הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

נתיחה והתקנה

12.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/52315

⸱

9 בנובמבר 2014

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular, Cell and Developmental Biology (MCDB), University of California at Los Angeles (UCLA), 2Arizona College of Osteopathic Medicine (AZCOM), Midwestern University, 3MCDB, Broad Stem Cell Research Center, UCLA

במאמר זה

סיכום

מטרת טכניקה זו היא לאפשר לחוקרים לבצע דיסקציה, צביעה חיסונית והרכבה של דיסקים של עין גולם מדרוזופילה מלנוגסטר בכל גיל.

תקציר

דיסק העין Drosophila melanogaster הוא מערכת רבת עוצמה שניתן להשתמש בה כדי לחקור תהליכים ביולוגיים רבים ושונים. הוא מכיל כ-800 יחידות עיניים נפרדות, הנקראות אומטידיה1. כל אומטידיום מכיל שמונה קולטני אור עצביים המתפתחים מתאים לא ממוינים לאחר מעבר התלם המורפוגנטי בכוכב הזחלהשלישי 2. בעקבות ההתמיינות הרציפה של קולטני האור, מתפתחים תאים לא עצביים, כולל תאי חרוט ופיגמנט, יחד עם תאי זיפים מכניים-סנסוריים3. תהליכי התמיינות סופיים, כולל הסידור המובנה של כל סוגי התאים האומטידיאליים, מוות תאי מתוכנת של סוגי תאים לא ממוינים וביטוי רודופסין, מתרחשים דרך שלבהגולם 4-7. טכניקה זו מתמקדת במניפולציה של דיסק עין הגולם, ומספקת תובנה והדרכה כיצד לנתח את דיסק העין במהלך שלב הגולם, שהוא מטבעו קשה יותר לביצוע מאשר דיסק העין השלישי המנותח בדרך כלל. טכניקה זו מספקת גם פרטים על צביעה חיסונית כדי לאפשר הדמיה של חלבונים שונים ורכיבי תא אחרים.

מבוא

תחומי ביולוגיה התפתחותית ותא כבר הושפע רב מאורגניזם המודל: דרוזופילה melanogaster. בתוך מודל זה, מחקרים של דיסק העין תרמו רב איתות ידע הנוגע ל, ביולוגיה של תא ובאזורים אחרים. דיסק הזחל השלישי מאוחר עין instar נחקר בהרחבה והוא מודל רב עוצמה לנצל, כפי שהוא נותן תמונת מצב של סדרה של תקופות התפתחותיות, כל אחד עם המולקולות שלו האיתות ייחודית ותהליכים, כמו תלם המוךפו"גנטי מתקדם פני דיסק העין 8. עם זאת, יש צורך להרחיב עוד יותר את ההבנה של תהליכים התפתחותיים שלנו לשלב גלמים של פיתוח. אמנם היו מחקרים על דיסק עין גלמי 3-7, הידע שלנו לא מתקרב לרוחבה של עבודה שבוצעה על דיסק עין instar השלישי. זאת בשל, בחלקו, לקושי הגדול יותר בלנתח את דיסק עין גלמים. לכן, הצגתשיטה נכונה של נתיחה יכולה להרחיב מאוד את המחקר בתחום זה.

אמנם יש שלבים בהתפתחות דיסק עין גלמים שבקלות גזורים, במיוחד סביב תקופת אמצע גלמים-, תקופות זמן אחרות הן הרבה יותר מאתגר לנתח. פרוטוקול זה מייצג שיטה אחת ללנתח דיסקי עין גלמים שניתן להשתמש בי אוניברסלי לכל מסגרות הזמן התפתחותי גלמים. פרוטוקול זה יכול לשמש כתחליף לעוד פרוטוקול 9 שמראה שיטה קלה ומהירה יותר לנתח דיסקי עין מנקודות זמן midpupal. פרוטוקול זה צולם במקור ופיתח להכשרת סטודנטים לתואר ראשון מתקדמים באוניברסיטת UCLA לתואר ראשון קונסורציום המחקר בגנומיקה פונקציונלית (URCFG) 10,11 בטכניקה של נתיחת עין גלמים. סטודנטים לתואר ראשון רבים היו מסוגלים לנצל את וידאו ובשיטה זו כדי ללמוד את הטכניקה מאתגרת זו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הליך זה הוא הליך 2 יום.

יום 1 (שעה 2 + לנתח זמן)

Dissection 1. גלמי עין הדיסק

  1. בחר גולם לנתיחה.
    הערה: גיל הגולם להיות גזורים תיקבע על ידי צרכי הניסיוניים. עם זאת, אם בוחן את המורפולוגיה של תאים, זה נעשה לעתים קרובות על 42 שעות לאחר היווצרות הגולם (APF) של 25 מעלות צלזיוס, שהוא הגיל של הגלמים ניתן לראות בסרטון. אסוף לבנים גלמים (APF 0 שעה הנחשבת) עם מכחול רטוב ולסדר אותם בסדר כרונולוגי (המבוסס על זמן איסוף) בבקבוקון אוכל לטוס חדש נשמר על 25 מעלות צלזיוס. לנתח את הגלמים המיושנים באותו סדר כרונולוגי זה כדי לשמור על פרש הזמן בין שני גלמים קרובים ככל האפשר.
  2. העבר את הגולם לירידה של פוספט שנאגרו מלוח (PBS, pH 7.4, לראות חומרים למתכון) על צלחת לנתח סיליקון.
  3. החזק את החלק העליון של המקרה גלמי עם מלקחיים ופירס ולפתוח את lחלק ower של המקרה גלמי עם זוג מלקחיים חדים. הסר את הגולם מהמקרה לחור שהוקם זה עתה.
  4. לעשות חתך אלכסוני במספריים, באמצע בית חזה-, בגולם. הסר את הפסולת או להעביר את ראש הגולם לירידה חדשה של PBS. נקה באמצעות צינור מפוח פיפטה (ראה חומרים ואיור 1 לפרטים נוספים) ולהוסיף PBS נוסף בהתאם לצורך. ודא כדי למנוע התייבשות.
  5. אחיזה מאובטחת העליון של ציפורן ראש גלמים עם זוג המלקחיים. באמצעות הקצה של מפוח הצינור, דחף בעדינות על המקרה גלמי כדי למתוח את המוח וברקמות אחרות, כוללים דיסקי העין, מתוך המקרה גלמי. הקפד להימנע תופס את כל רקמה בתוך הציפורן.
  6. השימוש במפוח הצינור מלא PBS, בעדינות לפוצץ את רקמת שומן בגוף ופסולת אחרת ממקרה הראש להפריד באופן ברור ולזהות דיסקי המוח ועיניים.
    הערה: שמירה על המוח המצורף במקרה ראש גלמים תאפשר לחוקר להשתמשמקרה מודעה כ" ידית "למניפולצית עתיד של הרקמה מבלי לפגוע בדיסקי עין או במוח. עם זאת, זה נפוץ כדי לסלק את דיסקי המוח והעין ממקרה הראש וזה לא פוגע בהליך והתוצאות הכוללים. זה לוקח בדרך כלל ניסיונות מרובים של פיצוץ ודוחף להצלחה לחלץ את דיסקי העין ומוח מבפנים מקרה ראש גלמים וכך שהם באופן ברור, בנפרד מרקמה הסובבת. נקי יותר ויותר נפרד אחד יכולים לקבל דיסקי עין מן הרקמה הסובבת יסייעו למנוע רקמות זרות מתיקון לדיסקי עין.
  7. בעקבות נתיחה, להעביר באופן מיידי את הרקמה לצלחת זכוכית 3 גם על קרח עם 0.5 מיליליטר של תמיסת תקן (ראה חומרים). לצוף הרקמה על פני השטח של פתרון תקן לכמה דקות (בדרך כלל הזמן שלוקח לנתח את הסדרה הבאה של דיסקי העין).
    הערה: אם זה לא דיסק העין הראשון להיות גזור בסיבוב הנתיחה, completel זהy להטביע את דיסק העין הקודם לפתרון תקן. אם ביצוע נהלים מיוחדים צביעה (לדוגמא, מיני חמצן תגובתי, lysosomes, וכו ') זה חייב להיעשות לפני הקיבוע. כדי לעשות זאת, לאחסן את תקליטורי עין גזורים בPBS קר כקרח לפני המשך הפרוטוקול מכתים המתאים.
  8. בעקבות נתיחה והטמעה של כל דיסקי העין עוברת ניתוחים, להעביר את צלחת זכוכית 3 גם לנדנדה ורוק בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות.

2. Immunostaining

  1. מוציא בזהירות את פתרון התיקון ומוסיף 0.5 מיליליטר של PBS עם 0.3% Triton X-100 (PBT 0.3%, לראות חומרים) ולשטוף את הרקמה על כיסא נדנדה במשך 10 דקות. חזור על פעולה זו שלוש פעמים נוספות עבור הסכום כולל של 4 שטיפות (10 דקות כל אחד).
    הערה: הסרה זהירה של הפתרון מהבאר ניתן לבצע תחת מיקרוסקופ לנתח כדי למנוע נזק לרקמות או הפסד. הפתרון יכול להישאף בזהירות עם pipet; אנחנו מעדיפים עדין tippeד, pipet העברה חד פעמי כי יש לו הפתיחה השטוחה כדי להקטין את הסיכוי של aspirating רקמה.
  2. בסופו של השטיפה 4, להסיר את לשטוף ולהוסיף 0.5 מיליליטר פתרון לחסום (ראה חומרים) ולדגירה במשך 30 דקות.
    הערה: מסגרת זמן זו ניתנת להארכה בהתאם לצרכים שלך.
  3. בסופו של זמן חסימת 30 דקות, pipet 10 μl של ראשי נוגדני פתרון (בדילול מלא פתרון בלוק) למספר המתאים של בארות בצלחת microwell.
    הערה: גם אחד מצלחת microwell יהיה להכיל כ 4 זוגות של דיסקי עין מצורפים במקרה גלמים או 8 זוגות בודדים של דיסקי עין עם המוח המצורף. הנוגדנים העיקריים בשימוש בפרוטוקול זה לנתונים הנציג הם אנטי-phosphotyrosine (1: 500 דילול) ואנטי-Cut (1: 200 דילול).
  4. העברת הרקמה גזור לתוך בארות צלחת microwell מלאות היסודי נוגדני הפתרון מצלחת זכוכית 3 גם.
  5. מקוםצלחת microwell על מגבת נייר רטובה (כדי למנוע התייבשות) בתיבת pipet הריק קצה (או מיכל דומה אחר) ולאחסן ב 4 ° C למשך הלילה.

יום 2 (4 שעות + ההרכבה זמן)

  1. העברת הרקמה מצלחת microwell לצלחת זכוכית 3 גם חדשה עם 0.3% PBT (≈0.5 מיליליטר) ולשטוף את הרקמות של 10 דקות על הנדנדה. חזור על פעולה זו שלוש פעמים נוספות עבור הסכום כולל של 4 שטיפות (10 דקות כל אחד)
  2. הסר את השטיפה האחרונה ומוסיף 0.5 מיליליטר של תמיסת הבלוק לבאר. לחסום למשך 30 דקות.
    הערה: מסגרת זמן זו ניתנת להארכה בהתאם לצרכים שלך.
  3. הסר את פתרון החסימה ולהוסיף 0.5 מיליליטר של משני נוגדני הפתרון (עשוי מנוגדנים שכותרתו fluorescently מתאימים לנוגדן העיקרי שלך ואורך גל ניאון, בדילול מלא בפתרון בלוק) לטוב ולהגן על צלחת זכוכית 3 גם מהאור עם כיסוי או אלומיניום לסכל ודגירה של לפחות 2 שעות בחדרטמפרטורה.
    הערה: כל הצעדים הבאים צריכים להיות מוגנים באופן דומה מחשיפה לאור. דגירה זה יכול להתארך עד הלילה ב 4 ° C, בהתקנה דומה לדגירת הנוגדן הראשונית, אך הוא גם יכול להתבצע בכלי זכוכית 3 גם מכוסים בסרט מעבדה, או צלחת microwell אם שימור נוגדן הוא רצוי.
  4. בסוף הדגירה הנוגדנים, להסיר משני נוגדני הפתרון ולהוסיף 0.5 מיליליטר של PBT 0.3% לטובים ולשטוף בנדנדה במשך 10 דקות. חזור על שלב זה עבור הסכום כולל של 4 שטיפות (10 דקות כל אחד).
    הערה: אם מכתים DAPI הוא רצוי, לפני שמתחילים לשטוף הראשון, להוסיף 0.5 μl של פתרון מניות DAPI (ראה חומרים) ל-500 μl של PBT שישמש להדחה הראשונה (1: 1,000 דילול).

3. הרכבה

  1. בסופו של השטיפה האחרונה, הר דיסקי מחושים / עין על שקופית באמצעות גליצרול 70% או PBS כמדיום כדי להסיר את brעין וברקמות לא רצויות אחרות בבריכה בצד אחד של השקופיות.
  2. בזהירות להזיז את הרקמות באמצעות לחץ ההידרוסטטי בין המלקחיים, או בעדינות עם קצה מלקחיים, ושורת דיסקי עין בטור לכיוון המרכז של השקופית.
  3. הסר את כל גליצרול הזר או PBS מכל רחבי הרקמה (באמצעות פעולת הפתילה של מעבדה נגבתה או המלקחיים לעבוד על זה).
  4. מניחים כמות קטנה (≈10 μl) של מדיום גובר בצד אחד של טור דיסק העין ובמקום coverslip על הרקמה על מנת להפיץ את המדיום גובר על דיסקי עין.
  5. בואו לשבת שקופיות 1 עד 2 דקות כדי לאפשר לרקמות / ההרכבה בינונית להתפשט לחלוטין.
  6. נגב כל מדיום הרכבה נוסף מן מסביב לקצוות של coverslip ולאטום אותו עם לק ברור.
  7. צלם תמונות ניאון של דיסקי העין באמצעות מיקרוסקופ confocal.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדוגמא לשימוש בפרוטוקול זה, תוצאות ממחישות midpupal (42 שעות APF של 25 מעלות צלזיוס) דיסקי עין immunostained עם נוגדנים שונים מוצגים באיור 2. על ידי שימוש בנוגדן מכוון נגד שאריות phosphotyrosine, הקרום של התאים יכול להיות (איור 2 א) שנצפה. זה יכול לשמש כדי לזהות את ההסדר הקבוע של תאי ommatidial בעיני גלמים בעקבות תהליכי הדפוסים הסופיים המתרחשים לפני שלב midpupal. תמונת נציג אחרת מתארת ​​את הגרעינים של תאי חרוט יכולים מזוהים על ידי שימוש בנוגדנים נגד גורם השעתוק חת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

אמנם נראה שהתהליך פשוט וקל לביצוע, אך במציאות, טכניקה זו דורשת תרגול רב כדי לשלוט בה. באופן שגרתי, אנו מתחילים את התלמידים בלימוד לנתח ולהרכיב דיסקים של עין כוכב שלישי12, שהרבה יותר קל לעבוד איתם. תרגול זה מסייע לפתח תנוחת דיסקציה מתאימה של הזרועות, הידיים והאצבעות13 כך שמניפולציה של המלקחיים תחת מיקרוסקופ הניתוח תהיה יציבה, קלה ומנוסה. בעיקרו של דבר, תקופת התרגול אמורה להשיג את המטרה של הפיכת המלקחיים להרחבה טבעית של האצבעות והאגודל, המאפשרת את התנועות הדיסקרטיות והעדינות הנדרשות בדיסקציה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

אנו מעריכים ורוצים להודות למכון הרפואי הווארד יוז על פרס הפרופסור HHMI לאוניברסיטת בנגלדש שאפשר את הפרויקט הזה. אנו מודים למכללה באוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג'לס על מתן מתקנים ותשתיות הוראה לעבודה זו. העבודה נתמכה גם במימון מאוניברסיטת מידווסטרן ותרומה נדיבה מקרן מתנות הצדקה Fidelity. אנו מודים לג'ון ונדנברוקס על הערותיו על כתב היד ולקריסטה פירמן על הסיוע הטכני שלה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תמיסת מלח עם חומצת פוספט (PBS, pH 7.4)80גרם NaCl, 2 גרם  KCl, 14.4 גרם Na2HPO4, 2.4 גרם KH2PO4, הביא את הנפח ל-1 μ l, כוונן את ה-pH ל-7.4, חיטוי או מסנן לעקר, לדלל ל-1x PBS עם חיטוי ddH2O לפני השימוש.
Triton X-100PromegaH5142זהירות: מגרה! ללבוש כפפות.
0.3% PBT1.5 מ"ל של Triton X-100, 500 מ"ל 1X PBS.
תמיסת פורמלדהיד 37%פישר סיינטיפיקF75P1GALזהירות: רעיל, ככל הנראה מסרטן בבני אדם! ללבוש כפפות. 
תיקון פתרון(≈ 4% פורמלדהיד ב-PBS) 50 μ l של 37% פורמלדהיד, 450 μ l 1x PBS, לעשות טרי לפני השימוש
סרום עיזים רגילנוגדנים ובדיקותרוקלנד B304Aliquot בנפחים של 1 מ"ל ולאחסן ב -80 & #176;
תמיסת10% NGS ב-PBT.  ניתן להכין ולאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C למספר ימים לפני השימוש.
פתרון מלאי DAPILife TechnologiesD3571לגרעיני צביעת קוטנר הכן תמיסה של 1 מ"ג/מ"ל עם ddH2O.
VectaShield הרכבה בינוניתוקטור מעבדותH-1000הרכבה בינונית
גליצרולSigmaG5516להרכבה. הכן דילול של 70% עם ddH2O.
מיקסר אגוזיםציוד
SylGard 182 ערכת אלסטומר סיליקוןKraydenNC9897184משמש להכנת צלחת חיתוך סיליקון
צלחתחיתוך סיליקוןיש לערבב בעדינות את ערכת האלסטומר של Sylgard (למעלה) לפי ההוראות (כדי למנוע בועות). יוצקים את התערובת לצלחת פטרי (בכל גודל). אפשר ל-SylGard להתרפא למשך הלילה ב-37 מעלות; חממת C.
צלחת זכוכית 3 בארותקורנינג7220-85מגוון 3 הבארות של אלה כבר לא זמין, זהו המוצר 9 בארות.
72 באר מיקרווול מיני-מגשNunc438733
מלקחיים חדים (Dumont #55)Fine Science Tools11255-20
מספריים מיקרו מסוג Vannas, ישר, להב 5 מ"מטד פלה1346
100 מ"מ נימי זכוכית בורוסיליקט 100 מ"מWorld Precision Instruments1B100-4משוך עם מושך מחט כדי ליצור קצה נקודתי עדין המאפשר לזרם קטן של PBS לזרום.
צנרת העברה חד פעמית, קצה עדיןSamco Scientific231
מידות הצינורות שניתנו הן קוטר פנימי (ID) x קוטר חיצוני (OD) x עובי דופן באינצ'ים
צינורות PVC (1/8 x 3/16 x 1/32)Nalgene8000-0010השתמש בהם עם מחט משוכה כדי להרכיב את צינור המפוח כפי שמוצג באיור 2.
צינורות סיליקון Tygon (3/32 x 5/32 x 1/32Saint Gobain Performance PlasticsABW00004
צינורות סיליקון Tygon (1/32 x 3/32 x 1/32Saint Gobain Performance PlasticsABW00001
בלוק C VWR 82007-202 משמש לרקמות סלע בצלחת זכוכית 3 באר ))

מקורות

  1. Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev Biol. 53 (2), 217-240 (1976).
  2. Wolff, T., Ready, D. F. The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave. Development. 113 (3), 841-850 (1991).
  3. Carthew, R. W. Pattern formation in the Drosophila eye. Curr Opin Genet Dev. 17 (4), 309-313 (2007).
  4. Bao, S., Cagan, R. Preferential adhesion mediated by Hibris and Roughest regulates morphogenesis and patterning in the Drosophila eye. Dev cell. 8 (6), 925-935 (2005).
  5. Grzeschik, N. A., Knust, E. IrreC/rst-mediated cell sorting during Drosophila pupal eye development depends on proper localisation of DE-cadherin. Development. 132 (9), 2035-2045 (2005).
  6. Sprecher, S. G., Desplan, C. Switch of rhodopsin expression in terminally differentiated Drosophila sensory neurons. Nature. 454 (7203), 533-537 (2008).
  7. Zuker, C. S., Cowman, A. F., Rubin, G. M. Isolation and structure of a rhodopsin gene from D. melanogaster. Cell. 40 (4), 851-858 (1985).
  8. Voas, M. G., Rebay, I. Signal integration during development: insights from the Drosophila eye. Dev Dyn. 229 (1), 162-175 (2004).
  9. Hsiao, H. Y., et al. Dissection and immunohistochemistry of larval, pupal and adult Drosophila retinas. J Vis Exp. , 4347(2012).
  10. Call, G. B., et al. Genomewide clonal analysis of lethal mutations in the Drosophila melanogaster eye: comparison of the X chromosome and autosomes. Genetics. 177 (2), 689-697 (2007).
  11. Chen, J., et al. Discovery-based science education: functional genomic dissection in Drosophila by undergraduate researchers. PLoS Biol. 3 (2), 59(2005).
  12. Wolff, T. Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes. CSH Protoc. 2007, (2007).
  13. Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. J Vis Exp. 37, 1936(2010).
  14. Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
  15. Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

דיסקת העין של בובת דרוזופילהדיסקציה של דיסקת העיןדיסקציה בשלב הבובהפרוטוקול לצביעה אימונוהיסטוכימיתמיקרוסקופיה קונפוקליתמניפולציה באמצעות פינצטותתמיסת PBSבידוד המוחקיבוע רקמההכנת סלייד
נתיחה והתקנה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.