מאמר שיטה

חוקר את החלבונים כמו פריון-הפצת ורעילות של שימוש במטזואניים דגם אורגניזם

16.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/52321

⸱

8 בינואר 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biosciences, Rice Institute for Biomedical Research, Northwestern University

במאמר זה

סיכום

התפשטות דמוית פריון של אגרגטים חלבוניים התגלתה לאחרונה כמעורבת במחלות ניווניות רבות. מטרת פרוטוקול זה היא לתאר כיצד להשתמש בנמטודה C. elegans כמערכת מודל לניטור התפשטות חלבון ולחקירת תופעות דמויות פריון.

תקציר

פריונים הם חלקיקים חלבונים לא קונבנציונליים המתפשטים בעצמם, נטולי כל חומצת גרעין מקודדת. זרעים חלבונים אלה משמשים כתבניות להמרה ושכפול של האיזופורם התאי השפיר שלהם. עדויות מצטברות מצביעות על כך שאגרגטים רבים של חלבונים יכולים לשמש כתבניות המתפשטות מעצמן ולהשחית את הקיפול של חלבונים קוגניטיביים. למרות שאגרגטים יכולים להיות פונקציונליים בנסיבות מסוימות, תהליך זה מוביל לעתים קרובות לשיבוש של הומאוסטזיס החלבון התאי (פרוטאוסטזיס), מה שמוביל בסופו של דבר למחלות הרסניות כגון מחלת אלצהיימר (AD), מחלת פרקינסון (PD), טרשת אמיוטרופית צידית (ALS), או אנצפלופתיה ספוגית מועברת (TSEs). המנגנונים המדויקים של התפשטות פריונים והתפשטות תא לתא של אגרגטים חלבונים הם עדיין נושא למחקר אינטנסיבי. כדי לקדם את הידע הזה, הוקם לאחרונה מודל מטזואן חדש ב-Caenorhabditis elegans, לביטוי תחום הפריון של חלבון פריון השמרים הציטוזולי Sup35. מודל פריון זה מציע מספר יתרונות, מכיוון שהוא מאפשר ניטור ישיר של תחום הפריון המתויג פלואורסצנטי בבעלי חיים וקלות של גישות גנטיות. מתוארות כאן שיטות לחקר התנהגות דמוית פריונים של אגרגטים חלבונים ולזיהוי משנים של רעילות הנגרמת על ידי פריונים באמצעות C. elegans.

מבוא

מחלות רבות ניווניות, כוללים מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון (PD) (AD), טרשת לרוחב amyotrophic (ALS), וencephalopathies transmissible spongiform (TSEs), המשויכות חלבוני צבירה מועדת ומכאן ידועות קולקטיבי חלבון misfolding הפרעות (PMDs ). TSEs או מחלות פריון מהוות מעמד ייחודי של PMDs בכך שהם יכולים להיות זיהומיות, באדם ובעלי החיים 1. ברמה המולקולרית, פריונים לשכפל על ידי גיוס והמרת PRP monomeric α-helix-עשיר בקידוד המארח הסלולרי (PRP C) לקונפורמציה PRP Sc β גיליון העשיר פתולוגי 2,3. אגרגטים חלבון עצמי הפצת גם זוהו בפטריות, אשר חולקות מאפיינים חשובים עם פריונים יונקים 4,5. בנוסף, פריונים יונקים מסוגלים לנוע מתא אל תא ולהדביק תאים נאיביים 6,7.

בעוד oth PMDsאה מ TSEs אינו מדבק, הם חולקים עיקרון פתוגניים משותף עם מחלות פריון 8,9. למרות שהחלבונים הקשורים לכל אחד מPMDs אינם קשורים במבנה או פונקציה, הם כל אגרגטים הטופס באמצעות תהליך התגבשות כמו שנקרא גרעיניים או זרע פילמור; יתר על כן זרעים חלבוניים לגדול על ידי גיוס isoforms המסיס 2,10,11. היעילות להפיץ עצמי משתנה in vivo, בהתאם למאפיינים הפנימיים של החלבון, אשר יחד עם גורמים סלולריים נוספים כגון מלווים מולקולריים סופו של דבר יקבעו את התעריפים של התגרענות כוללת, זריעה, פיצול והפצת 12-15. מכאן, שחייב להתקיים איזון עדין בין הגורמים הללו, המאפשר התפשטות יעילה של צבירת חלבון. זה עשוי גם להסביר מדוע רק חלק אגרגטים amyloidogenic נמל המאפיינים של פריון, ולכן לא כל PMDs הם מדבקים. נראים פריונים לייצג o 'מלמעלה מבצעים'ספקטרום רחב של fa אגרגטים חלבוניים המשכפלים את עוצמה, מה שהופך אותם כלי רב עוצמה כדי ללמוד PMDs 8,13.

מעניין לגלות שההרעלה כרוכה באגרגטים הקשורים למחלות לעתים קרובות יש מרכיב אוטונומי של תאים הלא 16,17. משמעות דבר היא כי הם משפיעים על תאים שכנים, שאינו מבטאים את הגן המתאים, בניגוד להשפעה אוטונומית תא בהחלט, מה שמרמז שרק תאים המבטאים את גן התערוכה פנוטיפ הספציפי. הדבר בא לידי הביטוי משכנע על ידי ביטוי רקמות ספציפיות או להפיל של החלבונים המתאימים במספר רב של דגמים של מחלות ניווניות 18-26. מנגנונים שונים הוצעו כבסיס לרעילות זו אינה תא אוטונומית בPMDs, כוללים אספקת חומרי מזון פחת, חוסר איזון באיתות עצבית, הפעלת יתר רעילה גלוטמט, וneuroinflammation 16,27,28. בנוסף, תנועה כמו פריון-אגרגטים צמודי מחלה בין תאי might לתרום להיבט זה 29,30. ראיות מצביעות על כך שהגדלת תכלילים חלבון אחרים מאשר פריונים יכולים לשדר מתא אל תא, שעשוי להסביר את מאפיין הפצה של פתולוגיה שנצפתה בPMDs רב 30-36. עם זאת, זה עדיין לא נקבע אם יש קשר סיבתי ברור בין תנועה בין תאית של חלבוני מחלה וההשפעה הרעילה על תאי שכנים. לכן, הבנה טובה יותר של המסלולים הסלולריים העומדים בבסיס שידור ורעילות אוטונומית שאינו תא תא אל התא היא הכרחית וחיונית לפיתוח תרופות חדשניות. עם זאת, היבטים רבים של פריון כמו גורמי הפצה וסלולריים המשפיעים על העברת תא אל התא של חלבוני misfolded בmetazoans אינם מובנה היטב, בפרט ברמת האורגניזם.

יש נמטודות elegans Caenorhabditis מספר יתרונות המספקים פוטנציאל ל לגלות היבטים חדשים של spreadi כמו פריון-ng בmetazoans 17. זה שקוף, המאפשר למעקב in vivo חלבונים של מתויגים fluorescently באורגניזם החי. יתר על כן, תהליכים תאיים ופיסיולוגיים רבים במחלה נשמרים מתולעים לאדם, ו- C. elegans הוא גם נוח למגוון רחב של מניפולציות גנטיות וניתוחים מולקולריים וביוכימיים 37-39. בדיוק 959 תאים סומטיים מרכיבים את אנדרוגינוס המבוגר עם תכנית גוף פשוט כי עדיין יש כמה סוגי רקמות שונים, כולל שרירים, תאי עצב ומעי.

לבסס מודל פריון חדש בג elegans, בחרנו להביע אקסוגני גלוטמין / -rich פריון NM תחום של חלבון פריון שמרי cytosolic Sup35 asparagine המאופיין היטב (Q / N), שכן אין חלבוני פריון אנדוגני ידועים בתולעים 4,40. פריונים שמרים כבר לא יסולא בפז בהבהרת מנגנונים בסיסיים של שכפול פריון 41-44. יתר על כן, NM הוא האשוחחלבון st cytosolic כמו פריון-שהוכח לשחזר את מחזור החיים המלא של פריון בתרבית תאי יונקים 45,46. כמו כן, כאשר באו לידי ביטוי בג elegans, תחום פריון Sup35 אימץ להפליא לדרישות השונות לריבוי בתאים מטזואניים בהשוואה לתאי שמרים ותכונות עיקריות הציגו ביולוגיה פריון צבירת 40. NM הייתה קשורה עם פנוטיפ רעיל עמוק, כוללים השיבוש של יושרה ומראה של המיטוכונדריה שלפוחית ​​שונות הקשורים autophagy ברמה התאית, כמו גם מעצר עוברי וזחל, עיכוב התפתחותי, והפרעה נרחבת של סביבת קיפול חלבונים ברמת האורגניזם. באופן מפתיע, תחום הפריון מציג רעילות אוטונומית תא תא אוטונומי ובלתי, המשפיע על רקמות השכנות, שבי transgene לא באו לידי ביטוי. יתר על כן, תחבורת לפוחי של תחום הפריון בתוך ובין התאים היא פיקוח בזמן אמת In vivo 40.

כאן אנו מתארים כיצד לבחון הפצה כמו פריון-בג elegans. אנו נסביר כיצד לפקח על תחבורת התוך ובין תאית של שלפוחית ​​המכילה תחום הפריון באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הזמן לשגות. אנו להדגיש את השימוש בחיישני קיפול רקמות ספציפיות וכל מקום בגוף הביעו כתבי לחץ כדי לבדוק את השפעות תא אוטונומיות ובלתי תא אוטונומיות על כושר סלולארי. לבסוף, נתאר את ההליך של מסך הגנום ביצע לאחרונה רחב התערבות RNA (RNAi) לזהות מכפילי חדשים של רעילות עקב פריון. בשילוב, שיטות אלה יכולים לעזור ללהפריד מסלולים גנטיים מעורבים בתנועה בין תאית של חלבונים והרעילות האוטונומית מסוג התאים לא.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. ניטור Transcellular הפצת של חלבונים כמו פריון-ידי in vivo זמן לשגות הדמיה

הערה: לגדול ג elegans wild-type (WT) (N2) וקווים מהונדסים על פי שיטות סטנדרטיים ולשלוט בזהירות את טמפרטורת טיפוח 47.

  1. צור קווים מהונדסים של ג elegans המבטא את החלבון כמו פריון-, מתויג עם חלבון monomeric אדום ניאון (mRFP). צפה בסרטון זה שמדגים כיצד להשתמש microinjection 48. לפרטים נוספים ושיטות המתארים כיצד לשלב קווי extrachromosomal אלה, ראו 49.
  2. הכן אוכלוסיות מסונכרנות על ידי הטלת ביצים או הלבנת פי שיטות סטנדרטי 50.
    1. סנכרון על ידי הטלת ביצים
      1. העברה 10 - 20 מבוגרים הרה להולדת על צלחת ולתת להם להטיל ביצים ל1-2 שעות. הסר מבוגרים מן הצלחת ולתת את הצאצאים לגדול עד הגיל הרצוי.
    2. סנכרון על ידי הלבנה
      1. לאסוף אוכלוסייה מסונכרנת של מבוגרים הרה להולדת ולהלבין אותם בפתרון בסיסי היפוכלוריט (250 מ"מ NaOH ו -1: 4 v דילול (/ v) של אקונומיקה המסחרית בH 2 O). לשטוף את הביצים פעמיים (218 XG ל1 דק ') עם חיץ M9 47 (21 mMNa 2 HPO 4 · 7H 2 O, 22 mMKH 2 PO 4, 86 mMNaCl, 1 mMMgSO 4 · 7H 2 O, להוסיף DH 2 O עד 1 L).
      2. לאפשר להם לבקוע במאגר M9 עם O תסיסה עדין / N 20 ° C. פיתוח תולעת יעצור בשלב L1 בהיעדר מקור מזון, עוזב אוכלוסייה מסונכרנת. העבר את L1s על מדיה צלחות נמטודות טרי צמיחה (NGM) זורעים עם OP50 E. חיידקים וcoli לתת הצאצאים לפתח עד הגיל הרצוי 47.
  3. הכן רפידות 2% agarose (בH 2 O) בשקופית מיקרוסקופ כפי שתואר 50.
    1. הכן שני מילשקופיות croscope עם קלטת תיוג ממוקמת מעל כל אורכם כדי לשמש כמפרידים. מקום שקופית מיקרוסקופ שלישי ביניהם.
    2. לפזר agarose 2% בH 2 O וטיפה אחת פיפטה לשקופית נקייה.
    3. מקום שקופית רביעית בניצב לשלוש שקופיות אחרות על גבי הירידה אגר. לחץ בעדינות על אותו כדי לשטח את הכרית לאותו עובי כמו קלטת התיוג.
    4. תן לו להתייבש דקות 1 לפני הסרת מפרידי ומשייכתו בעדינות את השקופיות לגזרים. הכרית אגר תדבק אחד מהם.
  4. פיפטה ~ ההרדמה μl 10 (2 levamisole מ"מ במאגר M9) לכרית וההעברה ~ 10 בעלי חיים באמצעות בחירת חוט פלטינה. לכסות עם תלוש כיסוי (~ 22 x 22 מ"מ) ולקחת את התמונות בתוך שעה 1.
  5. לחלופין, לרכוש סרטים על פני תקופה ארוכה של זמן או לצמצם עוד יותר את האפשרות של כל תנועה של בעלי החיים, להשתמש בשילוב של הרדמה וחרוז קיבוע 51.
    1. הכן אגא 10%עלה רפידות (במאגר M9) כמתואר 51 ולהוסיף תולעים לפתרון סטנדרטים גודל nanosphere 3 μl (חרוזי פוליסטירן, 100 ננומטר) בתוספת 3 הרדמה μl (4 levamisole מ"מ במאגר M9). לכסות בעדינות עם להחליק את המכסה. כדי להימנע מהתייבשות, לאטום את תלוש לכסות עם VALAP (תערובת של כמויות שווה של זלין, לנולין, ושעוות פרפין).
  6. תמונה משותקת תולעים באמצעות מיקרוסקופ confocal.
    הערה: תוצאות שהושגו באמצעות דיסק מסתובב AF Confocal מיקרוסקופ מצויד במצלמת EM-CCD ותוכנה מיקרוסקופית אוטומציה וניתוח תמונה כגון MetaMorph ומתארות את הפרטים שלהלן, אך יכולות לשמש גם מערכות הדמיה confocal דומה אחרות.
    1. השתמש במטרת שמן 63X או 100X / 1.4NA ולמקם את שקופית מיקרוסקופ המכילה תולעים לתוך מחזיק שקופיות מיקרוסקופ.
    2. פתח את התוכנה. התאם כוח הלייזר ומסננים להדמית mRFP. השתמש בליזר 561 ננומטר ב 10% מסנן> 600 ננומטר כוח והפליטה.
    3. "רב ממדית רכישה" Open. תחת הלשונית "הראשית", סמן את התיבות ל" בהילוך איטי "ו-" Run כתבי עת "(חומרת פוקוס אוטומטי: כבוי).
    4. תחת הלשונית "שמירה" לבחור או ליצור את תיקיית הספרייה שבה צריכים להיות שמרו את הקבצים. להקצות שם לקובץ.
    5. תחת הלשונית "אורך הגל", בחר התאורה המתאימה ולהתאים את החשיפה ורווח. השתמש "YokoQuad אדום" (או הגדרת תאורה שווה ערך להדמית mRFP) עם חשיפה בין 100 ל 300 אלפיות שניים ורווח מצלמה בין 100 ל -300, תלוי במדגם הבודד (הוערך על ידי שימוש בתמונה החי).
    6. תחת הלשונית "ההילוך האיטי" בחר "מספר נקודות זמן" = 301, "משך" = 5 דקות ו" זמן / מרווח "sec = 1.
    7. תחת כתב העת "כתבי עת" הכרטיסייה בחר: "HOLD AFC SET Z" ו- "AFC חזור לHOLD Z", סוג: &# 8220; מיוחד "(פעמיים), נקודה ראשונית:" התחל זמן נקודה "ו-" End of נקודת זמן ". אפשרות פוקוס אוטומטי זה חשובה לתדמיתו הסעיף על פני תקופה ארוכה של זמן.
    8. כאשר ההתקנה נעשית, לחץ על "רכישה". הווידאו בהילוך האיטי הוא צפת כקבצי TIFF נפרדים.
    9. לפתוח את כל קבצי .tiff של סדרת זמן נתון בImageJ. עבור ל" תמונה "→" סטאקס "" תמונות לסטאקס "→. לחלופין, לשנות את הבהירות והניגודיות, להוסיף סרגל גודל, וכו 'לייצא את הסרט תחת "קובץ" → "שמירה בשם" → "AVI ..." (לדוגמא, ראה וידאו 1 ו -2 המתאימים לאיור 1).

2. שימוש חיישנים מתקפלים וכתבי מתח לחקר תא והתא אוטונומי ללא אוטונומי משפיע על פרוטוסטאזיס ורעילות

  1. צור קווים מהונדסים שcoexpress חיישן מתקפל או reporte מתחr יחד עם החלבון כמו הפריון. לשיטות על איך להקים צלבים או ליצור קווים מהונדסים, לראות 48,49,52. ראה בטבלת 1 רשימה של ג זני elegans, שניתן להשתמש.
  2. הכן אוכלוסיות מסונכרנות של בעלי חיים מהונדסים ולגדל אותם עד הגיל הרצוי כפי שתואר לעיל (סעיף 1.2) 50.
  3. שימוש סטראו, לבחון את הפנוטיפ בהתאמה של החיישן מתקפל או כתב מתח.
    1. לחיישן מתקפל, לקבוע את מספרם של בעלי החיים מחסה אגרגטים בכל יום לאחר הסנכרון (לדוגמא, ראה איור 2E וF).
    2. לכתב המתח, בדיקה אם Coexpression של תוצאות החלבון כמו פריון-בקרינה מוגברת של הכתב (לדוגמא, ראה איור 3).

מסך הגנום 3. לדיכוי רעילות עקב פריון בג elegans

figure-protocol-1
איור 4. ייצוג סכמטי של פרוטוקול הקרנת RNAi. ראה סעיף 3 לפרוטוקול תיאור מפורט של צעדים הבודדים.

  1. סנכרון של ג תולעי elegans ושכפול של ספריית RNAi
    1. עבור מסך RNAi, להשתמש בספריית Ahringer RNAi (או הספרייה וידאל RNAi) 53,54. Rearray ספריית RNAi מהפורמט המקורי גם 384 ל96 צלחות גם על ידי מילוי הצלחות עם תקשורת LB-מגבר 100 μl (50 מיקרוגרם / מיליליטר אמפיצילין בLB) בתוספת גליצרול 10% ולחסן באמצעות משכפל 96 פינים. לגדול ב 37 מעלות CO / N עם תסיסה ולאחסן ב -80 ° C.
    2. לשמור על ג elegans WT וקווים מהונדסים ב 20 ° C על NGM צלחות שנזרעו עם OP50 E. חיידקי coli על פי שיטות סטנדרטי 47.
    3. לסנכרן מהונדס תחום הפריון ונמטודות WT (שליטה) על ידי הלבנה (ראה סעיף 1.2).
    4. באותו היום שהתולעים מולבנים, להכין תקשורת LB בתוספת 50 מיקרוגרם / מיליליטר אמפיצילין. השתמש במתקן מגיב אוטומטי לוותר (או פיפטה באופן ידני) 65 μl של תקשורת LB-המגבר לבאר כל צלחת גם 96.
    5. הסר 96 גם צלחות ספריית Ahringer RNAi מ-80 ° C ולהביא אותם למכסה מנוע סטרילי המרופד במגבות נייר. מייד להסיר את חותם הקלטת על ידי לחיצה על הצלחת הפוכה ואילו צלחות עדיין מוקפאות, להיות זהיר, כדי למנוע זיהום מקרח בצד החיצוני של הצלחות. Reinvert הצלחות ולתת להם להפשיר במשך כ -30 דקות.
    6. טובלים משכפל 96 פינים סטרילי אחד לאחד צלחת ספריית RNAi, ולאחר מכן לתוך צלחת LB-מגבר אחד טרי. השתמש משכפל סטרילי טרי לכל צלחת. לאטום את כל הצלחות עם קלטת רדיד דבק ולהחזיר את צלחות ספרייה ל-80 ° C. יכולים להיות טבולים המשכפלים באקונומיקה, לשטוף,וautoclaved כדי לשמש שוב.
    7. לאפשר צלחות RNAi משוכפלות לגדול O / N בחממה מוגדרת 37 ° C ו -300 סל"ד. כדי להשתמש בHT115 E. coli חיידקי מחסה הווקטור הריק (L4440) כביקורת, לגדל אותו בנפרד בצינור תרבות ולאחר מכן פיפטה 65 μl של התרבות עם פיפטה רבה לרבע שתי 96 צלחות גם.
  2. אינדוקציה של ייצור dsRNA חיידקים ותוספת של תולעים
    1. לדלל איזופרופיל-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) לריכוז 5 מ"מ בDDH 2 O. השתמש בתחנת עבודה אוטומטית עם ראש רב-ערוצי לוותר (או pipet ידני) 10 μl של IPTG המדולל היטב בכל חיידקי RNAi וצלחות השליטה. יש לחתום מחדש ולמקם את הצלחות בחזרה לתוך החממה. תן להם ללחוץ על 3 שעות על 37 מעלות צלזיוס.
    2. בעוד חיידקים רועדים, להכין את התולעים. מערבבים את M9 / ההשעיה התולעת גם, ופיפטה מדגם קטן (~ 5 - 10 μl) לשקופית מיקרוסקופ זכוכית. רוזןמספר התולעים תחת סטראו ולחשב את מספר תולעים לכל μl.
    3. באמצעות טכניקה סטרילית, להכין פתרון של M9 תוספת (M9 +) עם הריכוזים הסופיים הבאים: 0.20 מ"ג / מיליליטר IPTG, 8.0 מיקרוגרם / כולסטרול מיליליטר, 50 מיקרוגרם / מיליליטר אמפיצילין, 9.6 מיקרוגרם / מיליליטר טטרציקלין, .0835 מיקרוגרם / מיליליטר Fungizone, ו 15 תולעים לכל 50 μl.
      1. הפוך את הפתרונות נפרדים למהונדס תחום פריון ותולעי WT. הנפח הסופי של פתרון תולעת M9 + הדרוש יהיו תלוי במספר צלחות RNAi המועתק (ראה להלן), בתוספת ~ 30 מיליליטר של נפח מת שיישאר במאגר, אם נעשה שימוש במתקן אוטומטי.
    4. לאחר האינדוקציה 3 שעות של ייצור dsRNA חיידקים, לקחת את הצלחות מהחממה ולתת להם להתקרר לRT (~ 30 דקות) כדי למנוע חום והדגיש את בעלי החיים.
    5. לוותר 50 μl פתרון תולעת מהונדס M9 + תחום פריון היטב בכל צלחות RNAi ואחת מצלחות בקרת וקטור הריקות. הפוךהקפד לערבב את פתרון התולעת לפני כל צעד כמו החיות נוטות משקעים התחתון של המאגר.
    6. לוותר תולעי WT לתוך צלחת השליטה השנייה. השאר את הצלחות החתומות כדי לאפשר אוורור. כדי לשמור על תרבות הנוזל מתאדה, מחסנית 4-5 צלחות ביחד ולעטוף במגבת לחה ונייר רדיד אלומיניום. לדגור על 200 סל"ד ב 20 מעלות צלזיוס למשך 4 ימים.
  3. ניקוד
    הערה: לאחר 4 ימים בחממה, התולעים יהיו ביום השני של בגרות ומוכנות למסך. תן לחיות להסתגל לתנאים שאינם רועדים למשך 30 דקות לפני ההקרנה על מנת להבטיח מתחבט באין מפריע.
    1. שימוש במצלמה פלקון 4M60 מחוברת למחשב עם צג, מסך חזותי לחבטה מוגברת בהשוואה לבעלי חיים מהונדסים תחום פריון שליטה טופלה.
    2. להרכיב רשימה של להיטים ראשוניים כדי לאשר באמצעות wrMTrck (ראה הסעיף הבא).

4. אישור ראשונילהיטי מסך

  1. assay תנועתיות על צלחות מוצקות
    1. להכין צלחות עם NGM בתוספת 100 מיקרוגרם / מיליליטר אמפיצילין, 12.5 מיקרוגרם / מיליליטר טטרציקלין וIPTG 1 מ"מ, על פי שיטות סטנדרטי 47. במידת האפשר, להשתמש במכונה לשפוך צלחת כדי להבטיח שכל הצלחות באותו גובה של תקשורת, שיאפשר לתהליך רכישת וידאו יעיל יותר.
    2. לגדול השיבוטים RNAi השונים ב~ 1 LB מיליליטר + 50 מיקרוגרם / מיליליטר אמפיצילין, O / N ב 37 ° C ו 250 סל"ד.
    3. למחרת, לגרום לביטוי של dsRNA עם IPTG 1 מ"מ לשעה 3. זרע הצלחות עם 150 μl של כל שיבוט חיידקי RNAi, התפשט לשכבה דקה. בואו חיידקים יבשים עבור 2 ימים בRT בחושך. הכן 3 צלחות לשיבוט RNAi.
    4. לסנכרן את אוכלוסיית התולעת על ידי הלבנת פי שיטות סטנדרטי 50 (ראה סעיף 1.2), ולתת לי O ביצים בוקעות / N בM9 תקשורת.
    5. לקחת דגימה של ההשעיה התולעת ולקבוע את סכום nematodes לμl בסטראו. לאחר מכן, פיפטה הנפח התקין של M9 בתוספת תולעים לכל צלחת ניסוי, כך שהוא מכיל 25 - 30 תולעי L1. לגדול נמטודות על 20 מעלות צלזיוס למשך 4 ימים עד התולעים להגיע ליום 2 בבגרות.
  2. ניתוח כמותי של תנועתיות תולעת עם תוסף wrMTrck לImageJ
    הערה: קטעי הווידאו נרשמו באמצעות stereomicroscope בהגדלה 10X במצלמה דיגיטלית C10600-10B Hamamatsu אורקה-R2 ותוכנת ההדמיה PCI Simple Hamamatsu.
    1. הפעל את המצלמה ותוכנת ההדמיה PCI Simple. לחץ על "חי" על מנת לאפשר להתאמה של תנאי ההדמיה.
    2. להגדיר את תנאי וידאו כדלקמן: רווח = 0; מצב אור = גבוה; מדד מהירות = 1; Binning = 2. לחץ על "Auto לחשוף" ולאחר מכן להתאים את תנאי התאורה, נע מראות מיקרוסקופ וחוגות בהירות והניגודיות.
      הערה: הווידאו צריכה להיות עם ניגודיות גבוהה מבלי להיות overexposed, כך שבעלי החיים מופיעים צורות שחורות כעל רקע בהיר.
    3. לחץ על "זמן סריקה" ולבחור תיקייה ושם קובץ. הגדר "שדה עיכוב" 20 אלפיות שניים ו" עצור בזמן "עד 30 שניות. לחץ על "סקירה חי" על מנת לבחור את האזור של הצלחת כדי להקליט (שבו רוב התולעים הם). הקש על הצלחת 3 או 4 פעמים על הבמה, במהירות לאשר את מעמדה בשדה הראייה ולחץ על "התחל".
    4. אחרי שהסרט מסתיים הקלטה, לחץ לחיצה ימנית על התמונה ולבחור "יצוא Montage רצף" לייצא את הסרט מפורמט .cxd לאבי.
  3. ניתוח קטעי וידאו תנועתיות
    1. פתח את תוכנת ImageJ, עבור לכרטיסיית "התוספים", ואז "wrmtrck" ובחר "אצווה wrMTrck". בחר את הספרייה המכילה את כל הקבצים להיות מנותח.
    2. בחלון הקלט העיקרי של wrMTrck_Batch, לטעון את ערכי הקלט כמפורט בfigurדואר 5C. ניתן למצוא הסבר לכל אחד מהפרמטרים בהוראות המלוות את התוסף. לחץ על "אישור" ולאפשר הפעלת ניתוח תנועה.
    3. לאצור את התוצאות ולאשר כי כל המסלולים זוהו הם מג בפועל elegans וחפצים לחסל, לפתוח כל אחד מקבצי txt שנוצרו עבור כל סרט ולהעתיק את המידע לקובץ תוכנת ניתוח נתונים. לפתוח את קבצי "* _labels.zip" נוצרו ולהפעיל את התוצאה "_labels.tif *" לבדוק באופן ידני ולחסל מסלולי תולעת שווא.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ניטור אינטר הפצה של חלבונים כמו פריון-ידי in vivo הדמיה הזמן לשגות

המהונדס C. קווי elegans להביע תחום הפריון הם גם מתאימים במיוחד לניתוח של היבטים מסוימים של חלבונים כמו פריון-, למשל, העברת תא אל התא ורעילות אוטונומית מסוג תאים לא. השקיפות של בעלי החיים מאפשר מעקב של fluorescently מתויגת חלבונים מתוך אורגניזם החי בכל שלב של חיים. מנצל את זה, תנועה של חלבונים כמ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

השיטות שתוארו כאן לעזור כדי להמחיש מתפשטים ורעילות אוטונומית תא התא המורכב אוטונומית ולא של חלבונים כמו פריון. לאחרונה גילינו שתחום פריון cytosolic צבירה מועדת הוא נלקח לתוך שלפוחית ​​קרום הנכנס בתהליך autophagy קשור. תת-קבוצה מסוימת של שלפוחית ​​אלה משלוחי תחום הפריון בתוך ובין תאים ורקמות 40. המפתח כדי לפקח על התנועה שלהם בחי הוא שהחלבון צריך להיות מתויג עם mRFP, כי רק חלבונים מתויגים mRFP נראו בשלפוחית ​​כנראה חומצי אלה. שימוש באותה הגישה, אנחנו כרגע חוקרים את כמו פר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

אנו מודים לסינדי וויזין ויוקו שיבאטה על דיון מועיל והערות ביקורתיות על כתב היד. אנו מודים למעבדה לניתוח תפוקה גבוהה (HTAL) ולמתקן ההדמיה הביולוגית (BIF) באוניברסיטת נורת'ווסטרן על הסיוע. עבודה זו מומנה על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות (NIGMS, NIA, NINDS), הקרן הרפואית אליסון וקרן דניאל פ. ועדה ל. רייס (ל-R.I.M). סי.איי.אן.-קיי. נתמך על ידי ה-Deutsche Forschungsgemeinschaft (KR 3726/1-1).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תקני גודל ריאגנט
ננוספרה 100 ננומטרThermoScientific3100A
LevamisoleSigmaL-9756
IPTGSigma15502-10G
ספריית AHRINGER RNAiמקור BioScience LifeSciences http://www.lifesciences.sourcebioscience
.com/clone-products/non-mammalian/c-elegans/c-elegans-rnai-library/
Equipment
Sorvall Legend XTR צנטריפוגה מקוררת, 120VACThermoScientific75004521http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_
XTR_Refrigerated_Centrifuge_120
VAC/EW-17707-60
משכפל 96 פינים Scionomix   http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/
HiGro שייקר דגירה בעל קיבולת גבוהה Digilabhttp://www.digilabglobal.com/higro
Multidrop Combi Reagent Dispenser Titertrekhttp://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm
Biomek FX AP96 בקמן קולטרhttp://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm
שייקר Innova44ניו ברונסוויקhttp://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&pb=d78efbc05310ec
04& פעולה=מוצרים& contentid=1&
catalognode=83389
M205 FA Leicahttp://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/
ORCA-R2 C10600-10Bמצלמת CCD מלאכותיתHamamatsuhttp://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html
מסתובב דיסק AF מיקרוסקופ קונפוקלי מצלמת Leicahttp://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/
Falcon 4M60 Teledyne Dalsa http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/
תוכנה
MetaMorph מיקרוסקופיה אוטומציה & תוכנה לניתוח תמונותמולקולרייםhttp://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html
Hamamatsu SimplePCI תוכנת ניתוח תמונהMeyer Instrumentshttp://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm
תוסף ImageJNIHhttp://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
wrMTrck עבור ImageJhttp://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html
C. elegans זנים
N2 (WT)Caenorhabditis Genetics Center (CGC)http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570
AM815                                                                                                      rmIs323[myo-3p::sup35(r2e2)::rfp]מורימוטוזמינה במעבדה שלנו 
ראה טבלה 1 למקור לחיישנים מתקפלים וזני
תחנת עבודה אוטומטית מכשירים מעבדת מדווח מתח

מקורות

  1. Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
  2. Jarrett, J. T., Lansbury, P. T. Seeding 'one-dimensional crystallization' of amyloid: a pathogenic mechanism in Alzheimer's disease and scrapie. Cell. 73 (6), 1055-1058 (1993).
  3. Caughey, B., Kocisko, D. A., Raymond, G. J., Lansbury, P. T. Aggregates of scrapie-associated prion protein induce the cell-free conversion of protease-sensitive prion protein to the protease-resistant state. Chem Biol. 2 (12), 807-817 (1995).
  4. Wickner, R. B. [URE3] as an altered URE2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae. Science. 264 (5158), 566-569 (1994).
  5. Chien, P., Weissman, J. S., DePace, A. H. Emerging principles of conformation-based prion inheritance. Annu Rev Biochem. 73, 617-656 (2004).
  6. Kimberlin, R. H., Walker, C. A. Pathogenesis of mouse scrapie: patterns of agent replication in different parts of the CNS following intraperitoneal infection. J R Soc Med. 75 (8), 618-624 (1982).
  7. Beekes, M., McBride, P. A., Baldauf, E. Cerebral targeting indicates vagal spread of infection in hamsters fed with scrapie. J Gen Virol. 79 (3), 601-607 (1998).
  8. Jucker, M., Walker, L. C. Self-propagation of pathogenic protein aggregates in neurodegenerative diseases. Nature. 501 (7465), 45-51 (2013).
  9. Aguzzi, A. Cell biology: Beyond the prion principle. Nature. 459 (7249), 924-925 (2009).
  10. Scherzinger, E., et al. Self-assembly of polyglutamine-containing huntingtin fragments into amyloid-like fibrils: implications for Huntington's disease pathology. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (8), 4604-4609 (1999).
  11. Wood, S. J., et al. alpha-synuclein fibrillogenesis is nucleation-dependent. Implications for the pathogenesis of Parkinson's disease. J Biol Chem. 274 (28), 19509-19512 (1999).
  12. Wang, Y. Q., et al. Relationship between prion propensity and the rates of individual molecular steps of fibril assembly. J Biol Chem. 286 (14), 12101-12107 (2011).
  13. Cushman, M., Johnson, B. S., King, O. D., Gitler, A. D., Shorter, J. Prion-like disorders: blurring the divide between transmissibility and infectivity. J Cell Sci. 123 (8), 1191-1201 (2010).
  14. Tanaka, M., Collins, S. R., Toyama, B. H., Weissman, J. S. The physical basis of how prion conformations determine strain phenotypes. Nature. 442 (7102), 585-589 (2006).
  15. Winkler, J., Tyedmers, J., Bukau, B., Mogk, A. Chaperone networks in protein disaggregation and prion propagation. J Struct Biol. 179 (2), 152-160 (2012).
  16. Ilieva, H., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Non-cell autonomous toxicity in neurodegenerative disorders: ALS and beyond. J Cell Biol. 187 (6), 761-772 (2009).
  17. Nussbaum-Krammer, C. I., Morimoto, R. I. Caenorhabditis elegans as a model system for studying non-cell-autonomous mechanisms in protein-misfolding diseases. Dis Model Mech. 7 (1), 31-39 (2014).
  18. Lino, M. M., Schneider, C., Caroni, P. Accumulation of SOD1 mutants in postnatal motoneurons does not cause motoneuron pathology or motoneuron disease. J Neurosci. 22 (12), 4825-4832 (2002).
  19. Li, J. Y., et al. Lewy bodies in grafted neurons in subjects with Parkinson's disease suggest host-to-graft disease propagation. Nat Med. 14 (5), 501-503 (2008).
  20. Desplats, P., et al. Inclusion formation and neuronal cell death through neuron-to-neuron transmission of alpha-synuclein. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (31), 13010-13015 (2009).
  21. Clement, A. M., et al. Wild-type nonneuronal cells extend survival of SOD1 mutant motor neurons in ALS mice. Science. 302 (5642), 113-117 (2003).
  22. Gu, X., et al. Pathological cell-cell interactions elicited by a neuropathogenic form of mutant Huntingtin contribute to cortical pathogenesis in HD mice. Neuron. 46 (3), 433-444 (2005).
  23. Yamanaka, K., et al. Mutant SOD1 in cell types other than motor neurons and oligodendrocytes accelerates onset of disease in ALS mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (21), 7594-7599 (2008).
  24. Garden, G. A., et al. Polyglutamine-expanded ataxin-7 promotes non-cell-autonomous purkinje cell degeneration and displays proteolytic cleavage in ataxic transgenic mice. J Neurosci. 22 (12), 4897-4905 (2002).
  25. Raeber, A. J., et al. Astrocyte-specific expression of hamster prion protein (PrP) renders PrP knockout mice susceptible to hamster scrapie. EMBO J. 16 (20), 6057-6065 (1997).
  26. Yazawa, I., et al. Mouse model of multiple system atrophy alpha-synuclein expression in oligodendrocytes causes glial and neuronal degeneration. Neuron. 45 (6), 847-859 (2005).
  27. Lobsiger, C. S., Cleveland, D. W. Glial cells as intrinsic components of non-cell-autonomous neurodegenerative disease. Nat Neurosci. 10 (11), 1355-1360 (2007).
  28. Sambataro, F., Pennuto, M. Cell-autonomous and non-cell-autonomous toxicity in polyglutamine diseases. Prog Neurobiol. 97 (2), 152-172 (2012).
  29. Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Prion-like spread of protein aggregates in neurodegeneration. J Exp Med. 209 (5), 889-893 (2012).
  30. Brundin, P., Melki, R., Kopito, R. Prion-like transmission of protein aggregates in neurodegenerative diseases. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (4), 301-307 (2010).
  31. Braak, H., Braak, E., Bohl, J. Staging of Alzheimer-related cortical destruction. Eur Neurol. 33 (6), 403-408 (1993).
  32. Meyer-Luehmann, M., et al. Exogenous induction of cerebral beta-amyloidogenesis is governed by agent and host. Science. 313 (5794), 1781-1784 (2006).
  33. Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338 (6109), 949-953 (2012).
  34. Clavaguera, F., et al. Transmission and spreading of tauopathy in transgenic mouse brain. Nat Cell Biol. 11 (7), 909-913 (2009).
  35. Nonaka, T., et al. Prion-like Properties of Pathological TDP-43 Aggregates from Diseased Brains. Cell Rep. 4 (1), 124-134 (2013).
  36. Lundmark, K., et al. Transmissibility of systemic amyloidosis by a prion-like mechanism. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (10), 6979-6984 (2002).
  37. Lai, C. H., Chou, C. Y., Ch'ang, L. Y., Liu, C. S., Lin, W. Identification of novel human genes evolutionarily conserved in Caenorhabditis elegans by comparative proteomics. Genome Res. 10 (5), 703-713 (2000).
  38. Xu, X., Kim, S. K. The early bird catches the worm: new technologies for the Caenorhabditis elegans toolkit. Nat Rev Genet. 12 (11), 793-801 (2011).
  39. Boulin, T., Hobert, O. From genes to function: the C. elegans genetic toolbox. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (1), 114-137 (2012).
  40. Nussbaum-Krammer, C. I., Park, K. W., Li, L., Melki, R., Morimoto, R. I. Spreading of a prion domain from cell-to-cell by vesicular transport in Caenorhabditis elegans. PLoS Genet. 9 (3), e1003351(2013).
  41. Chernoff, Y. O., Lindquist, S. L., Ono, B., Inge-Vechtomov, S. G., Liebman, S. W. Role of the chaperone protein Hsp104 in propagation of the yeast prion-like factor [psi. Science. 268 (5212), 880-884 (1995).
  42. Liu, J. J., Lindquist, S. Oligopeptide-repeat expansions modulate 'protein-only' inheritance in yeast. Nature. 400 (6744), 573-576 (1999).
  43. Halfmann, R., et al. Prions are a common mechanism for phenotypic inheritance in wild yeasts. Nature. 482 (7385), 363-368 (2012).
  44. Tyedmers, J., Madariaga, M. L., Lindquist, S. Prion switching in response to environmental stress. PLoS Biol. 6 (11), e294(2008).
  45. Krammer, C., et al. The yeast Sup35NM domain propagates as a prion in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (2), 462-467 (2009).
  46. Hofmann, J. P., et al. Cell-to-cell propagation of infectious cytosolic protein aggregates. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (15), 5951-5956 (2013).
  47. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  48. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833(2008).
  49. Transformation and microinjection. WormBook. Evans, T. C. , (2006).
  50. Methods in cell biology. Wormbooks. Shaham, S. , (2006).
  51. Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization). PLoS One. 8 (1), e53419(2013).
  52. Fay, D. Genetic mapping and manipulation: Chapter 1-Introduction and basics. WormBook. , (2006).
  53. Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30 (4), 313-321 (2003).
  54. Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Res. 14 (10B), 2162-2168 (2004).
  55. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
  56. Kern, A., Ackermann, B., Clement, A. M., Duerk, H., Behl, C. HSF1-controlled and age-associated chaperone capacity in neurons and muscle cells of C. elegans. PLoS One. 5 (1), e8568(2010).
  57. Becker, J., Walter, W., Yan, W., Craig, E. A. Functional interaction of cytosolic hsp70 and a DnaJ-related protein, Ydj1p, in protein translocation in vivo. Mol Cell Biol. 16 (8), 4378-4386 (1996).
  58. Salvaterra, P. M., McCaman, R. E. Choline acetyltransferase and acetylcholine levels in Drosophila melanogaster: a study using two temperature-sensitive mutants. J Neurosci. 5 (4), 903-910 (1985).
  59. Goloubinoff, P., Mogk, A., Zvi, A. P., Tomoyasu, T., Bukau, B. Sequential mechanism of solubilization and refolding of stable protein aggregates by a bichaperone network. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (24), 13732-13737 (1999).
  60. Schroder, H., Langer, T., Hartl, F. U., Bukau, B. D. naK. DnaJ and GrpE form a cellular chaperone machinery capable of repairing heat-induced protein damage. EMBO J. 12 (11), 4137-4144 (1993).
  61. Rampelt, H., et al. Metazoan Hsp70 machines use Hsp110 to power protein disaggregation. EMBO J. 31 (21), 4221-4235 (2012).
  62. Gupta, R., et al. Firefly luciferase mutants as sensors of proteome stress. Nat Methods. 8 (10), 879-884 (2011).
  63. Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
  64. Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (35), 14914-14919 (2009).
  65. Karady, I., et al. Using Caenorhabditis elegans as a model system to study protein homeostasis in a multicellular organism. J Vis Exp. (82), e50840(2013).
  66. Gidalevitz, T., Krupinski, T., Garcia, S., Morimoto, R. I. Destabilizing protein polymorphisms in the genetic background direct phenotypic expression of mutant SOD1 toxicity. PLoS Genet. 5 (3), e1000399(2009).
  67. Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (16), 10417-10422 (2002).
  68. Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model. J Neurosci. 26 (29), 7597-7606 (2006).
  69. Mohri-Shiomi, A., Garsin, D. A. Insulin signaling and the heat shock response modulate protein homeostasis in the Caenorhabditis elegans intestine during infection. J Biol Chem. 283 (1), 194-201 (2008).
  70. Libina, N., Berman, J. R., Kenyon, C. Tissue-specific activities of C. elegans DAF-16 in the regulation of lifespan. Cell. 115 (4), 489-502 (2003).
  71. Schatzl, H. M., et al. A hypothalamic neuronal cell line persistently infected with scrapie prions exhibits apoptosis. J Virol. 71 (11), 8821-8831 (1997).
  72. Keith, S. A., Amrit, F. R., Ratnappan, R., Ghazi, A. The C. elegans healthspan and stress-resistance assay toolkit. Methods. , (2014).
  73. Pierce-Shimomura, J. T., et al. Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (52), 20982-20987 (2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

C elegansTime lapseRNAiWorm TrackerThrashing

מאמרים קשורים