מאמר שיטה

הכנה ואפיון של SDF-1α-Chitosan-Dextran סולפט חלקיקים

DOI:

10.3791/52323

⸱

22 בינואר 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital and Harvard Medical School, 2Laboratory for Biomaterials and Drug Delivery, Department of Anesthesiology, Division of Critical Care, Boston Children's Hospital

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מטרת פרוטוקול זה היא לשלב SDF-1α, גורם ביות של תאי גזע, בננו-חלקיקי דקסטרן סולפט-צ'יטוזן. החלקיקים המתקבלים נמדדים לפי גודלם ופוטנציאל הזטה שלהם, כמו גם התוכן, הפעילות וקצב השחרור במבחנה של SDF-1α מהננו-חלקיקים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chitosan (CS) ו-dextan sulfate (DS) הם פוליסכרידים טעונים (גליקנים), היוצרים ננו-חלקיקים מבוססי קומפלקס פוליאלקטרוליטים כאשר הם מעורבבים בתנאים מתאימים. ננו-חלקיקי הגליקן הם נשאים שימושיים לגורמי חלבון, המאפשרים אספקה in vivo של החלבונים ושומרים על שמירתם ברקמה הממוקדת. מתחמי הפוליאלקטרוליטים הגליקניים אידיאליים גם לאספקת חלבונים, שכן השילוב מתבצע בתמיסה מימית, מה שמפחית את הסבירות להשבתת החלבונים. חלבונים עם אתר קשירת הפרין נצמדים לדקסטרן סולפט בקלות, והם בתורם מיוצבים על ידי הקשירה. חלקיקים אלה גם פחות דלקתיים ורעילים כאשר הם מועברים in vivo. בפרוטוקול המתואר להלן, SDF-1α (Stromal cell-derived factor-1α), גורם ביות של תאי גזע, מעורבב תחילה ומודגר עם דקסטרן סולפט. צ'יטוזן מתווסף לתערובת ליצירת קומפלקסים פוליאלקטרוליטים, ואחריו אבץ גופרתי לייצוב הקומפלקסים עם גשרי אבץ. חלקיקי SDF-1α-DS-CS המתקבלים נמדדים עבור גודל (קוטר) ומטען פני השטח (פוטנציאל זטה). נקבעת כמות ה-SDF-1α המשולבת, ואחריה מדידות של קצב השחרור שלו במבחנה ופעילותו הכימוטקטית בצורה קשורה לחלקיקים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סולפט dextran (DS) וchitosan (CS) הם סוכרים עם מטען שלילי בין מספר קבוצות החליפו סולפט (בDS), או קבוצות האמינים טעונות חיובי (deacetylated CS). כאשר מעורב בתמיסה מימית, שני סוכרים יצירת קומפלקסי polyelectrolyte דרך אינטראקציות אלקטרוסטטיות. המתחמים וכתוצאה מכך עלולים ליצור אגרגטים גדולים שיהיה לשלב מופרדים מהתמיסה המימית (משקעים), או חלקיקים קטנים שמים מסיסים (קולואידים). התנאים הספציפיים שתורמים לתוצאות אלה נחקרו רבים, וכבר סיכמו ומאוירים בפירוט בביקורת האחרונה 1. בין תנאים אלה, שתי דרישות בסיסיות לייצור חלקיקים מסיסים מים חייבים 1) יש לי הפולימרים הטעונים ההפוך מסה טוחנת שונה באופן משמעותי; ו -2) להיות מעורב ביחס הלא stoichiometric. תנאים אלה יאפשר מגזרי פולימרי complexed תשלום ניטראלי שנוצרו על ידי תשלוםנטרול להפריד ויוצר את הליבה של החלקיקים, והפולימרים העודפים כדי ליצור את המעטפת החיצונית 1. חלקיקי הסוכרים שתוארו בפרוטוקול זה נועדו למסירת ריאתי, ונועדו להיות נקי טעונים שלילי, וממדי ננומטר. תשלום המשטח השלילי מפחית את הסבירות של ספיגה התאית של החלקיקים 2,3. חלקיקים של ממד ננומטר להקל על המעבר בדרך נשימת דיסטלי. כדי להשיג מטרה זו, הסכום של DS בשימוש בתכשיר זה הוא בעודף של CS (יחס משקל 3: 1); וגבוה מולקולרי משקל-DS (MW משקל הממוצע 500,000) ומשקל מולקולרי נמוך CS (טווח MW 50-190 kDa, 75-85% deacetylated) משמש.

SDF-1α הוא גורם ביות של תאי גזע, אשר מפעיל את פונקצית הביות באמצעות פעילות chemotactic. SDF-1α ממלאים תפקיד חשוב בביות ותחזוקה של תאי גזע hematopoietic במח העצם, ובגיוס של progeתאי nitor לרקמה ההיקפית ל4,5 תיקון פציעה. יש SDF-1α אתר מחייב הפרין ברצף החלבון שלה, המאפשר לחלבון להיקשר להפרין / הפאראן גופרתי, הדימרים צורה, להיות מוגן מפני פרוטאז (CD26 / DPPIV) איון, ואינטראקציה עם תאי מטרה באמצעות קולטנים בתא השטח 6-8. יש DS תכונות מבניות דומות להפרין / הפאראן גופרתי; כך, המחייב של SDF-1α לDS יהיה דומה לזה של ligands פולימרים הטבעי שלה.

בפרוטוקול הבא, אנו מתארים את ההכנה של ננו-חלקיקי SDF-1α-DS-CS. הנהלים מייצגים את אחד הניסוחים שנחקרו בעבר 9. הפרוטוקול מותאם במקור מחקירה של חלקיקי VEGF-DS-CS 10. הכנה בקנה מידה קטנה מתוארת, אשר ניתן לשנותם בקלות עם אותו פתרונות המניות ותנאי הכנה. לאחר הכנה, החלקיקים מאופיינים בy בחינת גודלם, פוטנציאל זטה, התאגדות SDF-1α מידה, במבחנה זמן שחרור, ופעילות של SDF-1α המשולבים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת SDF-1α סוכרי חלקיקים

בשל צורך משלוח in vivo, לעקר את כל המכולות, טפטפות, וטיפים לשימוש בתכשיר.

  1. הכן את פתרונות המניות הבאות בultrapure מים: 1% סולפט dextran; 1 M NaOH (סטרילי מסונן עם קרום PES); chitosan 0.1% 0.2% בחומצה אצטית קרחונית (מסנן דרך 0.8 ו0.22 מיקרומטר מסננים ברציפות ולהתאים את ה- pH 5.5 עם NaOH לאחר מכן); 0.1 M 4 ZnSO; מניטול 15%; ו0.92 מ"ג / מיליליטר SDF-1α (מאוחסנים בaliquots על 80 מעלות צלזיוס, ושמרו על 4 מעלות צלזיוס מופשרים פעם אחת).
  2. לעקר פתרונות מניות באמצעות 0.22 מיקרומטר ממברנות סינון. להעריך את רמות רעלן פנימיות בפתרון מוכן עם assay lysate amebocyte Limulus קריש ג'ל (LAL). ודא שהרמות הן <0.06 איחוד אירופי / מיליליטר.
  3. להוסיף 0.18 מיליליטר מים ultrapure לבקבוקון זכוכית 1.5 מיליליטר מכיל בר ומערבבים מגנטי. קבע את המהירות ומערבבים ב 800 סל"ד. להוסיף 0.1 מיליליטר 1%סולפט וdextran מערבב במשך 2 דקות. להוסיף SDF-1α 0.08 מ"ג (0.087 מיליליטר של 0.92 מ"ג / מיליליטר SDF-1α פתרון) ומערבבים במשך 20 דקות.
  4. להוסיף 0.33 מיליליטר 0.1% dropwise chitosan ומערבבים במשך 5 דקות. מהירות שינוי ומערבבים עד למקסימום ולהוסיף 0.1 מיליליטר 0.1 M 4 ZnSO לאט עם מזרק 0.1 מיליליטר (מעל 1 דקות).
  5. לחזור במהירות ומערבבים עד 800 סל"ד ומערבבים למשך 30 דקות. להוסיף מניטול 0.4 מיליליטר של 15% ומערבבים במשך 5 דקות. מעביר את תערובת התגובה לצינור 1.5 מיליליטר microfuge. צנטריפוגה ב16,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    הערה: הנוכחות של מניטול מאפשרת resuspension של החלקיקים לאחר צנטריפוגה. בהתאם לקומפקטיות של גלולה, ריכוז מניטול יכול להיות מגוון בין 0% ל -5%. resuspension המלא של החלקיקים לאחר כל צנטריפוגה הוא קריטי כדי למנוע אגרגטים בהשעיה הסופית.
  6. לשאוב supernatant ולהשתמש פיפטה להסיר את הטיפה האחרונה של נוזל לאט. להוסיף מניטול 0.2 מיליליטר 5%. להשעות את גלולה עם 0.5 מיליליטר, לבית 29 Gמזרק DLE. להוסיף מניטול 1 מיליליטר של 5%. צנטריפוגה XG ב 16,000 במשך 15 דקות.
  7. חזור על שלב 1.6.
  8. לשאוב supernatant. Resuspend גלולה במניטול 0.2 מיליליטר 5%. אחסן את ההשעיה החלקיקים ב 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: ההשעיה החלקיקים יכולה גם להיות מאוחסנת קפוא ב -80 ° C או lyophilized. מניטול 5% כולל בהשעיה הוא חיוני כדי למנוע הצטברות של החלקיקים לאחר ההקפאה והפשרה או אחרי lyophilization והתייבשות. מניטול ניתן להסיר על ידי צנטריפוגה של ההשעיה לאחר האחסון.

2. מדידה של גודל חלקיקים ופוטנציאל זטה

גודל החלקיקים ופוטנציאל זטה מנותחים על ידי פיזור אור דינמי ופיזור אור electrophoretic, בהתאמה, עם נתח של חלקיקים שצוין ברשימת חומר.

  1. להגדיר את הפרמטרים הבאים למדידת גודל חלקיקים: פעמים צבירה: 70; פעמים חוזרות: 4; טמפרטורה: 25 ° C;Diluent: מים; התאמת עוצמת: אוטומטי.
  2. לדלל את מדגם SDF-1α-DS-CS עם מים (דילול של פי 10). לטעון של המדגם לקובט UV חד פעמי 100 μl כגון קובט אפנדורף. הכנס את קובט לתוך מחזיק התא. חכה להתאמת עוצמת להגיע "אופטימום" (~ 10,000 CPS). התחל רכישת נתונים.
  3. לאחר המדידה תושלם, תרשום את תוצאות cumulants של קוטר (ננומטר) ומדד polydispersity. ממוצע התוצאות שהתקבלו מכל אחד 4 הקריאות החוזרות ולחשב את סטיית התקן.
  4. עומס 500 μl של מדגם חלקיקים בדילול של פי 10 לתא זרימה למדידת פוטנציאל זטה. להגדיר את הפרמטרים הבאים למדידה: פעמים צבירה: 10; פעמים חוזרות: 5; טמפרטורה: 25 ° C; Diluent: מים; התאמת עוצמת: אוטומטי. רשום את התוצאות של פוטנציאל זטה (mV). ממוצע התוצאות המתקבלות מכל אחד 5 קריאות חוזרות ונשנות, ולחשב את deviatio הסטנדרטיn.

3. כימות של SDF-1α בחלקיקים

  1. לדלל צורת SDF-1α חופשיות לריכוזים של 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05 ומ"ג / מיליליטר במאגר מדגם 1.3x Laemmli. לדלל דגימות SDF-1α-DS-CS 6 μl עם 1.3x 40 μl חיץ מדגם Laemmli. (הכן את חיץ מניית 4x Laemmli מכיל 0.25 M טריס-HCl, pH 7.5, 8% SDS, גליצרול 40%, 0.05 מ"ג / 8% 2-mercaptoethanol מיליליטר bromophenol כחול, ו. מחלקים את פתרון המניות לתוך aliquots הקטן ולשמור ב -20 ° C לשימוש יחיד.)
  2. מחממים את הדגימות ב 100 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. מערבולת הדגימות פעמיים (כל אחד במשך 10 שניות במהירות המרבית) בזמן חימום 10 דקות על מנת לנתק את החלקיקים לחלוטין. לצנן את הדגימות לRT למשך 2 דקות. צנטריפוגה ב10,000 XG ל0.5-1 דקות כדי להפיל את עיבוי המים. מערבולת שוב לערבב היטב.
    הערה: בשלב זה, פתרון המדגם צריך להיות ברור שאין הווה משקע גלוי.
  3. טען 10 ו# 181; l מדגם / גם לג'ל SDS 4-20%. הפעל אלקטרופורזה ב 200 V עבור 20 דקות. כתם ג'ל עם כתם חלבון הכחול Coomassie.
  4. לבחון את צפיפות להקת חלבון של SDF-1α באמצעות תוכנת תרמי וניתוח צפיפות מולקולרית. לחשב את כמות SDF-1α בחלקיקים נגד עקומת סטנדרט נבנתה בסטנדרטים SDF-1α חופשיים.

4. במבחנת השחרור Assay

  1. לערבב חלקיקי סוכרי SDF-1α עם פוספט שנאגרו מלוח של Dulbecco ללא סידן ומגנזיום (D-PBS) בשעה 1: 1 (V / V).
  2. מחלקים את ההשעיה החלקיקים לתוך 0.05 aliquots מיליליטר ב 1.5 מיליליטר צינורות. טען את הדגימות לתחתית הצינורות. הימנע החדרת בועות אוויר או להפריע את פני השטח של הנוזל. לאטום את חלקו העליון של הצינורות עם Parafilm.
    הערה: בכך, הנוזל יישאר בתחתית בסיבוב העליון לתחתון שלאחר מכן על מיקסר הצינור.
  3. סובב את הצינורות על 37 ו# 176; C במיקסר מיקרו-Tube סיבוב. הסר aliquots מהצינורות במועדים המיועדים צנטריפוגות מייד הדגימות ב16,000 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C.
  4. הפרד את supernatants וכדורים, ולשקם את הכדור עם 0.05 מיליליטר D-PBS. אחסן את הדגימות ב -20 ° C. אחרי הכל הדגימות שנאספו, לבחון את supernatants וכדוריות על ג'ל SDS כפי שתואר לעיל.

5. ההגירה Assay

assay זה מודד את פעילות chemotactic של SDF-1α. אינטראקציה של SDF-1α עם קולטה (CXCR4) על פני התא גורמת להגירה של התא לכיוון שיפוע SDF-1α. ב assay זה, התאים נטענים לתוך היטב עליון (מופרד על ידי קרום semipermeable מנמוך גם) פתרון וSDF-1α לנמוכים גם.

  1. לדלל SDF-1α (חינם או בצורה מאוגדת חלקיק) עם חיץ הגירה (בינוני RPMI-1640 המכילים 0.5% אלבומין בסרום שור) ב3-FOדילול סדרתי ld לריכוזים סופיים של 100, 33, 11, 3.7, 1.2, 0.41, 0.14, 0.05 וng / ml.
  2. להוסיף 0.6 מיליליטר של פתרון SDF-1α המדולל או חיץ הגירה (בקרה שלילית) רק כדי גם בצלחת 24 גם. הוסף חוצץ הגירה 0.57 מ"ל לטוב (שליטת תא קלט). לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. הנח להכניס את תרבות תא חדירה כגון Transwell (גודל נקבובית 5 מיקרומטר, בקוטר 6.5 מ"מ) על גבי נמוך גם. טען 0.1 מיליליטר תאי Jurkat (5 × 10 5) לTranswell להכניס. לטעון 0.03 מיליליטר תאים ישירות לשליטת תא הקלט היטב. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 2 ב5% CO 2 באינקובטור.
  3. הסר את מוסיף Transwell. העבר את התאים שהגרו לבארות התחתונות לצינור קלקר 4 מיליליטר. ספירת התאים נדדו עם cytometer זרימה.
  4. לחשב הגירה כאחוז ממספר תאי קלט (מספר תאים בשליטת תא הקלט היטב x 100/30) לאחר החיסור של המספרים בnegative פקדים (תאים היגרו לבארות המכילות מאגר הגירה בלבד).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פוטנציאל הגודל וzeta של חלקיקי SDF-1α-DS-CS מוכנים נקבעים עם מנתח חלקיקים. איור 1 מציג את הניתוח של מדידת הגודל. מהתוצאות שהתקבלו מcumulants ארבע מדידות חוזרות, הקוטר הידרודינמית הממוצע של חלקיקי SDF-1α-DS-CS הוא 661 ± 8.2 (ננומטר) וpolydispersity הוא 0.23 ± 0.02. התוצאה של מדידת פוטנציאל זטה מוצגת באיור 2. מחמש מדידות חוזרות, פוטנציאל זטה של חלקיקי SDF-1α-DS-CS הוא -24.8 ± 0.5 mV. כפי שצוין לעיל, הנוכחות של מניטול 5% בהשעית חלקיקי SDF-1α-DS-CS הי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כפי שצוין לעיל, נוצרים חלקיקי DS-CS באמצעות נטרול מטען בין polyanion (DS) וpolycation מולקולות (CS). מאז האינטראקציה תשלום מתרחשת בקלות במהלך ההתנגשות המולקולרית, הריכוז של פתרונות הפולימר ומהירות ערבוב במהלך הערבוב הוא קריטי לגודל של החלקיקים שנוצר. מגמה כללית היא שיותר מדוללת פתרונות DS וCS 15 ותוצאת מהירות ערבוב גבוהה יותר בחלקיקים קטנים יותר.

גיבוש חלקיקי סוכרי SDF-1α יכול להיות מגוון. לדוגמא, בסכו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH: HL671795, HL048743, וHL108630.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
דקסטרן סולפטפישרBP1585-100
צ'יטוזן, משקל מולקולרי נמוך Sigma448869
אבץ גופרתי הפטהידראטסיגמא204986
D-מניטולSigmaM9546
מים טהורים במיוחד Invitrogen 10977-023
SDF-1&אלפא;הוכן על פי הפניה 8.
מסנן מזרק, ממברנת PES 0.22  μ mMilliporeSLGP033RS
מוטות מיקרו ערבוב מגנטיים (2  x  7  מ"מ)פישר 14-513-63
ערכת בקבוקון זכוכית; סאן-סריפישר 14-823-182
מנתח חלקיקים Delsa Nano C בקמן קולטר
אפנדורף UVette CuvetsEppendorf952010069
4– 20% Mini-PROTEAN TGX ג'לBio-Rad456-1096
GelCode כחול בטוח חלבוןכתמי Fisher PI-24592
הדמיה מולקולרית VersaDoc MP 4000 מערכתBioRad170-8640
Corning Transwell חדיר תומךבקורנינג3421
Accuri C6 ציטומטר זרימהBD Biosciences
Dulbecco' s פוספט חוצץ מלח סיגמאD8537
Pyrogent פלוס קיטפישרNC9753738

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Delair, T. Colloidal polyelectrolyte complexes of chitosan and dextran sulfate towards versatile nanocarriers of bioactive molecules. Eur J Pharm Biopharm. 78 (1), 10-18 (2011).
  2. Morachis, J. M., Mahmoud, E. A., Almutairi, A. Physical and chemical strategies for therapeutic delivery by using polymeric nanoparticles. Pharmacol Rev. 64 (3), 505-519 (2012).
  3. Yue, Z. G., et al. Surface charge affects cellular uptake and intracellular trafficking of chitosan-based nanoparticles. Biomacromolecules. 12 (7), 2440-2446 (2011).
  4. Ghadge, S. K., Muhlstedt, S., Ozcelik, C., Bader, M. SDF-1alpha as a therapeutic stem cell homing factor in myocardial infarction. Pharmacol Ther. 129 (1), 97-108 (2011).
  5. Sharma, M., Afrin, F., Satija, N., Tripathi, R. P., Gangenahalli, G. U. Stromal-derived factor-1/CXCR4 signaling: indispensable role in homing and engraftment of hematopoietic stem cells in bone marrow. Stem Cells Dev. 20 (6), 933-946 (2011).
  6. Sadir, R., Baleux, F., Grosdidier, A., Imberty, A., Lortat-Jacob, H. Characterization of the stromal cell-derived factor-1alpha-heparin complex. J Biol Chem. 276 (11), 8288-8296 (2001).
  7. Amara, A., et al. Stromal cell-derived factor-1alpha associates with heparan sulfates through the first beta-strand of the chemokine. J Biol Chem. 274 (34), 23916-23925 (1999).
  8. Sadir, R., Imberty, A., Baleux, F., Lortat-Jacob, H. Heparan sulfate/heparin oligosaccharides protect stromal cell-derived factor-1 (SDF-1)/CXCL12 against proteolysis induced by CD26/dipeptidyl peptidase IV. J Biol Chem. 279 (42), 43854-43860 (1074).
  9. Yin, T., et al. SDF-1alpha in glycan nanoparticles exhibits full activity and reduces pulmonary hypertension in rats. Biomacromolecules. 14 (11), 4009-4020 (2013).
  10. Huang, M., Vitharana, S. N., Peek, L. J., Coop, T., Berkland, C. Polyelectrolyte complexes stabilize and controllably release vascular endothelial growth factor. Biomacromolecules. 8 (5), 1607-1614 (2007).
  11. McCall, R. L., Sirianni, R. W. PLGA nanoparticles formed by single- or double-emulsion with vitamin E-TPGS. J Vis Exp. (82), 51015(2013).
  12. Carrillo-Conde, B. R., Roychoudhury, R., Chavez-Santoscoy, A. V., Narasimhan, B., Pohl, N. L. High-throughput synthesis of carbohydrates and functionalization of polyanhydride nanoparticles. J Vis Exp. (65), 3967(2012).
  13. Xu, J., Amiji, M. Therapeutic gene delivery and transfection in human pancreatic cancer cells using epidermal growth factor receptor-targeted gelatin nanoparticles. J Vis Exp. (59), e3612(2012).
  14. Lauten, E. H., et al. Nanoglycan complex formulation extends VEGF retention time in the lung. Biomacromolecules. 11 (7), 1863-1872 (2010).
  15. Schatz, C., Domard, A., Viton, C., Pichot, C., Delair, T. Versatile and efficient formation of colloids of biopolymer-based polyelectrolyte complexes. Biomacromolecules. 5 (5), 1882-1892 (2004).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

SDF 1SDF 1SDS

מאמרים קשורים