מאמר שיטה

בידוד והנצחה של שורות תאים שמקורם בחולה מביופסיה של שריר למחל דוגמנות

DOI:

10.3791/52307

⸱

18 בינואר 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, UT Southwestern Medical Center, 2National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institute of Health, 3Division of Pediatric Pathology, Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical College of Wisconsin, 4Division of Genetics and Genomics, Boston Children's Hospital

במאמר זה

הודעת תיקון

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר טכניקות לבידוד תאים חיים ותרבית ראשונית של קווי תאים מיוגניים ופיברובלסטים מרקמת שריר או עור. מתוארת גם טכניקה לאמורטליזציה של קווי תאים אלה. בסך הכל, פרוטוקולים אלה מספקים כלי אמין ליצירה ושימור של תאים שמקורם בחולה עבור יישומים במורד הזרם.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יצירת קווי תאים ספציפיים לחולה מייצגת כלי רב ערך למחקר אבחוני או תרגומי, וניתן לאסוף תאים אלה מרקמת ביופסיה של העור או השריר הזמינה במהלך עבודת האבחון של המטופל. בפרוטוקול זה, אנו מתארים טכניקה לבידוד תאים חיים מכמויות קטנות של רקמת שריר או עור לתרבית תאים ראשונית. בנוסף, אנו מספקים טכניקה לאימורטליזציה של קווי תאים מיוגניים וקווי תאים פיברובלסטים מתאים ראשוניים. ברגע שקווי התאים עוברים אימורטליזציה, ניתן להשיג הרחבה משמעותית של תאים שמקורם בחולה. תאים אימורטליים ניתנים ליישומים רבים במורד הזרם, כולל בדיקת תרופות ותיקון מבחנה של המוטציה הגנטית. בסך הכל, פרוטוקולים אלה מספקים כלי אמין ליצירה ושימור של תאים שמקורם בחולה עבור יישומים במורד הזרם.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

האבחון המולקולרי התפתח באופן דרמטי ב-20 השנים האחרונות. דנ"א גנומי מבודד כיום באופן שגרתי מליחה או ספוגית לחיים, בעוד שבעבר הוא דרש לקיחת דם. עם זמן האספקה המהיר הנוכחי והקלות של ריצוף הגנים, מוטציות רבות במחלה מזוהות באופן שגרתי ללא צורך בבדיקות נוספות. במקרה של אבחון מחלות שרירים, זיהוי של עשרות גנים חדשים בעשור האחרון האחראים לניוון שרירים או מיופתיה שינה באופן דרמטי את דרכי האבחון של מחלות אלה 1,2. נכון לעכשיו, ישנם עשרות גנים שזוהו כגורמים לניוון שרירים ומיופתיה מולדת, אם כי המנגנונים שבאמצעותם רבים מהגנים הללו מייצרים מחלות נותרו לא ברורים. בפרט, מחלות נדירות מהוות אתגר בשל גודלה הקטן של אוכלוסיית החולים. במקרים אלה, כמו גם למחלות נפוצות יותר, רצוי מאוד ליצור כלים יציבים המאפשרים מחקרים על מנגנון הפתוגנזה והקרנת תרופות טיפוליות.

למרות ההתקדמות הדרמטית באבחון ה-DNA, ביופסיות שריר עדיין מבוצעות כדי לבסס את האבחנה הראשונית בחולים רבים בהם יש חשד למחלת חילוף חומרים או שרירים ראשונית. כאשר יש צורך בביופסיית שריר, היא מציעה הזדמנות לאיסוף רקמות אבחון ומחקר נוסף עם סיכון תחלואה נוסף מינימלי עבור המטופל. מכיוון שישנם מספר שימושים לכל דגימת רקמה, רצוי מאוד לבסס טכניקות לתרבית תאים ראשונית באמצעות רקמה כירורגית שהן פשוטות, יעילות ודורשות כמויות מינימליות של רקמה. נדרש טריאז' נכון של ביופסיות שריר או עור כדי למקסם את בידוד התאים הראשוניים מהרקמה ואחסון ארוך טווח של חומר חי. בנוסף, מחקר תאי גזע וסינון תרופות טומן בחובו הבטחה גדולה לפיתוח טיפולים למחלות רבות באמצעות מבחנים מבוססי תאים 3,4.

אנו מתארים כאן שיטות לבידוד תאים ראשוניים מביופסיות שריר או עור אנושיות. בנוסף, אנו כוללים פרוטוקול לאימורטליזציה של תאים מיוגניים, שהוא שימושי ליצירת מספר גדול של תאים מאדם. ניתן להשתמש בתאים אלה ליישומים במורד הזרם, כגון בדיקות תרופות מותאמות אישית, שאחרת אינן ניתנות להשגה עם המספר הנמוך הכולל של תאים המתקבלים מרקמה ראשונית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: פרוטוקולים לאוסף של רקמות אדם צריכים להיות נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית IRB. אוסף של רקמה אנושית שהושלכה, מזוהה de אושר על ידי בית החולים לילדים בבוסטון וועדות IRB Brigham and בית החולים לנשים. השיטות שתוארו להלן יושמו בבידוד של תאי myogenic מדה-מזוהה, שהושלך רקמה. השיטות שתוארו חלות על רקמה שנאספו מחומר מטופל הסכים.

1. בידוד תא

  1. ניתוק של ביופסיה של שריר וטיהור של תאי myogenic
    1. טרום לשקול צלחת תרבית רקמת 10 סנטימטרים במנדף בטיחות ביולוגי בתרבית רקמה, ולאחר מכן לשקול מחדש את הצלחת המכילה את הביופסיה של השריר כדי לחשב את כמות הרקמה שניתק.
    2. באמצעות אזמלים סטריליים, רקמת שריר בשר טחון דק ולהוסיף כמה טיפות של סטרילית 1x HBSS כדי למנוע רקמות מהתייבשות.
    3. להוסיף 3.5 מיליליטר כל אחת מdispase השני וcollagenase D לגרם של רקמת שריר להתעכל. פיפטה רקמות טחונות ופתרון אנזים באמצעות פיפטה 25 מיליליטר סטרילי כמה פעמים. דגירה את הצלחת בתרבית רקמת חממה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 במשך 15 דקות ולעכל רקמה עד slurry עובר בקלות אם כי טפטפת מיליליטר סטרילי 5.
      הערה: ניתוק רקמות מושגים בדרך כלל על ידי עיכול אנזימטי בתוך 45-90 דקות. עיין בסעיף 'נציגי התוצאות "לפרטים נוספים.
    4. הוסף 2 כרכים של מדיום גידול סטריליים לרקמה ניתק, מסנן דרך מסננת 100 מיקרומטר תא מעל 50 מיליליטר תאי צינור וגלול חרוטי במשך 10 דקות ב 329 XG (~ 1,100 סל"ד), בטמפרטורת חדר. אנא עיין בטבלת חומרים להרכב תקשורת.
    5. Resuspend גלולה בנפח של 1 מדיום גידול סטרילי ולהוסיף 7 כרכים פתרון תמוגה תא דם אדום. סנן את הפתרון דרך מסננת תא 40 מיקרומטר, אז גלולה tהוא תאים במשך 10 דקות ב 329 XG, בטמפרטורת חדר.
    6. ספירת התאים בhemocytometer וresuspend תאי BSA 0.5% 1x HBSS בריכוז של 1 x 10 6 תאים / μl 100. מניח בצד ~ 250,000 תאים בצינור אחד שישמשו כשלילית שליטה (בלא כתם). הגדר צינורות צד נוספים חד-צבע מוכתם שליטה ליודיד propidium ולCD56, הנדרשים לgating התקין של תאים חיוביים CD56 על ידי מיון FACS. אנא עיין בתא מדריכים למיון או להתייעץ עם FACS מיון מומחי מתקן ליבה כדי להבטיח בקרה נאותה כלולים.
    7. כתם התאים להיות מסודרים עם 5μl / 10 6 תאים של נוגדן אנטי CD56. דגירה כל הדגימות (כולל בקרות) על קרח למשך 30 דקות.
    8. לשטוף דגימות ב 10 מיליליטר 1x HBSS ותאים גלולה במשך 10 דקות ב 329 XG (~ 1,100 סל"ד) בצנטריפוגה בקירור, 4 ° C טמפרטורה.
    9. להוסיף יודיד propidium בריכוז סופי של 1μg / מיליליטר המדגם להיות sorטד להרחקה של תאים מתים. לטהר תאים חיוביים myogenic CD56 מהתאים שאינם myogenic באמצעות סדרן תא הקרינה הופעלה.
  2. ניתוק של ביופסיה של עור
    יכול להיות מבודד fibroblasts Dermal מאגרוף עור מחולים כאשר ביופסיות שריר אינן זמינות: הערה. fibroblasts עורי יכול לשמש כחומר ביולוגי למחקרים רבים, כוללים התמרה עם Myod לייצר תאי myogenic. בנוסף, ניתן להשתמש fibroblasts עורי ליצירת תאי iPS, אשר יכול להיות מובחן לסוגי תאים שונים למחקר נוסף.
    1. להעביר את הביופסיה של העור למעבדה במדיום תחבורה. לאחר המדגם הוא קיבל, לבצע את התרבות העיקרית בהקדם האפשרי. אם התרבות העיקרית לא ניתן לקבוע באותו היום, לאחסן המדגם בטמפרטורת חדר למשך לילה.
    2. העבר את הביופסיה של העור לצלחת פטרי 35 מ"מ סטרילי בזרימה למינרית.
    3. יש לשטוף את הביופסיה של העור בצלחת פטרי עם 1 סטריליx PBS להסיר דם ופסולת. הסר את רקמת השומן עם אזמל סטרילי.
    4. הוסף פתרון collagenase 2 מ"ל ולקצץ את הרקמה עם אזמל, לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות לשעה 1, תלוי בגודל של הרקמה.
    5. העברת הרקמה מתעכל לצינור חרוטי 15 מיליליטר, לשטוף את צלחת פטרי עם 2 מיליליטר של מדיום תרבות פיברובלסטים פעמיים, ולאסוף את המדיום באותו הצינור.
    6. גלולה תאים ב XG 200 במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
    7. בטל supernatant ולשטוף את הכדור עם 3 מיליליטר של מדיום פיברובלסטים להסיר collagenase, אז תאי גלולה שוב. אנא עיין בטבלת חומרים להרכב תקשורת.
    8. חזור על השלב 1.2.7 עוד פעם אחת.
    9. להשעות מחדש גלולה בתאים בינוניים פיברובלסטים וצלחת 5 מיליליטר על בקבוק תרבות רקמת T25 סטרילי. דגירה הבקבוק ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.
    10. להעריך את התרבות לקובץ מצורף פיברובלסטים וצמיחה מעל 1-3 הימים הקרובים.
      הערה: חלק פיסות רקמה קטנה עשויות גם לצרף הצלחת וfibroblasts להעביר את חתיכות רקמה אלה.
    11. לשמור על התרבות באותם תנאים עד fibroblasts גדלים למפגש כ -80%.
    12. לאסוף fibroblasts ידי trypsinization ולהעביר על גבי צלוחיות תרבות טריות להרחבה נוספת. בצע trypsinization ידי שטיפת התרבויות 3 פעמים ב1x PBS ללא Ca ++ Mg ++. להוסיף טריפסין-EDTA (ראו לוח חומרים) לתאים (2ml / בקבוק T25) למשך 2 דקות על 37 מעלות צלזיוס.
    13. פיצול תאים מנותקים לתוך צלוחיות נוספות. אם כמה חתיכות רקמה נשארות צמודות לצלוחיות T25 המקוריות, להוסיף 5 מיליליטר מדיום תרבות הטרי לבקבוק זה ועוד fibroblasts יעבור את הרף.
      הערה: תרבות פיברובלסטים המורחבת אפשר להקפיא למטה כמו P1 ומאוחסנות בחנקן נוזלי לניסויים עתידיים.

2. הנצחה של תאי myogenic

  1. פלייט תאי 5 מיליון הפניקס Ecotropic אריזה (PE) לילה בצלחת תרבית רקמת 10 סנטימטרים סטרילי בDMEM ובינוני 199 על יחס של 4: 1, בתוספת 10% עגל בסרום.
  2. תאי Feed 30 דקות לפני transfection עם 5 מיליליטר של תקשורת טרי בתוספת קפאין 10 מ"מ.
  3. Homogenize תערובת של 2 מיקרוגרם של ה- DNA פלסמיד מהכנת midi (פלסמיד cdk4 או hTERT) וPolyjet ודגירה בטמפרטורת חדר במשך 15 דקות, כפי שהומלץ על ידי היצרן.
  4. מוסיף את תערובת פלסמיד / Polyjet לתאי PE הלילה.
  5. תאים להאכיל עם מדיום חדש (DMEM ובינוני 199 על יחס של 4: 1, בתוספת 10% עגל בסרום). שתים עשרה שעות מאוחר יותר, לאסוף את supernatant המכיל וירוסים ולסנן אותה דרך מסנן גודל 0.45 מיקרומטר נקבובית.
  6. השתמש 1 מיליליטר של supernatant נאסף להדביק לילה PA317 קו תא אריזת amphotropic 5 ולקבל שורת תאים לייצר וירוס יציב לאחר בחירה עם או 0.5 מ"ג / מיליליטר נאומיצין (G418) לcdk4 או 0.5 מ"ג / מיליליטר hygromycin לhTERT.
  7. הכן עובד supernatants ויראלי על ידי גידול תאי אריזה היציב לconfluency הקרוב, ולאחר מכן קציר supernatant בכל בוקר, ערב ובוקר לשלושה יבולים.
  8. סנן את supernatants ויראלי ובמישרין או להשתמש לחלק אותם ל1 aliquots מיליליטר ולאחסן ב -80 ° C לשימוש מאוחר יותר. שים לב שsupernatant ויראלי מאבד 50% יעילות הדבקה בכל להקפיא להפשיר. זכור כדי להלבין שטיפה לפני השלכת כל מה שנגע בחלקיקים הנגיפיים.
    הערה: שורת התאים-ייצור וירוס PA317 היציבה יכולה להיות קפוא ונשמרה ב-150 מעלות צלזיוס במשך אחסון קבוע (הקפאה בינונית היא DMSO 10%; סרום 90%).
  9. מטוהר FACS צלחת תאי myogenic (מתואר בצעדים 1.1-1.9) בצפיפות של 5 x 10 4 תאים / גם ב6-גם צלחות מצופות ג'לטין 0.1%. ודא כי תאים המחוברים לצלחת לפני שימשיכו עם זיהום ויראלי.
  10. להוסיף 400 μl מסונן, freshly מיוצר supernatant הנגיפי או aliquots הקפוא לכל צלחת שש היטב לילה (לשמור 2 בארות כפקדים).
  11. שנה בינונית על ידי האכלת תאים עם 2.5 מיליליטר / גם של תקשורת טרי שריר (4: 1 בינוני הנשר (DMEM) שונה Dulbecco ובינוני 199 בתוספת 15% בסרום שור עוברי; 0.02 M HEPES חיץ; ויטמין 1.4 מ"ג / L B12; 0.03 מ"ג / L ZnSO4, dexamethasone 0.055 מ"ג / L, גורם גדילת hepatocyte / l 2.5 מיקרוגרם וגורם גדילת 10 מיקרוגרם / L פיברובלסטים בסיסיים). מחק את התקשורת וטפטפות המכילה חלקיקים הנגיפיים במכל אקונומיקה. לצאת מתאים באותו בינוני במשך 3 ימים להתאושש מזיהום, אז להתייחס לבחירה או באמצעות 400 מיקרוגרם / מיליליטר נאומיצין (זיהום cdk4) או 300 מיקרוגרם / מיליליטר hygromycin (זיהום hTERT).
  12. שמור על תאים תחת בחירת תרופה עד שהתאים במנה למות שליטה (1-2 שבועות).
  13. תאי מעבר לפני שהן הופכות מחוברות (confluency 60-80%; באמצעות 0.05% טריפסין EDTA), גם בselectiבתקופה. תאי Replate במנות 10 ס"מ מרובים עם מדיום myoblast טרי (כמתואר ב2.11) בתוספת תרופת הבחירה. לשמור הנציחו תאים שנבחרו כאוכלוסייה הטרוגנית או לשכפל להשיג רקע הומוגנית לחלוטין גנטי (אותו החדרת transgene בכל תא).
  14. לבצע בחירה משובט באמצעות השלבים הבאים:
    1. זרעי התאים בצפיפות נמוכה (למשל 300 עד 500 תאים 10 מנות סנטימטר) ולשמור אותם במשך כשבועיים, עד מושבות קטנות נוצרות (10-20 תאים).
    2. הסר ביותר של המדיום בשלב זה, ומשאיר רק סרט דק כדי למנוע את התאים מהתייבשות.
    3. מניחים טבעת שיבוט (עם קצה אחד טבול בשומן ואקום סיליקון) על כל שיבוט רצוי ולהוסיף כמה טיפות של טריפסין / EDTA.
    4. קציר תאים ברגע שהם הופכים מעוגלים ידי aspirating בזהירות את התאים באמצעות קצה מיליליטר 1 או pipet פסטר והעביר לPLA multiwell הכי הקטןte (96 או 48, 24 או 12 צלחות גם).
    5. להרחיב שיבוטים לפי צורך כדי למנוע confluency המקומי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 1 מדגים כמה מהשלבים העיקריים המעורבים בניתוק הרקמה העיקרי: כמות הרקמה המדויקת נשקלה בצלחת פטרי תרבית רקמה סטריליים (איור 1 א ', ב'). הרקמה אז דק טחון באמצעות אזמלים סטריליים, עד slurry רקמה מתקבל (איור 1 ג, ד). בעקבות תוספת של אנזימי העיכול, ניתוק רקמת שריר העיקרי מושגים בדרך כלל על ידי עיכול אנזימטי בתוך 45-90 דקות. ההתקדמות של מערכת עיכול רקמה מנוטרת בדרך כלל כל 15-20 דק 'על מנת למנוע overdigestion ומוות של תאים. עיכול אנזי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאים כמשאב שימושי

הבידוד והתרבות של אוכלוסיות תאי myogenic הוא מאוד שימושי כאשר הקמת פנוטיפים מחלה או במודלים חוץ גופית של מחלה. הליך בידוד תא myogenic המתואר כאן מאפשר הבידוד של myoblasts ופיברובלסטים מדגימות שרירי שלד, אז מה שיכול להיות מופצת, הבדיל, או מייד ניתחו. מבנה ותפקוד Myoblast ניתן להעריך באמצעות בדיקה מיקרוסקופית, הערכה של הישרדות תא, הערכה של איחוי תאים, או באמצעות מחקרים מולקולריים של RNA א...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרסום זה ממומן באמצעות Cure CMD, מענק של Association Contre Les Myopathies (פרויקט 16297), ועל ידי המכונים הלאומיים לבריאות (מספרי מענק K08 AR059750, L40 AR057721 ו-2R01NS047727).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
רקמות ציוד
  קולט אדים לבטיחות ביולוגית תרבותחברת בייקר, בע"מדגם SterilGuard
, כגון Beckman Model בקמן קולטרדגם אלגרה 6Rאם מתבצע מיון תאים, עדיף צנטריפוגה עם קירור
מיקרוסקופNikonModel Eclipse TS100
חממת תרבית רקמות, המחוברת למקור CO2Forma Scientific סדרה II
ממיין תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS)בקטון דיקינסוןמודל אריה
ריאגנטים לבידוד מיובלסטים ראשוניים מרקמה
Dispase IIRoche Applied Science#04942078001הכינו תמיסת גרב של 2.4U/ml ב-DMEM
Collagenase D Roche Applied Science#088882001הכינו תמיסת מלאי של 10 מ"ג/מ"ל
1x האנק סטרילי s תמיסת מלח מאוזנת (HBSS), ללא סידן ומגנזיוםGIBCO Life Technologies#14185-052
אלבומין סרום בקר, שבר VSigma#05470הכן תמיסה סטרילית  של 1X HBSS 0.5% BSA למיון FACS
מצע גידול סטרילי למיובלסטים: Dulbecco' s Modified Eagle' s בינוני (DMEM) עם גלוקוז גבוה (4.5 גרם) בתוספת 30% סרום בקר עובריGIBCO Life Technologies11965-092מכיל תמיסת ליזה L-glutamine
RBC מלאיQiagen158904
Propidium Iodide 10 מ"ג/מ"לSigmaP4170הכן את תמיסת המלאי על ידי דילול האבקה במים מזוקקים סטריליים
נוגדן CD56 אנטי אנושי לזרימה ציטומטריתBiolegend318310נוגדן מצומד APC, תוויות אחרות זמינות
ריאגנטים לאמורטליזציה של מיובלסטים ראשוניים
קו תאים אריזה אקוטרופית PECell BiolabsRV-101
קו תאים לאריזה אמפוטרופית PA3174Cell BiolabsRV-102
ג'לטין עור חזירSigmaG1890-500gהכינו תמיסת מלאי של 0.1% ג'לטין במים. מצפים את המנה בתמיסה ב -37 מעלות; C למשך שעה. הסר את התמיסה והוסף מדיום.
פוליג'ט SignagenSL100688
G418Fisher345812
HygromycinEMD Biosciences400051
פלסמידים pBabe המכילים mCDK4 ו-hTERTאינם זמיניםStadler et al, 2013
Qiagen plasmid midiprep kitQiagen12143
Medium 199Life Technologies בינוני 199 (31150022)
Dulbecco' מדיום נשר שונה (DMEM)טכנולוגיות חיים DMEM (11965-092)מיקס 4:1 DMEM:199
מדיום גידול מיובלסטי: 4:1 דולבקו' s שונה Eagle medium (DMEM) ו-Medium 199 בתוספת 15% סרום בקר עוברי; מאגר HEPES 0.02 מ'; 1.4 מ"ג/ליטר ויטמין B12; 0.03 מ"ג/ליטר ZnSO4, 0.055 מ"ג/ליטר דקסמתזון, 2.5 μ גורם גדילת הפטוציטים g/L ו-10 μ גורם גדילה בטא פיברובלסטים.טכנולוגיית חיים (DMEM, F199); אטלנטה ביולוגית (FBS); Invitrogen (Hepes); פישר (אבץ סולפט); סיגמא (ויטמין B12, דקסמתזון); Chemicon international (HGF); ביופיוניר (betaFGF) #15630-080 (Hepes); #Z68-500 (ZnSO); #V2876.#D4902 (Vit.B12, Dex); GF116 (HGF); HRP-0011 (bFGF). הכנת תמיסת מדיה ומלאי ויטמין B12 (20 מ"ג/מ"ל); אבץ סולפט (60&מיקרו; גרם/מ"ל); דקס (55 ומיקרו; g/µ l) בנפרד לשימוש קל יותר. פתרון מלאי HGF (5&מיקרו; גרם/מ"ל) ו-FGF (20&מיקרו; גרם/מ"ל) יש להוסיף טרי מדי שבוע בריכוז העבודה הסופי.
TrypLE expressGIBCO Life Technologies12605-010
נוגדן שרשרת כבדה מיוזין לצביעה חיסוניתהתפתחותית בנק היברידומהMF20שיבוט MF20
נוגדן דסמין לצביעה חיסוניתתרמו מדעיMS-376-S0שיבוט D33
סרום סוסInvitrogen26050-088
ריאגנטים לבידוד פיברובלסטים ראשוני בעור
מדיום הובלה: RPMI 1640 בתוספת 10% סרום בקר עוברי ו-0.2% פניצילין/סטרפטומיציןמדיום RPMI 1640: GIBCO Life Technologies11875-093
מדיום תרבית פיברובלסטים ראשוניים אנושיים: RPMI 1640 בתוספת 10% סרום בקר עוברי ו-1% פניצילין/סטרפטומיציןסרום בקר עוברי: Thermo ScientificSH30071.03
תמיסת קולגנאז: קולגנאז מסוג 2 (100 מ"ג) מושעה ב-12.5 מ"ל של מדיום תרבית פיברובלסטים ומעוקר בפילטרוורת'ינגטון4176
סטרילי 1X פוספט מאגר מלח (PBS) ללא סידן ומגנזיוםלונזה17-516F
חומרים לבידוד של מיובלסטים ראשוניים
50 מ"ל ו-15 מ"ל צינורות חרוטיים סטרילייםGeneMate/BioexpressC-3394-4 (50 מ"ל) ; C3394-1 (15 מ"ל))
אזמל סטריליאספן כירורגי372610
המוציטומטרHausser Scientific1492
סטרילי 5, 10 ו-25 מ"ל פיפטותבלקו1226-05010 (5 מ"ל); 1200-10010 (10 מ"ל); 1228-25050 (25 מ"ל)פיפטות רב פעמיות נשטפות, סתימות כותנה ומחטאות לפני השימוש
כלי פלסטיק סטריליים שטופלו בתרבית רקמות (10 ס"מ)BD Falcon353003
מסנני תאי ניילון סטריליים (100 ומיקרו; M ו-40 ומיקרו; גודל מ')BD Falcon352340 (40&מיקרו; m); 352360 (100&מיקרו; m)
  חומרים לאמורטליזציה
סטרילי 0.45 ומיקרו; m מסנניםMilliporeSLHV013SL
טבעות שיבוטקורנינג# 3166-8לניקוי וחיטוי לפני ואחרי השימוש
חומרים לקווי תאים פיברובלסטים 
כלי פלסטיק סטריליים 35 מ"מ שטופלו בתרבית רקמותGreiner bio-one628160
אזמלים סטרילייםDeRoyalD4510A
צלוחיות תרבית רקמות סטריליות T25מוצר פלסטיק טכנו, TPP90026נמכר בארה"ב על ידי MIDSCI
TrypLE expressGIBCO Life Technologies12605-010
צנטריפוגה ספסל מכסה המנוע סדרה II מסחרית של מיובלסט

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Flanigan, K. M. The muscular dystrophies. Semin Neurol. 32, 255-263 (2012).
  2. Mercuri, E., Muntoni, F. Muscular dystrophies. Lancet. 381, 845-860 (2013).
  3. Sharples, A. P., Stewart, C. E. Myoblast models of skeletal muscle hypertrophy and atrophy. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 14, 230-236 (2011).
  4. Tran, T., Andersen, R., Sherman, S. P., Pyle, A. D. Insights into skeletal muscle development and applications in regenerative medicine. Int Rev Cell Mol Biol. 300, 51-83 (2013).
  5. Miller, A. D., Buttimore, C. Redesign of retrovirus packaging cell lines to avoid recombination leading to helper virus production. Mol Cell Biol. 6, 2895-2902 (1986).
  6. Schubert, W., Zimmermann, K., Cramer, M., Starzinski-Powitz, A. Lymphocyte antigen Leu-19 as a molecular marker of regeneration in human skeletal muscle. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 307-311 (1989).
  7. Mechtersheimer, G., Staudter, M., Moller, P. Expression of the natural killer (NK) cell-associated antigen CD56(Leu-19), which is identical to the 140-kDa isoform of N-CAM, in neural and skeletal muscle cells and tumors derived therefrom. Ann N Y Acad Sci. 650, 311-316 (1992).
  8. Pavlath, G. K., Gussoni, E. Human myoblasts and muscle-derived SP cells. Methods Mol Med. 107, 97-110 (2005).
  9. Boldrin, L., Muntoni, F., Morgan, J. E. Are human and mouse satellite cells really the same. J Histochem Cytochem. 58, 941-955 (2010).
  10. Belles-Isles, M., et al. Rapid selection of donor myoblast clones for muscular dystrophy therapy using cell surface expression of NCAM. Eur J Histochem. 37, 375-380 (1993).
  11. Meng, J., Adkin, C. F., Xu, S. W., Muntoni, F., Morgan, J. E. Contribution of human muscle-derived cells to skeletal muscle regeneration in dystrophic host mice. PLoS One. 6, e17454(2011).
  12. Zhu, C. H., et al. Cellular senescence in human myoblasts is overcome by human telomerase reverse transcriptase and cyclin-dependent kinase 4: consequences in aging muscle and therapeutic strategies for muscular dystrophies. Aging Cell. 6, 515-523 (2007).
  13. Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skelet Muscle. 1, 34(2011).
  14. Sigmund, C. D., Stec, D. E. Genetic Manipulation of the Renin-Angiotensin System Using Cre-loxP-Recombinase. Methods Mol Med. 51, 53-65 (2001).
  15. Ludlow, A. T., et al. Quantitative telomerase enzyme activity determination using droplet digital PCR with single cell resolution. Nucleic Acids Res. 42, e104(2014).
  16. Jankowski, R. J., Haluszczak, C., Trucco, M., Huard, J. Flow cytometric characterization of myogenic cell populations obtained via the preplate technique: potential for rapid isolation of muscle-derived stem cells. Hum Gene Ther. 12, 619-628 (2001).
  17. Gharaibeh, B., et al. Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique. Nat Protoc. 3, 1501-1509 (2008).
  18. Qu, Z., et al. Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy. J Cell Biol. 142, 1257-1267 (1998).
  19. Choi, J., et al. MyoD converts primary dermal fibroblasts, chondroblasts, smooth muscle, and retinal pigmented epithelial cells into striated mononucleated myoblasts and multinucleated myotubes. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 7988-7992 (1990).
  20. Huard, C., et al. Transplantation of dermal fibroblasts expressing MyoD1 in mouse muscles. Biochem Biophys Res Commun. 248, 648-654 (1998).
  21. Lattanzi, L., et al. High efficiency myogenic conversion of human fibroblasts by adenoviral vector-mediated MyoD gene transfer. An alternative strategy for ex vivo gene therapy of primary myopathies. J Clin Invest. 101, 2119-2128 (1998).
  22. Park, J. I., et al. Telomerase modulates Wnt signalling by association with target gene chromatin. Nature. 460, 66-72 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תיקון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling
Posted by JoVE Editors on 11/12/2016. Citeable Link.

A correction was made to the authors section in: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

One of the authors names was corrected from:

Stacy C. Cossette

to:

Stacy A. Cossette

תגיות

FACSCDK4hTERT

מאמרים קשורים