הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

Electroporation של effectors בקטריאלי פונקציונלי לתאי יונקים

9.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/52296

⸱

19 בינואר 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biological Sciences Division, Pacific Northwest National Laboratory, 2Environmental Molecular Science Laboratory, Pacific Northwest National Laboratory, 3Structural Proteomics Group, Ontario Center for Structural Proteomics, University of Toronto, 4Center for Bioproducts and Bioenergy, Washington State University

במאמר זה

סיכום

אלקטרופורציה שימשה להחדרת חלבוני אפקטור אלימות חיידקים מטוהרים ישירות לתאים אוקריוטיים חיים. לוקליזציה של חלבונים נוטרה על ידי מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית קונפוקלית. שיטה זו מאפשרת מחקרים על סחר, תפקוד ואינטראקציות חלבון-חלבון באמצעות חלבונים אקסוגניים פעילים, ומונעת את הצורך בביטוי הטרולוגי בתאים אוקריוטיים.

תקציר

המחקר של אינטראקציות חלבון בהקשר של תאי חיים יכול ליצור מידע קריטי על לוקליזציה, דינמיקה, ושותפים באינטראקציה. מידע זה הוא בעל ערך במיוחד בהקשר של אינטראקציות מארח הפתוגן. חלבוני הפתוגן רבים לתפקד בתוך תאי מארח במגוון רחב של דרך כגון, מה שמאפשר התחמקות ממערכת החיסון המארחת וההישרדות בסביבה תאית. ללמוד אינטראקציות מארח תאי הפתוגן-חלבון אלה, מספר גישות נמצאות בשימוש נפוץ, ובם: בזיהום vivo עם זן לבטא חלבון מתויג או מוטציה, או הקדמה של גני הפתוגן באמצעות transfection או התמרה. לכל אחת מהגישות הללו יש יתרונות וחסרונות. חפשנו אמצעי להציג ישירות חלבונים אקסוגניים לתאים. Electroporation משמשת בדרך כלל כדי להציג חומצות גרעין לתאים, אך הוחל חלבונים לעתים רחוקות יותר אם כי בסיס biophysical הוא בדיוק אותו הדבר.Electroporator סטנדרטי שימש להציג effectors חיידקי זיקה מתויגת לתאי יונקים. תאי אפיתל מקרופאג ועכבר אנושיים היו בתרבית בשיטות מסורתיות, מנותקים, והניחו בcuvettes electroporation פער 0.4 סנטימטר עם חלבון אקסוגני חיידקים פתוגנים של עניין (למשל סלמונלה Typhimurium GtgE). לאחר electroporation (0.3 קילו וולט) ותקופת החלמה (4 שעות) קצרה, חלבון תאיים אומת על ידי fluorescently תיוג החלבון באמצעות תג זיקתה ובחינת חלוקת מרחב ובזמן על ידי מיקרוסקופ confocal. חלבון electroporated הוצג גם להיות פונקציונלי בתוך התא ומסוגל סחר subcellular נכון ואינטראקציה בין חלבונים. בעוד החלבונים אקסוגניים נטו לצבור על פני השטח של התאים, היו לי דגימות electroporated עליות גדולות ביחסי ריכוז מפעיל תאיים לדגירה לבד. הפרוטוקול הוא פשוט ומהיר מספיק כדי להיעשות בapאופנת arallel, המאפשרת לאפיון תפוקה גבוה של חלבונים בתאי מארח הפתוגן כוללים מיקוד ותפקוד של חלבוני ארסיות subcellular.

מבוא

חיידקים גראם-שלילי רבים להעסיק מערכות הפרשה מיוחדות להזריק חלבונים הקשורים לאלימות (המכונים מפעילים) ישירות לתוך תאי מארח 1-5. יש לי effectors אלה מגוון רחב של תפקודים ביולוגיים כוללים: דיכוי חסינות מארח, שינויי cytoskeletal, שינוי של סחר תאיים ואיתות, שינויי תעתיק, ושינויי פרוטאזום מארח 6-9. הפונקציות של כמה effectors ידועות, עם זאת מטרות המארח ופעולה הביוכימית (ים) של רבים אחרים עדיין לא נקבעו. תוך השוואת wild-type וזיהומים חיידקיים רקומביננטי היא גישה תקפה ללמוד מנגנוני אלימות מפעיל תאיים, הוא לעתים קרובות יתרון להציג מפעיל בודד לתוך התא המארח. לפיכך, שיטות פשוטות להצגה ואפיון חלבוני מפעיל חיידקים בהקשר של תאי מארח רצויה מאוד.

פישוט wi הניתוח הניסיוניה מפעיל יחיד הוא קריטי כפי שאולי יש effectors אחרת פונקציות יריבה או מיותרות. כדי להשיג פישוט זה, חוקרים הציגו בעבר מקרו-מולקולות לתוך תאים על ידי שיטות רבות ושונות, כוללים התמרה ויראלית 10, microinjection 11, לגרד טעינת 12,13, איחוי תאים עם microinjection המושרה כימי 14, ריאגנטים חלבון קניינית "transfection" 15, משקעי סידן זרחה 16, וelectroporation 17-20. המולקולות הציגו נעות בין חומצות גרעין כוללים מיני DNA, RNA, וRNAi לחלבונים, צבעי תא-חדיר, ונוגדנים למטרות תאיות 21,22. יש כמה שיטות מגבלות כוללים הסוג של פולימר שיכול להיות מוצג, וניתוחים במורד הזרם מסוימים עשויים להיות מוגבלים בשל רעילות גבוהה סלולרית, מנגנונים מזיקים של פעולה, יעילות נמוכה, או יעילות מבוא. Transfection, often שימוש בשיטה לביטוי גנים של חיידקים בתאי יונקים, סובל גם המגבלה שכמה סוגי תאי מארח רלוונטיים, כגון מקרופאגים ותאים ראשוניים, הם עמידים במיוחד לקראת transfection. מעבר לכך, קשה לשלוט ברמות של חלבון חיידקים המיוצר על כניסתה של דנ"א זר.

יש הרבה עבודה שהוקמה electroporation של חומצות גרעין לשני תאי החיידקים ויונקים כטכניקת מעבדה משותפת; עם זאת, יש מחקר מתמשך לשיטות הטובות ביותר לאספקת חלבונים לתאים בתנאים פיסיולוגיים. דיווחים על transfection חלבון מבטיחים, אך דורשים חומרים כימיים ואופטימיזציה יקרים. הרצון להציג effectors חיידקים שעלולים להיות רעיל למגוון רחב של יעדי תא עם עלות מינימאלית הוביל אותנו לשקול electroporation כשיטה ללימוד חלבונים אלה in vivo.

electroporation החלבון 23-25 ​​הוא נפגשהוד להציג חלבונים לתאים חיים באמצעות electropermeabilization, הידוע גם באלקטרו-transfection או אלקטרו-הזרקת 26. טכניקה זו משתמשת פולסים חשמליים בעוצמה גבוהה כדי ליצור נקבוביות בקרום תא. נקבוביות הפיכים אלה מאפשרים מקרומולקולות כי הם בדרך כלל לא נכללו מהחלל תאית להיכנס לתא. לאחר ההסרה של השדה החשמלי החיצוני, הקרום יכול לחתום מחדש, המאפשר לתא כדי לשמור על מולקולות שעברו דרך הנקבוביות 27,28.

Electroporator סטנדרטי שימש במחקר זה כדי להציג באופן עקבי effectors חיידקים לשני תאים כמו מקרופאג-עכבר ותאי האפיתל אנושיים. השיטה היא מהירה, יעילה, ולא יקר, ללא ירידה משמעותית בכדאיות סלולרית. ניתן דמיינו חלבונים הציגו באמצעות מיקרוסקופיה immunofluorescence או משמשים למבחנים פונקציונליים. זה הודגם באמצעות חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) כסטנדרט שאינו רעיל, כמו גםשני חלבוני סלמונלה מפעיל, SspH1 וGtgE. אנו מציעים electroporation חלבון ככלי נוסף ברפרטואר לחקר חלבוני ארסיות חיידקים ואת תפקידיהם בתאי מארח אוקריוטים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. להכין מראש

  1. מי מלח חם פוספט סטרילי שנאגרו (PBS) עד 37 מעלות צלזיוס.
  2. השינוי של Dulbecco החם של נשרים בינוניים (DMEM) והמינימאלי חיוני בינוני (MEM) בתוספת סרום 10% שור עוברי (FBS), 100 IU / פניצילין מיליליטר, ו -100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין ל -37 מעלות צלזיוס. הערה: אלה מייצגים רגיל צמיחת מדיה (NGM) לתאי RAW והלה בהתאמה.

2. הכנת תאים

  1. לגדול 264.7 תאי RAW לconfluency 70-90% בNGM.
    1. שמור על תאים על 37 מעלות צלזיוס באוויר / 5% CO אווירת humidified 95% 2.
  2. לגדל תאי הלה לconfluency 70-90% בNGM.
    1. שמור על תאים על 37 מעלות צלזיוס באוויר / 5% CO אווירת humidified 95% 2.
  3. לפני האיסוף, לשטוף monolayer תא פעם אחת עם PBS סטרילי.
  4. איסוף תאים טרום-ומחוברות בצינור חרוטי סטרילי.
    1. בעדינות לגרד תאי RAWעם שוטר גומי בPBS, עם pipetting חזר לפיזור מצבורי תא.
    2. ניתוק תאי הלה עם 0.25% פתרון טריפסין עד בדיקה חזותית מציגה ניתוק ממשטח התרבות. לדוגמא, השתמש 2-3 מיליליטר לבקבוק T-75. להתאים את עוצמת קול בהתאם כדי להבטיח פתרון טריפסין מכסה שטח גידול כולו.
      1. להרוות את תגובת ניתוק עם NGM המכיל 10% FBS.
      2. השתמש לפחות פעמיים הנפח של NGM לטריפסין, עם pipetting חזר לפיזור מצבורי תא.
  5. קל גלולה תאים על ידי צנטריפוגה ב 900 XG למשך 4 דקות.
  6. Resuspend באותו נפח כפתרון טריפסין / להרוות באמצעות PBS סטרילי.
  7. ספירת תאים באמצעות hemocytometer או מונה חלקיקים.
  8. קל גלולה תאים על ידי צנטריפוגה ב 900 XG למשך 4 דקות.
  9. Resuspend בנפח מספק של PBS ל5.5 x 10 x 6 6.0 10 6 תאים / מיליליטר. הערה: לדוגמא, T-75 בקבוק אחד יניב approximately 7.5 x 10 6 תאים 29.
  10. שמור השעיה תא על קרח עד electroporation.

3. הכנה לElectroporation

  1. cuvettes טרום צמרמורת electroporation (פער של 0.4 סנטימטרים) על קרח.
  2. הפעל מנגנון electroporation ולהגדיר את המתח 0.3 וולט.
    הערה: קיבוליות והתנגדות לא היו הגדרות להתאמה על electroporator שלנו (על 10 μF ו -600 Ω על ידי היצרן).
  3. מלא צלחות התאוששות עם NGM ולאזן באווירת CO אוויר / 5% humidified 95% 2 ב 37 ° C.

4. Electroporation

  1. הנח 400 μl של השעיה תא קובט טרום צונן ולהוסיף 20 מיקרוגרם של חלבון שנבחר לקובט (50 מיקרוגרם / מיליליטר).
  2. קובט פליק בעדינות ~ 10 פעמים כדי לערבב ללא פגיעה בתאים. הערה: קובט גם יכול להיות הפוך מספר פעמים ולמערבב היטב, אבל לא pipet למעלה ולמטה או מערבולת כדי למנוע נזק לתאים.
  3. מחוץ יבש של קובט עם מגבת נייר או מגב אחר כדי למנוע קשתית חשמלי בelectroporator.
  4. מדגם electroporate על 0.3 קילו וולט עבור 1.5-1.7 msec. הערה: זה היה אופייני למחקר זה.
  5. מייד לאחר קובט הקפיצי electroporation בעדינות ~ 10 פעמים כדי לערבב ביסודיות.

5. ציפוי של תאים

  1. קובט חנות עם תאי electroporated על קרח עד מוכן למקום בצלחות התאוששות.
  2. עבור רוב הניתוחים במורד הזרם, לשטוף תאי 1X עם NGM מראש חימם כדי להסיר חלבון מפעיל זר.
    1. הסרת תאים לניתוח ולהשעות ב3-5 מיליליטר של NGM.
    2. גלולה תאים על ידי צנטריפוגה ב 900 XG למשך 4 דקות.
    3. Resuspend בנפח מספק של NGM לגודל רצוי צלחת (למשל 2 מיליליטר למנה 35 מ"מ).
  3. הסר כמות מתאימה של תאים לניתוח במורד הזרם.
    1. דוגמא 1: צלחת לתוך מנות תחתית כוס לניתוח מיקרוסקופי.
    2. דוגמא 2: int צלחתo פלסטיק תרבית תאים לניתוח חלבונים כגון purifications זיקה.
  4. לאפשר לתאים להתאושש בצלחות equilibrated באווירת CO אוויר / 5% -95% humidified 2 ב 37 מעלות צלזיוס במשך לפחות 4 שעות.

6. מיקרוסקופית ניתוח

6.1) קיבוע / Immunofluorescence מכתים

  1. לשטוף את תאי 1X עם PBS סטרילי לאחר תקופת החלמה 4 שעות.
  2. תקן תאים במתנול 100% עבור 2 דקות בטמפרטורת חדר. השתמש מספיק כדי לכסות את תאי מתנול (למשל 2 מיליליטר במשך 35 צלחת מ"מ) לחלוטין.
  3. 3x לשטוף עם PBS סטרילי.
  4. Permeabilize תאים עם 0.4% Triton X-100 ב PBS במשך 15 דקות. לדוגמא, השתמש 1 מיליליטר לצלחת בקוטר 35 מ"מ.
    1. התאם אורך של permeabilization וכוחו של טריטון X-100 על פי epitope ומיקום חלבון המטרה של. הערה: התוצאות הטובות ביותר צריכה להיקבע באופן אמפירי לכל יעד, אולם התנאים הנ"ל צריכים להיות מספיק עבור רוב גמטרות ytosolic.
  5. לחסום עם 5% הסרום אלבומין שור (BSA) בPBS עבור שעה 1 ב RT. לדוגמא, השתמש 1 מיליליטר לצלחת בקוטר 35 מ"מ.
  6. 3x לשטוף עם PBS.
  7. דגירה נוגדן ראשוני בפתרון מחייב נוגדנים (0.1% Triton X-100 ו 1% BSA PBS) הלילה ב 4   ° C עם נדנדה עדינה. לדוגמא, השתמש 0.5 מיליליטר לצלחת בקוטר 35 מ"מ.
    1. עקוב אחר המלצות יצרן לדילול נוגדן. הערה: לדוגמא, נוגדן תג פפטיד מחייב streptavidin (SBP-תג) שימש בשעה 1: 1,000 דילול, ואילו נוגדני PKN1 שימשו בשעה 1: 200 דילול.
  8. לשטוף 4x עם PBS.
  9. דגירה עם נוגדנים מתאימים fluorescently מצומדות משניים בפתרון מחייב נוגדן עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר, מוגן מפני אור.
    1. לדוגמא, השתמש Alexa 488 או 647 Alexa עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר.
      1. עקוב אחר המלצות יצרן לנמלהדילול ibody. (למשל על 1: 1,000 למחקר זה).
    2. להוסיף כתמים אחרים לפי צורך, למשל, agglutinnin נבט חיטה 5 מיקרומטר (WGA) מוצמד לAlexa 647 או DAPI בהתאם להמלצת יצרן, עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר.
  10. לשטוף 5x עם PBS ולאחסן ב 4 ° C, מוגן מפני אור עד מוכן לתמונה.

6.2) ניתוח תמונת Confocal מיקרוסקופית ו

  1. דגימות תמונה במיקרוסקופ confocal הפוכה באמצעות מטרת 63x טבילת שמן.
    1. ערוץ תמונה ירוק באמצעות השורה של 488nm לייזר ארגון, עם פליטת רוחב פס בין 492-542 ננומטר.
    2. ערוץ תמונה אדום באמצעות לייזר דיודה 633 ננומטר, עם פליטת רוחב פס בין 640-718 ננומטר.
    3. ערוץ תמונה כחול באמצעות לייזר דיודה 405 ננומטר, עם פליטת רוחב פס בין 407-453 ננומטר.
    4. ודא ערוץ מרובה Z- ערימות לכסות את מכלול הנפח הסלולרי.
  2. תמונות תהליך עם תוכנת עיבוד תמונה מתאימה.

טיהור 7. זיקה

  1. שטוף תאי electroporated פעמיים עם 4 ° C PBS לאחר תקופת החלמה 4 שעות.
  2. Lyse עם ~ 1.0 מיליליטר של חיץ תמוגה (1% Triton X-100 עם מעכבי פרוטאז קוקטייל ומעכב phosphatase בPBS) על קרח. השתמש במעכבים בהתאם להוראות יצרן. הערה: לדוגמא, שני מעכבי פרוטאז phosphatase ושמשו במחקר זה סופקו ב100x, אבל ניסוחים אחרים צריכים לעבוד באותה מידה.
  3. מייד לגרד תאים עם שוטר גומי ולאסוף לתוך צינורות חרוטי.
  4. Lyse ידי vortexing וsonication הנמרצים. הערה: שיטות תמוגה אחרות יכולות לעבוד באותה המידה גם, אבל יעילות תצטרך להיקבע באופן אמפירי לגבי ההתאמה של דרישות assay.
    1. Sonicate 3 x 30 שניות עם vortexing לסירוגין.
  5. צנטריפוגה ב10,000 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C כדי לאסוףפסולת סלולרית ואגרגטים מסיסים; להציל את supernatant.
  6. לשלב כמויות שווה (~ 1.0 מיליליטר) של lysate תא electroporated עם 50 μl של השעיה שרף agarose streptavidin על 4 מעלות צלזיוס לילה עם רוטציה הסוף-על-קצה. הערה: שרף זה לוכד את חלבון electroporated (ומתחמים כלולים) באמצעות תג זיקתה מחייב streptavidin פפטיד.
  7. צנטריפוגה ב 2500 XG למשך 2 דקות וזורקי supernatant.
  8. לשטוף פעמיים עם 40 כרכי מיטה (~ 1 מיליליטר) PBS.
  9. הוסף 30 μl חיץ טעינת 4x LDS (141 מ"מ טריס בסיס, 2% LDS, גליצרול 10%, 0.51 mM EDTA, 0.22 מ"מ Serva Blue G, פנול 0.175 מ"מ אדום, pH 8.5), 20 μl diH 2 O, ו1 μl של phosphine 0.5 M טריס (2-carboxyethyl) (TCEP), המאפשר לכמה נפח להישאר בחרוזים.
  10. חום על 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ומגניבים על קרח.
  11. ספין> 10,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  12. איסוף supernatant.
  13. לבצע כתם מערבי באמצעות נוגדנים מתאימים שימו לב: הואמחדש, משמש נוגדן ראשוני אנטי-PKN1.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כהוכחה ראשונית של מושג, חלבון פלואורסצנטי ירוק מטוהר הוצג בהצלחה בתאים יונקים באמצעות electroporation. GFP, 27 KD משוער חלבון משקל מולקולרי הוא הציג בדרך כלל לתאי יונקים (בדרך כלל באו לידי ביטוי מפלסמיד דנ"א) ככלי ביולוגיה מולקולרי ללא רעילות תאית משמעותית. תאי הלה הודגרו (איור 1 א) או electroporated (איור 1) עם GFP / מיליליטר 25 מיקרוגרם, ואחריו מיקרוסקופיה confocal immunofluorescence כדי לבדוק אות ה- GFP ניאון. על מנת להוכיח כי GFP היה בתוך...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

effectors מופרש מחיידקים פתוגניים התפתחה כדי לתפקד בסביבת התא המארח, ולכן כדאי ללמוד אותם באתרו בתוך הפונדקאי. מבוא של effectors הספציפי של עניין לתאי מארח מאפשר אינטראקציות הפתוגן-המארח הרלוונטי כדי להיחקר בבידוד ללא הפרעות מחלבונים חיידק אחרים. המטרה הייתה לחקור electroporation כאמצעי להציג חלבוני מפעיל חיידקים לתאי מארח אוקריוטים, וכך להימנע מכמה מהאתגרים הקשורים transfection או התמרה. חלבון פלואורסצנטי ירוק שימש כביקורת וחלבוני מפעיל סלמונלה נבדקו. בגלל העניי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

יש לי המחברים אין לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי NIGMS, המכונים הלאומיים לבריאות (GM094623). חלקים משמעותיים מעבודה זו בוצעו במעבדה למדעים מולקולריים סביבתיים, מתקן משתמש מדעי לאומי של DOE/BER הממוקם במעבדה הלאומית של צפון מערב האוקיינוס השקט (PNNL). PNNL מופעל עבור ה-DOE על ידי Battelle תחת חוזה DE-AC05-76RLO1830.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.25% תמיסת טריפסין-EDTACellgro25-050-Cl
0.4 ס"מ קוביות אלקטרופורציה חד פעמיותבפער Bio-Rad165-2088
100% מתנולכלאלבומיןסרום בקר דליק ורעיל
(BSA)Sigma-AldrichA4919
מנגנון ספירת תאים - המוציטומטר או קולטר מונהבקמן קולטרדגם Z1
חממת תרבית תאיםכלN/Aלח 95% אוויר/5% CO<תת>2 אטמוספירה ב-37 מעלות; C 
תרבית תאים פלסטיקכלN/Aצלוחיות / צלחות, פיפטות, צינורות, שוטר הגומי
Dulbecco Modified of Eagle' s בינוני (DMEM)Cellgro10-013חם עד 37 מעלות; C 
ElectroporatorBio-RadE. coli Pulser
סרום בקר עוברי (FBS)Cellgro35-016-CV
מיקרוסקופ קונפוקלי פלואורסצנטי דגם זיס  LSM 710 
כלים תחתונים מזכוכית למיקרוסקופיהWilco WellsHBSt-3522
HALT מעכב פרוטאז קוקטיילפירס78430מאכל ורעיל
ATCCATCC CCL-2
LDS 4X מאגר טעינהInvitrogenNP0007
בינוני חיוני מינימלי (MEM) Cellgro10-010חם ל-37 מעלות; C 
כתמים פלואורסצנטיים אחרים (WGA, DAPI) בשילוב עם מגיב נגד דהייהכלN/A
פניצילין/סטרפטומיציןCellgro30-002-Cl
RAW 264.7 קו תאיםATCCTIB-71
נוגדן ראשוני כנגד יעד הענייןכלנוגדן
מצומד לפלואורופורכלN/A
פוספט חוצץ מלחכלN/Aצינון עד 4 & מעלות; C 
פוספט סטרילי חוצץ מי מלחכלN/Aחם עד 37 מעלות; C 
[header]
מתלה שרף סטרפטווידין אגרוז פירס20353
צנטריפוגה שולחנית המסוגלת לקבל צינורות חרוטיים (עדיף דלי מתנדנדכלN/A
TCEPSIGMA-ALDRICH646547מאכל, רעיל
טריטון X-100סיגמא-אולדריץ'T8585מגרה
קו תאי HeLa , משני N/A )

מקורות

  1. Mota, L. J., Cornelis, G. R. The bacterial injection kit: type III secretion systems. Annals of Medicine. 37, 234-249 (2005).
  2. Galan, J. E., Collmer, A. Type III secretion machines: bacterial devices for protein delivery into host cells. Science. 284, 1322-1328 (1999).
  3. Hueck, C. J. Type III protein secretion systems in bacterial pathogens of animals and plants. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 62, 379-433 (1998).
  4. Cornelis, G. R., Van Gijsegem, F. Assembly and function of type III secretory systems. Annual Review of Microbiology. 54, 735-774 (2000).
  5. He, S. Y. Type III protein secretion systems in plant and animal pathogenic bacteria. Annual Review of Phytopathology. 36, 363-392 (1998).
  6. Dean, P. Functional domains and motifs of bacterial type III effector proteins and their roles in infection. FEMS Microbiology Reviews. 35, 1100-1125 (2011).
  7. Espinosa, A., Alfano, J. R. Disabling surveillance: bacterial type III secretion system effectors that suppress innate immunity. Cellular Microbiology. 6, 1027-1040 (2004).
  8. Orchard, R. C., Alto, N. M. Mimicking GEFs: a common theme for bacterial pathogens. Cellular Microbiology. 14, 10-18 (2012).
  9. Galan, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host Microbe. 5, 571-579 (2009).
  10. Ellis, B. L., et al. A survey of ex vivo/in vitro transduction efficiency of mammalian primary cells and cell lines with Nine natural adeno-associated virus (AAV1-9) and one engineered adeno-associated virus serotype. Virology Journal. 10, 74(2013).
  11. Sreelatha, A., et al. Vibrio effector protein, VopQ, forms a lysosomal gated channel that disrupts host ion homeostasis and autophagic flux. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 11559-11564 (2013).
  12. McNeil, P. L., Murphy, R. F., Lanni, F., Taylor, D. L. A method for incorporating macromolecules into adherent cells. The Journal of Cell Biology. 98, 1556-1564 (1984).
  13. Lafon, M., Lafage, M. Antiviral activity of monoclonal antibodies specific for the internal proteins N and NS of rabies virus. The Journal of General Virology. 68 (Pt. 12), 3113-3123 (1987).
  14. Kriegler, M. P., Livingston, D. M. Chemically facilitated microinjection of proteins into intact monolayers of tissue culture cells). Somatic Cell Genetics. 3, 603-610 (1977).
  15. Nossa, C. W., et al. Activation of the abundant nuclear factor poly(ADP-ribose) polymerase-1 by Helicobacter pylori. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19998-20003 (2009).
  16. Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. Transfecting mammalian cells: Optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation. Nucleic Acids Research. 24, 596-601 (1996).
  17. Winegar, R. A., Phillips, J. W., Youngblom, J. H., Morgan, W. F. Cell Electroporation Is a Highly Efficient Method for Introducing Restriction Endonucleases into Cells. Mutation Research. 225, 49-53 (1989).
  18. Cortes, F., Ortiz, T. Chromosome damage induced by restriction endonucleases recognizing thymine-rich DNA sequences in electroporated CHO cells. International Journal of Radiation Biology. 61, 323-328 (1992).
  19. Cortes, F., Ortiz, T. Induction of chromosomal aberrations in the CHO mutant EM9 and its parental line AA8 by EcoRI restriction endonuclease: electroporation experiments. Mutation Research. 246, 221-226 (1991).
  20. Baron, S., Poast, J., Rizzo, D., McFarland, E., Kieff, E. Electroporation of antibodies, DNA, and other macromolecules into cells: a highly efficient method. Journal of Immunological Methods. 242, 115-126 (2000).
  21. Lewis, R. Electroporation edges toward clinic for both gene therapy and drug delivery. Genetic Engineering and Biotechnology News. 17, (1997).
  22. Kotzamanis, G., et al. CFTR expression from a BAC carrying the complete human gene and associated regulatory elements. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13, 2938-2948 (2009).
  23. Chakrabarti, R., Wylie, D. E., Schuster, S. M. Transfer of monoclonal antibodies into mammalian cells by electroporation. The Journal of Biological Chemistry. 264, 15494-15500 (1989).
  24. Graziadei, L., Burfeind, P., Bar-Sagi, D. Introduction of unlabeled proteins into living cells by electroporation and isolation of viable protein-loaded cells using dextran-fluorescein isothiocyanate as a marker for protein uptake. Analytical Biochemistry. 194, 198-203 (1991).
  25. Wilson, A. K., Horwitz, J., De Lanerolle, P. Evaluation of the electroinjection method for introducing proteins into living cells. The American Journal of Physiology. 260, C355-C363 (1991).
  26. Prasanna, G. L., Panda, T. Electroporation: Basic principles, practical considerations and applications in molecular biology. Bioprocess Engineering. 16, 261-264 (1997).
  27. Weaver, J. C., Chizmadzhev, Y. A. Theory of electroporation: A review. Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 41, 135-160 (1996).
  28. Weaver, J. C. Electroporation theory. Concepts and mechanisms. Methods in Molecular Biology. 55, 3-28 (1995).
  29. McAteer, J. A., Douglas, W. H. Monolayer culture techniques. Methods in Enzymology. 58, 132-140 (1979).
  30. Ho, T. D., et al. Identification of GtgE, a novel virulence factor encoded on the Gifsy-2 bacteriophage of Salmonella enterica serovar Typhimurium. Journal of Bacteriology. 184, 5234-5239 (2002).
  31. Niemann, G. S., et al. Discovery of novel secreted virulence factors from Salmonella enterica serovar Typhimurium by proteomic analysis of culture supernatants. Infection and Immunity. 79, 33-43 (2011).
  32. Spano, S., Liu, X., Galan, J. E. Proteolytic targeting of Rab29 by an effector protein distinguishes the intracellular compartments of human-adapted and broad-host Salmonella. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 18418-18423 (2011).
  33. Haraga, A., Miller, S. I. A Salmonella type III secretion effector interacts with the mammalian serine/threonine protein kinase PKN1. Cellular Microbiology. 8, 837-846 (2006).
  34. Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O., et al. Quantitative colocalization analysis of confocal fluorescence microscopy images. Current Protocols in Cell Biology / Editorial Board, Juan S. Bonifacino ... [et al]. 4 (Unit 4.19), (2011).
  35. Kimple, M. E., Sondek, J., et al. Overview of affinity tags for protein purification. Current Protocols in Protein Science / Editorial Board, John E. Coligan ... [et al]. 9 (Unit 9.9), (2004).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מבוא לחלבוניםמיקרוסקופיה קונפוקליתWestern Blotאינטראקציות מאחס-פתוגןלוקליזציה תת-תאיתאינטראקציה בין חלבוניםסריקה בספיקת תפוקה גבוהה
Electroporation של effectors בקטריאלי פונקציונלי לתאי יונקים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.