחינה קלינית. התגובות החזקות של תאי T לגירוי אלוגני אפשרו ניתוחים נרחבים של תגובות תאי T אנושיים במבחנה באמצעות תגובות לימפוציטים מעורבות פשוטות יחסית של תאי T בדם היקפי כנגד תאים אלוגניים מושבתים. עם זאת, תגובות תאי T אלוראקטיביות ראשוניות אלה הן אוליגוקלונליות, המורכבות ממספר רב של תאי T בודדים המגיבים לאלואנטיגנים ספציפיים. גיוון זה בתגובת תאי T פוגע ביכולת לבחון את הביוכימיה של זיהוי ליגנד pMHC המניע תגובות תאי T אלוראקטיביות. הפתרון הסטנדרטי לאתגר זה היה ליצור.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.
תודות
המחבר רוצה להודות למתקן הליבה של ה-NIH Tetramer על ייצור הטטרמר. המחבר רוצה גם להודות ל-E.D. O'CONNOR ו-K.E. Marquez במעבדה לזרימה ציטומטרית של מתקן ליבת תאי גזע עובריים אנושיים ב-UCSD על הסיוע במיון תאים. עבודה זו מומנה על ידי מענק המכונים הלאומיים לבריאות K08AI085039 (GPM).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| צינור איסוף דם ורידי נתרן הפרין 16 x 100 מ"מ | Becton, Dickenson and Company | 366480 | |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | 7801 | |
| Rosette Sep Human T Cell Enrichment Kit | Stemcell Technologies | 15061 | |
| Dulbecco's PBS, 1x ללא Ca או Mg | Corning | 21-031-CV | |
| אלבומין | סרום בקרSigma-Aldrich | A7906 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6635 | |
| Fluorophore-Label-pMHC tetramer | מתקן NIH Tetramer | NA | |
| EasySep Biotin Selection Kit | Stemcell Technologies | 18553 | |
| EasySep Selection magnet | Stemcell Technologies | 18000 | |
| TruStain FcX Human Fc חסימת פתרון | Biolegend | 422301 | |
| Anti-CD5 PE-Cy7 (שיבוט UCHT2) | Biolegend | 300621 | |
| Anti-CD14 FITC (שיבוט HCD14) | Biolegend | 325603 | |
| Anti-CD19 FITC (שיבוט HIB19) | Biolegend | 302205-DMEM | |
| של Iscove, ללא b-ME או L-גלוטמין | קורנינג | 15-016-CV | |
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| ב-מרקפטואתנול | Life Technologies | 21985-023 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Gentamicin sulfate (50 מ"ג/מ"ל) | Omega Scientific | GT-50 | |
| סרום AB אנושי, תורם זכר | Omega Scientific | HS-30 | |
| רקומביננטי אנושי IL-2 | Peprotech | AF 200-02 | |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | Life טכנולוגיות | 11131D | |
| מיון תאי | |||
| מדיה | |||
| PBS, pH 7.4 | 1 ליטר | ||
| BSA | 10 גרם | ||
| EDTA (0.5 מ') | 2 מ"ל | ||
| תרבית תאי T אנושיים מדיום | |||
| DMEM של Iscove | 351.6 מ"ל | ||
| סרום AB אנושי מומת בחום | 40 מ"ל | ||
| HEPES (1 מ') | 4 מ"ל | ||
| גלוטמקס (100x) | 4 מ"ל | ||
| ג'נטמיצין (50 מ"ג/מ"ל) | 0.4 מ"ל | ||
| b-מרקפטואתנול (14.3 מ') | 1.4 מ"ל | ||
| IL-2 אנושי רקומביננטי (1 מ"ג/מ"ל) | 1 מ"ל |
מקורות
- Smith-Garvin, J. E., Koretzky, G. A., Jordan, M. S. T cell activation. Annu. Rev. Immunol. 27 (1), 591-619 (2009).
- Morris, G. P., Allen, P. M. How the TCR balances sensitivity and specificity for the recognition of self and pathogens. Nat. Immunol. 13 (2), 121-128 (2012).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
