נתיחה והתקנה<em&gt; דרוזופילה</em&gt; גלמי דיסקי העין

סיכום

מטרת טכניקה זו היא לאפשר לחוקרים לבצע דיסקציה, צביעה חיסונית והרכבה של דיסקים של עין גולם מדרוזופילה מלנוגסטר בכל גיל.

תקציר

דיסק העין Drosophila melanogaster הוא מערכת רבת עוצמה שניתן להשתמש בה כדי לחקור תהליכים ביולוגיים רבים ושונים. הוא מכיל כ-800 יחידות עיניים נפרדות, הנקראות אומטידיה¹. כל אומטידיום מכיל שמונה קולטני אור עצביים המתפתחים מתאים לא ממוינים לאחר מעבר התלם המורפוגנטי בכוכב הזחל^{השלישי 2}. בעקבות ההתמיינות הרציפה של קולטני האור, מתפתחים תאים לא עצביים, כולל תאי חרוט ופיגמנט, יחד עם תאי זיפים מכניים-סנסוריים³. תהליכי התמיינות סופיים, כולל הסידור המובנה של כל סוגי התאים האומטידיאליים, מוות תאי מתוכנת של סוגי תאים לא ממוינים וביטוי רודופסין, מתרחשים דרך שלב^{הגולם 4-7}. טכניקה זו מתמקדת במניפולציה של דיסק עין הגולם, ומספקת תובנה והדרכה כיצד לנתח את דיסק העין במהלך שלב הגולם, שהוא מטבעו קשה יותר לביצוע מאשר דיסק העין השלישי המנותח בדרך כלל. טכניקה זו מספקת גם פרטים על צביעה חיסונית כדי לאפשר הדמיה של חלבונים שונים ורכיבי תא אחרים.

מבוא

תחומי ביולוגיה התפתחותית ותא כבר הושפע רב מאורגניזם המודל: דרוזופילה melanogaster. בתוך מודל זה, מחקרים של דיסק העין תרמו רב איתות ידע הנוגע ל, ביולוגיה של תא ובאזורים אחרים. דיסק הזחל השלישי מאוחר עין instar נחקר בהרחבה והוא מודל רב עוצמה לנצל, כפי שהוא נותן תמונת מצב של סדרה של תקופות התפתחותיות, כל אחד עם המולקולות שלו האיתות ייחודית ותהליכים, כמו תלם המוךפו"גנטי מתקדם פני דיסק העין ^8. עם זאת, יש צורך להרחיב עוד יותר את ההבנה של תהליכים התפתחותיים שלנו לשלב גלמים של פיתוח. אמנם היו מחקרים על דיסק עין גלמי ^3-7, הידע שלנו לא מתקרב לרוחבה של עבודה שבוצעה על דיסק עין instar השלישי. זאת בשל, בחלקו, ....

פרוטוקול

הליך זה הוא הליך 2 יום.

יום 1 (שעה 2 + לנתח זמן)

Dissection 1. גלמי עין הדיסק

1. בחר גולם לנתיחה.
   הערה: גיל הגולם להיות גזורים תיקבע על ידי צרכי הניסיוניים. עם זאת, אם בוחן את המורפולוגיה של תאים, זה נעשה לעתים קרובות על 42 שעות לאחר היווצרות הגולם (APF) של 25 מעלות צלזיוס, שהוא הגיל של הגלמים ניתן לראות בסרטון. אסוף לבנים גלמים (APF 0 שעה הנחשבת) עם מכחול רטוב ולסדר אותם בסדר כרונולוגי (המבוסס על זמן איס....

תוצאות

כדוגמא לשימוש בפרוטוקול זה, תוצאות ממחישות midpupal (42 שעות APF של 25 מעלות צלזיוס) דיסקי עין immunostained עם נוגדנים שונים מוצגים באיור 2. על ידי שימוש בנוגדן מכוון נגד שאריות phosphotyrosine, הקרום של התאים יכול להיות (איור 2 א) שנצפה. זה יכול לשמש כדי לזהות את ההסדר הקבוע של תאי ommatidial בעיני גלמים בעקבות תהליכי הדפוסים הסופיים המתרחשים לפני שלב midpupal. תמונת נציג אחרת מתארת ​​את הגרעינים של תאי חרוט יכולים מזוהים על ידי שימוש בנוגדנים נגד גורם השעתוק חת.......

דיון

אמנם נראה שהתהליך פשוט וקל לביצוע, אך במציאות, טכניקה זו דורשת תרגול רב כדי לשלוט בה. באופן שגרתי, אנו מתחילים את התלמידים בלימוד לנתח ולהרכיב דיסקים של עין כוכב שלישי¹², שהרבה יותר קל לעבוד איתם. תרגול זה מסייע לפתח תנוחת דיסקציה מתאימה של הזרועות, הידיים והאצבעות¹³ כך שמניפולציה של המלקחיים תחת מיקרוסקופ הניתוח תהיה יציבה, קלה ומנוסה. בעיקרו של דבר, תקופת התרגול אמורה להשיג את המטרה של הפיכת המלקחיים להרחבה טבעית של האצבעות והאגודל, המאפשרת את התנועות הדיסקרטיות והעדינות הנדרשות בדיסקציה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תמיסת מלח עם חומצת פוספט (PBS, pH 7.4)80			גרם NaCl, 2 גרם  KCl, 14.4 גרם Na2HPO4, 2.4 גרם KH2PO4, הביא את הנפח ל-1 μ l, כוונן את ה-pH ל-7.4, חיטוי או מסנן לעקר, לדלל ל-1x PBS עם חיטוי ddH2O לפני השימוש.
Triton X-100	Promega	H5142	זהירות: מגרה! ללבוש כפפות.
0.3% PBT			1.5 מ"ל של Triton X-100, 500 מ"ל 1X PBS.
תמיסת פורמלדהיד 37%	פישר סיינטיפיק	F75P1GAL	זהירות: רעיל, ככל הנראה מסרטן בבני אדם! ללבוש כפפות.
תיקון פתרון			(≈ 4% פורמלדהיד ב-PBS) 50 μ l של 37% פורמלדהיד, 450 μ l 1x PBS, לעשות טרי לפני השימוש
סרום עיזים רגיל	נוגדנים ובדיקות	רוקלנד B304	Aliquot בנפחים של 1 מ"ל ולאחסן ב -80 & #176;
תמיסת			10% NGS ב-PBT.  ניתן להכין ולאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C למספר ימים לפני השימוש.
פתרון מלאי DAPI	Life Technologies	D3571	לגרעיני צביעת קוטנר הכן תמיסה של 1 מ"ג/מ"ל עם ddH2O.
VectaShield הרכבה בינונית	וקטור מעבדות	H-1000	הרכבה בינונית
גליצרול	Sigma	G5516	להרכבה. הכן דילול של 70% עם ddH2O.
מיקסר אגוזים	ציוד
SylGard 182 ערכת אלסטומר סיליקון	Krayden	NC9897184	משמש להכנת צלחת חיתוך סיליקון
צלחת			חיתוך סיליקוןיש לערבב בעדינות את ערכת האלסטומר של Sylgard (למעלה) לפי ההוראות (כדי למנוע בועות). יוצקים את התערובת לצלחת פטרי (בכל גודל). אפשר ל-SylGard להתרפא למשך הלילה ב-37 מעלות; חממת C.
צלחת זכוכית 3 בארות	קורנינג	7220-85	מגוון 3 הבארות של אלה כבר לא זמין, זהו המוצר 9 בארות.
72 באר מיקרווול מיני-מגש	Nunc	438733
מלקחיים חדים (Dumont #55)	Fine Science Tools	11255-20
מספריים מיקרו מסוג Vannas, ישר, להב 5 מ"מ	טד פלה	1346
100 מ"מ נימי זכוכית בורוסיליקט 100 מ"מ	World Precision Instruments	1B100-4	משוך עם מושך מחט כדי ליצור קצה נקודתי עדין המאפשר לזרם קטן של PBS לזרום.
צנרת העברה חד פעמית, קצה עדין	Samco Scientific	231
מידות הצינורות שניתנו הן קוטר פנימי (ID) x קוטר חיצוני (OD) x עובי דופן באינצ'ים
צינורות PVC (1/8 x 3/16 x 1/32)	Nalgene	8000-0010	השתמש בהם עם מחט משוכה כדי להרכיב את צינור המפוח כפי שמוצג באיור 2.
צינורות סיליקון Tygon (3/32 x 5/32 x 1/32	Saint Gobain Performance Plastics	ABW00004
צינורות סיליקון Tygon (1/32 x 3/32 x 1/32	Saint Gobain Performance Plastics	ABW00001

בלוק C VWR 82007-202 משמש לרקמות סלע בצלחת זכוכית 3 באר ))