פרוטוקול רמת מבוא זה מתאר את הריאגנטים, הציוד והטכניקות הנדרשים להשלמת צביעה אימונוהיסטוכימית של מוחות מכרסמים, תוך שימוש בסמנים למיקרוגליה ואלמנטים עצביים כדוגמה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
פריימר לאימונוהיסטוכימיה על רקמות Cryosectioned מוח חולדה: דוגמא להכתמת Microglia ונוירונים
במאמר זה
סיכום
תקציר
אימונוהיסטוכימיה היא טכניקה נפוצה לגילוי הנוכחות, המיקום, והשפע היחסי של אנטיגנים באתר. פרוטוקול ברמת מבוא זה מתאר את חומרים כימיים, ציוד, וטכניקות הנדרשות להשלמת מכתים immunohistochemical של רקמת המוח המכרסם, באמצעות סמנים למיקרוגלים ואלמנטים עצביים כדוגמא. באופן ספציפי, מאמר זה הוא פרוטוקול צעד-אחר-צעד להדמיה ניאון של מיקרוגליה ונוירונים באמצעות אימונוהיסטוכימיה לIba1 ופאן-עצבי, בהתאמה. הקרינה כפול תיוג הוא שימושי במיוחד עבור הלוקליזציה של חלבונים רבים בתוך המדגם זהה, מתן ההזדמנות להתבונן בצורה מדויקת יחסי גומלין בין סוגי תאים, הקולטנים, ligands, ו / או מטריקס ביחס ל, כמו גם אחד אחר שיתוף חלבון לוקליזציה בתוך תא בודד. שלא כמו טכניקות הדמיה אחרות, עוצמת מכתימה אימונוהיסטוכימיה הקרינה עלולה לגרום לירידה בהשבועות לחודשים הבאים מכתים, אלא אם אמצעי זהירות מתאימה נלקח. למרות מגבלה זו, ביישומים רבים הקרינה כפול תיוג עדיף על פני חלופות כגון tetrahydrochloride 3,3'-diaminobenzidine (DAB) או phosphatase אלקליין (AP), כקרינה היא יותר זמן יעיל ומאפשרת לבידול מדויק יותר בין שתיים או יותר סמנים. הדיון כולל עצות לפתרון בעיות וייעוץ לקידום הצלחה.
מבוא
אימונוהיסטוכימיה היא תהליך לאיתור אנטיגנים (כלומר חלבונים) בסעיפים רקמות באמצעות נוגדנים עיקריים שלהיקשר באופן ספציפי לאנטיגנים של עניין. אימונוהיסטוכימיה הייתה חלוץ ידי JR Marrack בשנת 1934 כאשר הוא קבע כי נוגדנים יכולים למקם אנטיגנים עם סגוליות גדולות 1. החל בשנת 1942, חלק בראשון מבחנה באמצעות נוגדני ניאון לדמיין אימונוהיסטוכימיה פורסם 2,3, לאחר שלראשונה במחקר histochemical vivo פורסם 4. במהלך 1960, שלושה עשורים לאחר הקמתה של שיטות immunohistochemical, נוגדני אנזים מצומדות- החלו לשמש כחומרים כימיים משניים. שיטות אלה בו-זמנית ובאופן עצמאי פותחו בצרפת ובארה"ב 5,6. היום, במגוון רחב של נוגדנים מספק אינספור אפשרויות ללימודי אימונוהיסטוכימיה 7.
"> המטרה הכללית של התכתבות זו היא לספק הקדמה קצרה למכתים immunohistochemical, זה לא אמור להיות סקירה מקיפה וממצה של טכניקה זו בשיטה שתוארה, טכניקות immunohistochemical לשני אנטיגנים מוצגות (סמנים למיקרוגלים ו. הנוירונים) להכתמה של paraformaldehyde perfused, מוח סוכרוז cryoprotected, cryosectioned חולדה. המכתים immunohistochemical מתחיל עם חסימת אנטיגן ספציפי מחייב להפחית מכתים רקע. בשלב הבא, דגירה עם נוגדן ראשוני מאפשרת לכריכה לאנטיגן ספציפי ברקמות. בעקבות הנוגדן הראשוני, נוגדן אחר, המכונה נוגדנים משני, מוחל על קישור הנוגדן הראשוני לאות הדמיה מצומדות 8. הנוגדנים משני מטרות אימונוגלובולין G תחום (IgG) הספציפי למין שבו הנוגדן הראשוני הועלה. הנוגדנים משני מגבירים את האות של הנוגדן הראשוני מאז אזורי Fab של tהוא לאגד נוגדנים משני לאתרים מרובים בתחום IgG של הנוגדן הראשוני. כך או אנזימים או מולקולות ניאון מצומדת לאזורי ג 'לנוגדנים משני תאפשר להדמיה. לדוגמא, נוגדן ראשוני אנטי-Iba1 ארנב הוא מולקולת IgG ארנב ספציפית לIba1. כאשר IgG נגד ארנב החמור מיושם כנוגדנים משני, זה יהיה לזהות ולהיקשר לאזורים המרובים של אנטי-Iba1 IgG הארנב (ראה איור 1). הנוגדן החמור ניתן דמיין בשיטות שונות. התכתבות זו מתמקדת בזיהוי של fluorophore מצומדת לנוגדנים משני, שמזהה את הנוגדן הראשוני, להדמיה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. באימונוהיסטוכימיה ניאון, כתם גרעיני כגון Hoechst או DAPI יכול לשמש כדי לחזות את כל הגרעינים.
איור 1: Schייצוג ematic של טכניקות תיוג נוגדן עקיף מול ישיר. נוגדנים נקשרים לאנטיגן של עניין ויכולים להיות מוגבר על ידי נוגדנים משני הועלו נגד המינים של הנוגדנים הראשוניים. טכניקה זו יכולה להתבצע באמצעות מורכבת avidin ביוטין (ABC) להגברה וDAB להדמיה (), או נוגדנים מצומדות ישירות ניאון משניים (B). לחלופין, נוגדנים ראשוניים ניתן מצומדות ישירות עם תגים רבים ושונים, ובכלל זה ביוטין או fluorophore (C). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
שיטה חלופית להדמיה של מכתים immunohistochemical משתמשת 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB; ראה איורים 1 ו -2). זה שונה מקרינה באמצעות biotinylated אוperoxidase סוס-צנון (HRP) נוגדנים משני מצומדות, המספק אנזים להמיר DAB למשקע שנראה תחת מיקרוסקופ שדה הבהיר. במקרים שבם אנטיגן יחיד הוא של ריבית או הכתמה נדרשה להיות ארוך טווח, DAB יכול להיות יותר מתאים מאשר צביעת ניאון. עם זאת, מכתים DAB אינו מתאים היטב לבידול בין סמנים מרובים, במיוחד אם שני אנטיגנים גרעיניים הם עניין. לקבלת מידע על חומרי DAB ושינויי פרוטוקול, להתייעץ טבלת 1. לחלופין, כלוריד tetrazolium הכחול ניטרו / 5-Bromo-4-כלורו-3-indolyl פוספט (NBT / BCIP) יכול לשמש כדי לחזות phosphatase אלקליין (AP) מצומדות המשני נוגדן.
איור 2:. נציג תמונות של חלקים משופרים ניקל DAB שכותרת יחיד חולדה רקמת מוח מוח החולדה sections שכותרתו עם DAB משופר ניקל לIba1 () ופאן-עצבי (ב ') לאפשר לניתוח של מיקרוגליה או נוירונים לבד לטווח ארוך. בר סולם 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
יש לקחת בחשבון את השפע המשוער של אנטיגן של עניין בתוך הרקמה מנותחת. שיטות עקיפות (כמתואר לעיל) הן שימושיות למטרות עם שפע נמוך. כאשר אנטיגן של עניין הוא בשפע גבוה, יכולות להיות מיושמות שיטות ישירות. שיטות ישירים כרוכות נוגדן ראשוני שמצומדות ישירות לאות הדמיה, ובכך אין צורך בנוגדנים משני. שיטה זו מפשטת את תהליך הצביעה, אך מבטלת את ההגברה הושגה על ידי שיטות עקיפות. באמצעות נוגדן ראשוני מצומדות ישירות גם מבטל תגובה צולבת של נוגדנים משניכאשר כפול תיוג.
תקשורת זה מפרטת את הפרוטוקול לתיוג כפול עם Iba1 ו( פרטים בטבלה 1) פאן-עצביים. Iba1 כתמי מיקרוגלים במדינות הפעלה רבות, כוללים מסועף, היפר-מסועף, מופעל, אמבואידית, ומוט. כתמים פאן-עצביים האקסונים, דנדריטים, וסומה עצביות. מאז Iba1 מכתים ביותר המיקרוגלים ומטרות פאן-עצביות נוירון, זה שילוב של כתמים הוא שימושי בהשגת הבנה רחבה של אינטראקציות מיקרוגלים-נוירון.
לסיכום, מכתים immunohistochemical מסתמך על הבחירה זהירה של נוגדנים. כמו שאלת המחקר הופכת להיות יותר ספציפית, נוגדנים העלו לאנטיגנים חלופיים עשויים להיות רצויים. כדי למקד את מצב הפעלת microglial ספציפי, אחד יכול לבחור להשתמש נוגדני CD45 או CD68, ולא Iba1. יתר על כן, בעבודה עם עכברים, F4 / 80 עשוי לספק תוצאות הדרושות. כמו כן, גורמים עצביים יכולים להיות ממוקדים במיוחד עם דלקת מפרקים שגרונית נוגדניםised נגד הגרעין, סינפסה (מראש או שלאחר), האקסון, וחרוט צמיחה. בנוסף, יש סמנים אחרים שמבדילים גיל נוירון (פעמיים cortin, NeuN), והתחדשות עצבית (GAP-43).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: כל הנהלים בוצעו בעמידה בוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) מאוניברסיטת אריזונה. ניתן למצוא רשימה של חומרים וציוד מומלצים בטבלה 1.
1. רקמות הכנה
- זלוף
- להרדים מכרסם עם מנת יתר של נתרן pentobarbital (25 מ"ג / קילוגרם, IP), ותנקב transcardially עם מי מלח פוספט (PBS) עד exsanguinated לחלוטין (דקות 3-5) בקצב זרימה של 8 מיליליטר / דקה. לקבלת הוראות זלוף המעמיק, לראות גייג 'ואח' 2,012 9.
- מייד לאחר הדחת PBS, לתקן רקמות על ידי מרוסס עם paraformaldehyde 4% ב- PBS במשך 15-20 דקות בקצב זרימה של 8 מיליליטר / דקה.
- הסר מוח ומקום paraformaldehyde 4% למשך 24 שעות, ואחריו פתרונות סוכרוז מדורגים (15%, 30%, 30%, ברצף; הוכן בטריס שנאגרו מלוח) בשעה 4 מעלות צלזיוס. העבר את המוח לo פתרון סוכרוז הבאהnly אחרי המוח שקוע בכל פתרון. הערה: בדרך כלל, 5 ימים בכל פתרון הוא זמן מספיק לרקמה לשקוע.
- הקפאת רקמה וCryosectioning
- מניחים את המוח בהטבעה בינוני, כגון מתחם OCT ולצלול באיזופנטאן בטמפרטורה של -35 מעלות צלזיוס. לאפשר המוח להקפיא למינימום של 10 דקות, ולאחר מכן לאחסן ב -80 ° C. בעיות עלולים להתעורר אם בדיקה לטמפרטורה לא נלקחה; אנא ראה דיון למידע על פתרון בעיות.
- לחתוך קטעי עטרה סידוריים בעובי של 20 מיקרומטר וטמפרטורה של -20 ° C. לאסוף רקמה על גבי שקופיות טעונות חיובי. חלקים במוח עשויים להיות ממוקמים בתיבת שקופיות עטופות בנייר בתוך שקית עם רוכסן וטווח ארוך מאוחסן ב -80 ° C. שיטה זו של אחסון יוצרת גבול כפול כדי למנוע חשיפה לאוויר וכפור.
עיבוד 2. רקמות
הערה: r ציוד דוגמא וחומריםequired מכתים מוצג באיור 3. חלופות זמינות, לעומת זאת, תמונות אלה יסייעו אלה חדשים מכתים immunohistochemical לדמיין פריטים מתאימים לפני הרכישה.
איור 3: פריטים לדוגמא נדרשים למכתים immunohistochemical הקופסה השחורה שמוצגת ב() היא תא לחות אידיאלי לimmunofluorescence, כשקופיות מוגנות מפני אור ללא הצורך לעטוף את התיבה על נייר.. בעקבות חתך, ניתן לאחסן שקופיות בתיבה כגון התיבה הצהובה שמוצג (B). עטיפת הקופסה בחוזקה בנייר כסף ומניח בשקית עם רוכסן לפני המקפיא מסייעת להגן על דגימות רקמה מכוויות במקפיא. דוגמא של שקופיות ניתן ב( C), עם מנות שונות מכתימה מתוארות ב( ד) ו- (E ). Coverslips יכול להשתנות בגודל ובעובי (F), לעומת זאת 1.2 coverslips העבה לספק תוצאות הדמיה נחמדה ברוב המיקרוסקופים זקופים וconfocal. עיפרון כגון שמוצג ב( G) ניתן להשתמש בתווית שקופיות. יש להימנע סמנים קבע כדיו יכול לרוץ, המשפיעים על שני כתמים והיכולת לקבוע מה הוא המדגם. עט פאפ מיני כגון שמוצגים ב( H) מאפשר גבול דוחה להיגרר בשקופיות.
- הכנת שקופיות
- הסר שקופיות מהמקפיא ולהפשיר בטמפרטורת חדר.
- אופציונאלי: אם חלקים שרחפו בעבר משקופיות, שקופיות למקם מופשרים בתנור על 60 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ 4 שעות כדי למנוע קטעי רקמה מצף את שקופיות.
- שקופיות מקום במעמד שקופית ומנה מקבילה.
- לשטוף שקופיות שלוש פעמים PBS במשך 5 דקות כל אחד, שינוי פתרון בין שוטף. מהצעד הזה קדימה, להימנע מצורך sectiתוספות ללא נוזל לפרקי זמן ארוכים. הערה: אם חלקים להתייבש, מכתים רקע הוא גדל ולא יכול להיות מושגת באופן מהימן נתונים משמעותיים.
- הסר שקופיות מהמקפיא ולהפשיר בטמפרטורת חדר.
- מכתים רקמות
- בתיבה מכתימה אור חזק, ליצור "תא לחות" עם רקמות ונטולי מוך טבול במים ללא יונים.
- ייבש את הקצוות של השקופית עם רקמה ונטולת מוך, להשתמש בעט פאפ מיני להפוך גבול דוחה נוזלים בקצה מאוד של השקופית, מסעיפי רקמות. גבול זה צריך להבטיח שטח נרחב בין המניסקוס של הנוזל והקצה של רקמה, כך שמתח פנים אינו משפיעים על צביעה.
הערה: גבול דוחה עט פאפ יכול להיות מיושם לפני 2.1.3 אם הנוגדנים של עניין אינו דורשים אחזור אנטיגן מיקרוגל. אם עט פאפ כבר יושם עד לכביסה בPBS, השלמות של גבול נוזל דוחה חייבת להיבדק בשלב זה. השתמש בעט המיני-פאפ כדי למלא פערים בכל הגבול. - עם שקופיות הניחו אופקית, אנטיגן ספציפי בלוק הכריכה בדוגרי 4% בסרום V / V בPBS (פתרון בלוק). פיפטה 300 μl של פתרון לחסום לכל שקופית עבור 1 שעות בטמפרטורת חדר. ודא הפתרון לחסום משתרע על עט פאפ בקצה של השקופית ומכסה לחלוטין את הרקמה כדי למנוע הכתמה אחידה שנגרמה על ידי מתח ליד רקמת פני השטח.
- השתמש בסרום מאותו המין שבי נוגדנים משני נעשה. הערה: בהליך זה, נוגדנים משני נעשים בחמור, ובכך חמור בדם משמש. אם נוגדנים משני משניים או יותר מינים שונים משמשים, כולל סרום מכל מין.
- נוגדן ראשוני פיפטה על גבי שקופיות. הערה: ריכוזי נוגדן מכתים זה כבר מותאם ליום 1 ב: 5,000 ו 1: 500 לIba1 ופאן-עצבי, בהתאמה. ריכוזים אלה נמצאו להראות מכתים משמעותיים עם היעדר מכתים רקע.
- לדלל פתרון לחסום לסרום 1% ב- PBS ולהוסיף נוגדנים עיקריים. פיפטה 300 μl של פתרון נוגדן ראשוני בסרום 1% לכל שקופית. שוב, להבטיח את הנוזל הוא לקצה של עט פאפ. דגירה הלילה ב 4 מעלות צלזיוס.
- כולל שלוש שקופיות שליטה: אחד שמכיל נוגדנים לא Iba1 ולא פאן-עצביים, אחד עם Iba1 ללא נוגדנים פאן-עצביים, ואחד עם נוגדן פאן-עצבי ללא Iba1. כתם שקופיות אלה באותו הטווח עם אותו הפתרונות, אך להשמיט את הנוגדנים הראשוניים כדי לבדוק את הלא ספציפי מחייב של הנוגדנים משני.
- למחרת בבוקר, לשטוף שקופיות שלוש פעמים PBS במשך 5 דקות כל אחד, שינוי פתרון בין שוטף.
- נוגדני ניאון הם רגיש לאור, ולכן, מהצעד הזה קדימה, לצמצם את החשיפה לאור על ידי הבטחת מכולות לשטוף הם עטופים בנייר כסף ותיבות הכלאה הם או שחורים או מודגרות בחושך. פיפטה נוגדנים משני המתאימים בכל השקופיות ודגירה60 דקות בטמפרטורת חדר בריכוז של 1: 250 בפתרון בלוק (ראו שלב 2.2.3) ב" תא לחות "אור חזק (ראה שלב 2.2.1).
- השתמש נוגדנים משני של אורכי גל שונים. כאן, לארנב נוגדן הראשוני אנטי-Iba1, להשתמש ארנב אנטי חמור 594 כנוגדנים משני המתאימים. לעכבר נוגדן הראשוני אנטי-פאן-עצבי, להשתמש חמור אנטי עכבר 488 כשני הנוגדנים המתאימים. לחלופין, להשתמש נגד ארנב 488 ואנטי עכבר 594.
- לשטוף שקופיות שלוש פעמים PBS במשך 5 דקות כל אחד.
- אופציונאלי: לבצע מכתים גרעיני.
- מקום בHoechst (או כתם גרעיני אחר) בריכוז של 0.03 מיקרוגרם / מיליליטר בH מזוקק פעמיים 2 0 בדיוק 60 שניות.
- לשטוף שקופיות שלוש פעמים PBS במשך 5 דקות כל אחד.
- לשטוף בDDH 2 0.
- Coverslipping
- שקופיות coverslip עם הרכבה בינונית מימית, כגון פלואורידomount-G או ProlongGold. דואג להסיר את כל הבועות באמצעות מוליך כותנה שקצה.
הערה: ניתן להשתמש בסוכני הרכבה אחרים, גבוה עם זאת לדמם דרך בין הצבעים שצוין על ידי כמה בימים של coverslipping. - השתמש ברור לק כדי לאטום את הקצוות, מניעת החלקים מהתייבשות בשל התאדות. לאפשר לק להתייבש במכל אור חזק בעוד שקופיות להישאר שטוחות ובטמפרטורת חדר, ולאחר מכן לאחסן במכל אור חזק העטוף בנייר כסף על 4 מעלות צלזיוס.
- שקופיות coverslip עם הרכבה בינונית מימית, כגון פלואורידomount-G או ProlongGold. דואג להסיר את כל הבועות באמצעות מוליך כותנה שקצה.
3. הדמיה הרקמה הצבעונית
- מיקרוסקופית
- לאפשר לק להתייבש במשך שעה אחת לפחות לפני תחילת מיקרוסקופיה, שאמור להתקיים בחדר חשוך.
- לרכוש photomicrographs באמצעות confocal או מיקרוסקופ מחקר עם מקור אור ניאון וקובץ מצורף מצלמה דיגיטלית. שימוש בתוכנה הנלווית, להגדיר את החשיפה לכל אורך גל - 405, 488, ו -594 - בנפרד. הערה: במעמיק הוראות הדמיה צריכה להיות זמין באינטרנט מיצרן מיקרוסקופ.
- לרכוש photomicrographs בכל ערוץ מבלי להזיז את החלקים או התאמת המוקד. קח תמונות בצבע, או לחלופין בגוונים אפורים ולהמיר לצבע אחר.
הערה: צבע או תמונות בגווני אפור מכל ערוץ יכול להיות אסוף שבלאחר עיבוד. - ודא סעיפי רקמות שאינם חשופים לאור הסביבה או אור מיקרוסקופי לפרקי זמן ארוכים, כמו צילום הלבנת של החלקים תתרחש. כדי להימנע מכך, להגדיל את זמן חשיפה ולא עוצמת אור / לייזר הגדלת.
- אל תכבו את מקור אור הניאון בתוך 30 דקות של להיות מופעל.
הערה: החלפת המקור לסירוגין ברצף מהיר עלולה להפחית את תוחלת החיים של הנורה הניאון.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
תוצאות זה פרוטוקול מכתים בסעיפים רקמות מוח חולדה שכותרתו fluorescently מיקרוגלים בערוץ 594 (אדום) ותאי עצב שהכותרת בערוץ 488 (הירוק; ראו איור 4). אם כתם גרעיני נעשה, זה ייראה בערוץ 405 (הכחול). ניתן לצלם תמונות בערוצים שונים ומעולף להשוואה ישירה של שלושה ערוצים, או בין כל שני ערוצים. חבילות תוכנת רכישה דיגיטליות רבות כוללות פונקציונליות זו. פעמיים תיוג עם סמן Iba1 ופאן-עצבי המוצג כאן מדגים מיקרוגלים בעיקר מסועפים, עם תחזיות עצביות עדינות ארוכות ניכרו על פני שכבות ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
המטרה הכללית של תקשורת זו הייתה להציג נהלי אימונוהיסטוכימיה לקורא. לשם כך, את הדוגמא של דו-תיוג עם Iba1 ואנטיגנים פאן-עצביים להתבונן מיקרוגלים ונוירונים בparaformaldehyde perfused, שימש מוח החולדה cryoprotected, cryosectioned סוכרוז.
טכניקה זו יכולה להיות מותאמת לשרת מטרות אינסופיות. מערך של אנטיגנים שונים במגוון רחב של סוגי רקמות כגון, אך לא רק מוח, ריאות, כבד, כליות ומעיים יכול להיות דמיין immunohistochemically...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
המחברים רוצים להודות למר ריאן הארט ולמר אריז לוקאס על המשוב שלא יסולא בפז שלהם על תקשורת זו. עבודה זו נתמכה על ידי NIH NINDS R01 NS065052 וקרנות התמיכה במשימת בית החולים לילדים של פיניקס.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| פישרברנד סופרפרוסט פלוס כפתורי זכוכית | פישר סיינטיפיק | 22-034-979 | משמש להרכבת רקמות (1.2.2) |
| תנור | תרמו סיינטיפיק | 51028112 | משמש לייבוש רקמות (2.1.1) |
| מיני פאפ עט | Life Technologies | 00-8877 | משמש בשלב 2.2.2 |
| Andwin Scientific Tissue-tek Slide Staining Tool | Fisher Scientific | 22-149-429 | משמש לכל השטיפות במהלך הצביעה (2.2), כמו גם לשלב Hoechst (2.2.8) |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-A | משמש לייבוש שקופיות (2.2) |
| קופסת צביעה שחורה | טד פלה | 21050 | משמש לחסימה וצביעה של שלבים (2.2) |
| סרום חמור רגיל | פישר סיינטיפיק | 50-413-253 | משמש לחסימה ודגירה של נוגדנים (2.2) |
| עכבר ואלפא;-פאן-עצבי | Millipore | MAB2300 | משמש לנוגדנים ראשוניים (2.2.4) |
| ארנב ואלפא;-Iba1 | Wako Chemical | 019-19741 | משמש לנוגדנים ראשוניים (2.2.4) |
| חמור ואלפא;-ארנב 594 | Jackson ImmunoResearch | 711-585-152 | משמש לנוגדנים משניים (2.2.6) |
| חמור ואלפא;-עכבר 488 | Jackson ImmunoResearch | 715-545-150 | משמש לנוגדנים משניים (2.2.6) |
| רדיד קייטרינג | כל | N/A | משמש בשלבים 1.2.2 ו-2.3.2 |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | משמש להחלקת כיסוי (2.2.8) |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12544E | משמש להחלקת כיסוי (2.2.8) |
| לק שקוף | כל | N/A | המשמש להחלקת כיסוי (2.2.8) |
| Axio Observer.Z1 ו-LSM 710 (סריקת לייזר, קונפוקלית) | Carl Zeiss | N/A | משמש להדמיה (3) |
| Axioskop A2 | Carl Zeiss | N/A | משמש להדמיה (3) |
| CitriSolv | FisherScientific | לפרוטוקול DAB | |
| ABC Vector Laboratories | PK-6100 | לפרוטוקול DAB | |
| ערכת DAB Peroxidase Vector | Laboratories | SK-4100 | לפרוטוקול DAB |
| סוס ביוטיניל ואלפא;-ארנב IgG | Vector Laboratories | BA-1100 | לפרוטוקול DAB |
| סוס ביוטיניל ואלפא;-עכבר IgG | Vector Laboratories | BA-2001 | לפרוטוקול DAB |
| 30% מי חמצן | FisherScientific | H325-500 | לפרוטוקול DAB |
| מדפי שקופיות Wheaton וכלים מכתימים | TedPella | 21043 | לפרוטוקול DAB |
| משאבת זלוף Masterflex וצינורות | Cole-Parmer | משמש לזילוף (1.1.1 ו- 1.1.2) | |
| Andwin Scientific Tissue-tek CRYO-OCT compound (מקרה של 12) | פישר מדעי | 14-373-65 | משמש להקפאת רקמות (1.2.1) |
| מדחום (-50 עד 50 מעלות צלזיוס) | פישר סיינטיפיק | 15-059-228 | משמש להקפאת רקמות (1.2.1) |
| Cryostat | Leica | CM3500S | משמש לחיתוך רקמות (1.2.2) |
| צלחת מכתים, פלסטיק עם 2 מכסים | Grale Scientific | 353 | עבור אנטיגן rerival |
| 20 מתלה צביעה, שקופיות אופקי | Grale Scientific | 354 | עבור אנטיגן rerival |
| מיקרוגל | כל | N / A | עבור אנטיגן rerival |
מקורות
- Marrack, J. R. Chemistry of antigens and antibodies. Nature. 134, 468-469 (1934).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N., Berliner, E. The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fluorescent antibody. J Immunol. 45, 159-170 (1942).
- Marshall, J. M. Localization of adrenocorticotropic hormone by histochemical and immunochemical methods. The Journal of experimental medicine. 94, 21-30 (1951).
- Mellors, R. C. Histochemical demonstration of the in vivo localization of antibodies: antigenic components of the kidney and the pathogenesis of glomerulonephritis. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 3, 284-289 (1955).
- Nakane, P. K., Pierce, G. B. Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 14, 929-931 (1966).
- Avrameas, S., Uriel, J. Method of antigen and antibody labelling with enzymes and its immunodiffusion application. Comptes rendus hebdomadaires des seances de l'Academie des sciences. Serie D: Sciences naturelles. 262, 2543-2545 (1966).
- Cuello, A. C. Immunohistochemistry. , Wiley. (1983).
- Junqueira, L. C. U., Mescher, A. L. Junqueira's basic histology : text and atlas. , Thirteenth edition / edn, (2013).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
- Christensen, N. K., Winther, L. Education Guide: Immunohistochemical (IHC) staining methods. Kumar, G. L., Rudbeck, L. , DAKO North America. Carpinteria, California. 103-108 (2009).
- Wang, G., Achim, C. L., Hamilton, R. L., Wiley, C. A., Soontornniyomkij, V. Tyramide signal amplification method in multiple-label immunofluorescence confocal microscopy). Methods. 18, 459-464 (1999).
- Feldengut, S., Del Tredici, K., Braak, H. Paraffin sections of 70-100 mum: a novel technique and its benefits for studying the nervous system. Journal of neuroscience methods. 215, 241-244 (2013).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
