Microdissection לכידת לייזר - הפגנה של הבידוד של פרט דופמין נוירונים ופינת הגחון tegmental השלם

Summary

הבידוד של נוירונים דופמין הבודדים או אזור tegmental הגחון עם אימונוהיסטוכימיה ישירה או עקיפה מודגם באמצעות microdissection ללכוד לייזר. פרמטרים לבידודה של רקמה משקופיות זכוכית באמצעות לייזר אינפרא אדום ומשקופיות קרום באמצעות השילוב של לייזר אינפרא אדום ואולטרא-סגול הם דנו.

Abstract

microdissection ללכוד לייזר (LCM) משמש כדי לבודד אוכלוסייה מרוכזת של תאים בודדים או אזורים אנטומיים מדויקים של רקמה מסעיפי רקמות על שקופיות מיקרוסקופ. בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה, LCM יכול לשמש כדי לבודד סוגי תאים בודדים המבוססים על סמן חלבון ספציפי. כאן, טכניקת LCM מתוארת לאיסוף אוכלוסייה ספציפית של נוירונים דופמין שכותרתו ישירות עם אימונוהיסטוכימיה hydroxylase טירוזין ובידוד של נוירון דופמין המכיל אזור של אזור tegmental הגחון באמצעות אימונוהיסטוכימיה hydroxylase טירוזין העקיפה על סעיף סמוך לאלה המשמשים לLCM. לייזר ללכוד אינפרא אדום (IR) משמש לשניהם לנתח נוירונים בודדים, כמו גם את אזור tegmental הגחון את שקופיות זכוכית ועל כובע LCM לניתוח. התייבשות מוחלטת של הרקמה עם 100% אתנול וקסילן היא קריטית. השילוב של הלייזר ללכוד IR ואולטרה הסגול cutti (UV)לייזר ng משמש לבודד תאי עצב בודד או דופמין אזור tegmental הגחון בעת ​​שימוש בשקופיות קרום PEN. יש שקופית קרום PEN יתרונות משמעותיים על פני שקופיות זכוכית כפי שהוא מציע עקביות טובה יותר בלכידת ואיסוף תאים, הוא מהיר יותר איסוף חתיכות גדולות של רקמה, היא פחות סומך על התייבשות ותוצאות בהסרת הרקמה מהשקופית מלאה. למרות הסרת האזורים הגדולים של רקמה משקופיות זכוכית אינה ריאלי, זה הרבה יותר זמן רב ולעתים קרובות משאיר כמה רקמות שיורית מאחור. הנתונים שמוצגים כאן להוכיח כי ניתן להשיג RNA בכמות ובאיכות מספקות באמצעות נהלים אלה למדידות PCR כמותי. למרות RNA ו- DNA הם המולקולות הנפוצות ביותר המבודדים מרקמות ותאים שנאספו עם LCM, בידוד ומדידה של microRNA, חלבון ושינויים אפיגנטיים בDNA יכול גם ליהנות מהרזולוציה אנטומיים וסלולרית המשופרות שהושג באמצעות LCM.

Introduction

כל הרקמה מורכבת מאוכלוסייה הטרוזיגוטיים של תאים. זה רלוונטי במיוחד לרקמת מוח, בהיקף של נוירונים שונים מובחנים מורפולוגית ו / או neurochemically מוקף סוגים שונים של תאי גליה (oligodendrocytes, מיקרוגליה והאסטרוציטים). בנוסף, אזורים שונים במוח, כגון אזורים של גרעיני קליפה או גזע המוח, יש פונקציות ספציפיות. לכן, היכולת לבודד אוכלוסיות ספציפיות של תאים או באזורים שונים מבחינה אנטומית קטנים מאוד, בשילוב עם טכניקות אנליטיות (כלומר, Q-PCR, microarrays, RNA-רצף, ופרוטאומיקה), יכול לשפר במידה ניכרת ההבנה של תהליכים ביולוגיים שונים. LCM הוא טכנולוגיה המספקת את היכולת לבודד אזורים אנטומיים מאוד דיסקרטיים או תאים ספציפיים מהרקמה בשקופית מיקרוסקופ מתן הרבה יותר הומוגנית מקור לניתוח נוסף של מולקולות שונות, כגון RNA, מייקרו-רנ"א, DNA וחלבונים.

t "> מאז LCM הוצג לראשונה, מספר גישות שונות שימשו לmicrodissect תאים מרקמות ^1-3. הגישות המוקדמות כללו קובץ מצורף ישיר של רקמה בשקופית באמצעות לייזר אינפרא אדום (IR) וסרט תרמופלסטיים ואי שיטת קשר באמצעות אולטרא-סגול (UV) חיתוך לייזר לנתק תא או רקמה וגבייה לתוך צינור. בהמשך לכך, LCM שמש בהצלחה במגוון רחב של רקמות וסוגי תאים והוצג להיות תואמת עם בידוד של מולקולות שונות לניתוח במורד הזרם כולל RNA, מייקרו-רנ"א, DNA, חלבונים ו, הכולל את הפעילות האנזימטית ^1,4-7. הנה LCM מודגם באמצעות מערכת LCM שנעשה שימוש בליזר UV חיתוך וליזר IR לכידה לחיתוך סביב תאים או רקמות וההצמדה ל כובע LCM, בהתאמה. מערכת זו משתמשת בשני LCM הלייזר ללכוד IR כדי להמס סרט פלסטיק על כובע מעל לתא או הרקמה של עניין שמתחבר לתאים סרט הפלסטיק ומסיר אותו מtהוא רקמה עם הסרת הכובע (איור 1). בנוסף, בשילוב עם לייזר IR, לייזר UV נגיש לחתוך מן רקמה או תאים של ריבית מהרקמה רכובה על שקופיות עם קרום מבודד אז על ידי הצמדת הרקמה לכובע LCM באמצעות לייזר IR (איור 2). סקירה קצרה של טכניקות אלה נמצאת באיורים 1 ו -2.

כמה וריאציות על טכניקה זו מתוארות לכל אחד בודד תאים ספציפיים באמצעות אימונוהיסטוכימיה ניאון ישירה וטכניקה מודרכת אימונוהיסטוכימיה עקיפה המשמשת לבידוד של אזור של רקמה המבוסס על הביטוי של חלבון מסוים. באופן ספציפי, הבידוד של נוירונים דופמין מnigra substantia והבידוד של אזור tegmental הגחון והבידוד הבא של RNA מרקמת המוח טרי, קפואה מוצג. כRNA הוא יציב ביותר של מולקולות נמדדות (בהשוואה ל- DNA או חלבון), רח 'eps כדי לעזור לשמור על שלמות RNA כלולים והנתונים המוצגים על הכמות והאיכות של RNA שהושגה.

Protocol

הערה: רקמת מוח מעכברים שימשה על פי המכון הלאומי לבריאות מדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה, ופרוטוקולי מחקר אושרו על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת מדינת מיסיסיפי.

1. הכנת השקופיות ורקמות

1. השתמש באחת שקופיות Silane-הכנה או napthalate פוליאתילן (PEN) שקופיות זכוכית קרום.
2. לבידוד RNA, שקופיות לטבול בתמיסת חיטוי RNase, לשטוף 3 פעמים עם מים RNase ללא לאחר מכן ליבש עם סדרה מדורגת של אתנול יבש ואבק RNase ללא למשך 30 דקות.
3. לחתוך קטעי רקמה בעובי 10 מיקרומטר באמצעות cryostat והר בשקופיות חופשיות RNase מוכנות. שמור את הסעיפים קפוא במהלך חתך לשמר את איכות RNA.
   הערה: ודא שהרקמה היא כ 4 מ"מ מהקצוות של השקופית כLCM לא יכול להסיר את הרקמה שקרובה מדי לקצוות של השקופית. ביורדr להסרת רקמה מן שקופית קרום PEN, להבטיח שהרקמה היא 4 מ"מ מהשמאל, העליון והתחתון ו -7 מ"מ מהצד הימני של השקופית שהממדים של הקרום שאינו מחובר לשקופית.
4. לבידוד של אוכלוסיות תאים בודדות באמצעות אימונוהיסטוכימיה ישירה, רקמת סעיף על שתי שקופיות Silane-הכנה או שקופיות קרום PEN. לבידוד של אזורים של רקמה באמצעות טכניקות מודרכות אימונוהיסטוכימיה העקיפה, הר סט אחד סעיפים בשקופית Silane-prep אימונוהיסטוכימיה וחתכים חלופיים משני שקופיות PEN קרום ו / או שקופיות Silane-prep לשמש לLCM.

הכנת רקמות 2. ללכידת לייזר - Rapid טירוזין hydroxylase אימונוהיסטוכימיה ללכידת לייזר ישיר של תאי immunoreactive

1. מתאר רקמה עם עט הידרופובי ולאפשר לו להתייבש.
2. לתקן רקמות באצטון-מתנול (1: 1) פתרון ב -20 ° C למשך 10 דקות.
   הערה: Ouניסיון r הוכיח כי קיבעון אצטון-מתנול הביא אימונוהיסטוכימיה הרבה יותר עקבית מאשר אצטון או מתנול לבד.
3. שקופית שטיפה בפוספט שנאגרו מלוחה (PBS) עם 1% Triton (RNase חינם).
4. סעיפי כיסוי עם μl PBS 100-200 עם 1% Triton עם נוגדן hydroxylase טירוזין בדילול 1: 100 עם 400 U / ml RNasin. דגירה למשך 5-10 דקות.
5. בקצרה לשטוף בPBS פעמיים וPBS-1% Triton.
6. לכסות רקמה עם 100-200 μl של IgG נגד ארנב העז שכותרתו עם Alexa פלואוריד 488 בדילול 1: 100 ב% Triton PBS-1 עם 400 U RNasin / מיליליטר ו -50 ng / ml DAPI. דגירה של 5 דקות.
7. לשטוף 2 פעמים ב PBS אז ליבש 30 שניות בסדרה מדורגת של אתנול חופשי RNase (75% -75% -95% -95% -100% -100%).
8. דגירה בשתי שטיפות של קסילן דקות 1 ולאחר מכן 5 דקות.
9. הסר שקופיות מקסילן מייד לפני שימוש לLCM ולאפשר לאוויר יבש.

הכנת 3. רקמות ללכידת לייזר - טירוזיןHydroxylase אימונוהיסטוכימיה ללכידת לייזר עקיף של אזורי immunoreactive

1. שקופית תהליך אחד עם חלקים סמוכים לסעיפים רכובה על Silane-הכנה ו / או שקופיות קרום PEN אימונוהיסטוכימיה.
   הערה: נהלים המשמשים כאן דומים לאלו שדווחו בעבר ^5. לתמונות ההפגנה, תגובת כרומגן diaminobenzidine (DAB) שימשה כדי להמחיש את הנוירונים hydroxylase טירוזין של עניין.
2. לשקופיות המשמשות לLCM, לתקן במשך 5 דקות באצטון 100% ב 4 מעלות צלזיוס.
3. מייבשי רקמות בסדרה מדורגת של אתנול חינם RNase (75% -75% -95% -95% -100% -100%) 1 דקות כל אחד.
4. דגירה בשתי שטיפות של קסילן דקות 1 ולאחר מכן 5 דקות.
5. הסר שקופיות מקסילן מייד לפני שימוש לLCM ולאפשר לאוויר יבש.

4. שימוש במערכת Microdissection לכידת הלייזר

הערה: יש יישום התכנית LCM 10 ברים כלי ו -2 חלונות לשלוטהליך microdissection. ברים כלי: 1. מיקרוסקופים, 2. לייזר לכידת, 3. לייזר חיתוך, 4. מחקר, 5. ניווט, 6. חומרים, 7. קבוצות לכידת, 8. Microdissection, 9. גופן, 10. ביאור. Windows: 1. וידאו חי ו2. מפת דרכים.

1. פתח את הדלת על ידי בחירה בכרטיסייה "הדלת פתוחה" בסרגל הכלים של חומרים בתוכנת מערכת LCM.
2. שקופיות עומס על שלושה חריצים זמינים. להדגמה זו, שקופיות עומס אחד עם אימונוהיסטוכימיה hydroxylase טירוזין דמיינו עם DAB, שקופיות Silane-הכנה אחד ואחד שקופיות קרום PEN כל כותרת אימונוהיסטוכימיה hydroxylase טירוזין הניאון מהירה. בניסוי טיפוסי, להשתמש במקטעים קבועים או אצטון ללא תווית עם שקופיות התייחסות שכותרתו עבור hydroxylase טירוזין באמצעות DAB או שקופיות שכותרתו ישירות עם hydroxylase טירוזין ניאון עבור לכידת לייזר.
3. טען את כובעי LCM לתוך החריץ זמין.
   הערה: כובעי מאקרו וHS LCM זמינים לשימוש. הסוג של כובע LCM להשתמש depends על מספר התאים או כמות הרקמה שייגבה. שקופיות מאקרו רשומות לאסוף עד כמה אלף תאים ואילו כמוסות HS יכולות לאסוף כמה מאה. שקופיות מאקרו לאפשר ליותר אוסף רקמות אך דורשות 50 μl של מאגר תמוגה. כובע HS, בעת שימוש עם המתאמים, דורש רק 10 μl של חיץ תמוגה שמאפשר התאוששות יחסית גדולה יותר של RNA.
4. סגור את הדלת.
5. טען את השקופיות כדי להפעיל את חלון מפת הדרכים שמספק תצוגת עבודה של כל השקופית, זה מאפשר לבחירה של האזור של עניין (איור 3). הצג את מפת הדרכים על חלון וידאו בשידור חי כדי לנווט לאזור של עניין.
6. בסרגל הכלים של חומרים, לזהות את שקופיות קרום PEN על ידי סימון התיבה מעל חריץ השקופיות. לספק תכונות כובע, לחץ לחיצה ימנית על כמוסות בסרגל הכלים חומרים ובחרו "מאפייני אספקת Cap". סמנו את התיבות המציינות את המיקום של הכובעים, ובחר באפשרות מאכובעי Cro או HS.
7. בחר בכרטיסייה "הקרינה" בסרגל הכלים של מיקרוסקופ כדי להפעיל את מנורת הניאון ולאפשר את מנורת הניאון כדי להתחמם. השתמש במסנני UV הכחול וכדי להמחיש את אלכס פלואוריד 488 וDAPI, בהתאמה. השתמש בכרטיסייה "התאם מצלמה" כדי להגדיל את הרגישות של התמונה כדי לראות את תאי שכותרתו fluorescently.
8. בסרגל הכלים של חומרים, לחץ לחיצה ימנית על כובע ולהעביר אותו לשקופית של עניין. לחץ לחיצה כפולה על מיקום במפת הדרכים כדי לבחור את האזור שמופיע בחלון וידאו חי. הזז את הכובע סביב בשקופית על ידי בחירת אזור במפת הדרכים (לחיצה כפולה משמאל) ולאחר מכן לחיצה ובחירה נכונה "כובע מקום באזור המרכז."
9. לפני השימוש בליזר ללכוד IR, לכוון ולהתאים אותו לכוח. מניחים את הכובע באזור של השקופית מרקמה. בסרגל כלי לייזר לכידת, בחר "הפעל". התאם את הכוח (3-100 mW), Pulse (100-1,000,000 μ; Sec) ו# להיטים של הלייזר. לירות לייזר IR כאשר הכובע הוא על חלק של השקופית ללא רקמה ולבדוק אם הלייזר מספיק נמס קרום כובע LCM.
   הערה: הרטבה נקראת זה שנמס קרום הפולימרים על הכובע, כדי שאנשי קשר זה שקופיות הזכוכית. הרטבה מספיק גלויה כטבעת כהה התמזגה לשקופית עם מרכז הזירה ברורה (ראה איור 4 דוגמאות להתכה מספיק ולא מספקת). אם ההרטבה היא לא מספיק, להתאים את הכח ואת הדופק, ואש מבחן שוב עד להשגתו. בנוסף, יכולות לשמש גם שריפות מרובות של הלייזר.
10. כאשר עוצמת לייזר IR מותאמת, לחץ לחיצה ימנית ובחר באפשרות "לייזר לכידת הוא כאן" כדי לכוון את הלייזר.
    הערה: שלב זה מספר את המחשב שבו הלייזר ללכוד IR נועד הרקמה. צעד זה של מטרת הלייזר הוא קריטי וצריך להיות חוזרים ונשנים בכל פעם הכובע מועבר או המטרה היא שונה.

Microdissection לכידה 5. לייזר של פרט דופמין נוירונים משל שקופיות Silane-prep

1. לעבור לאזור של עניין כדי ללכוד תאים.
   הערה: הדוגמא של נוירונים דופמין בידוד מוצגת כאן.
2. כדי ללכוד תאים בודדים משל שקופיות Silane-prep, בחר בכרטיסייה "LCM" אז סמל "נקודה אחת" בסרגל כלי Microdissection.
3. בסרגל הכלים של מיקרוסקופים, השתמש בכרטיסייה "התריס" כדי לעבור בין הקרינה ושדה בהיר עם כרטיסיות מסנני ניאון כדי לבחור את המסננים המתאימים ולהשתמש בכרטיסיות המטרות לשנות את ההגדלה. ברגע שהתאים של עניין נראים בחלון וידאו בשידור חי, להתאים את גודל הנקודה משמש לסימון תאים של עניין לגודל המשוער של התאים. לעשות זאת על ידי לחיצה על כרטיסיית ספוט בסרגל כלי לייזר לכידת לאחר מכן לחיצה על צד אחד של תא מוכתם, ואחרי לחיצה בצד השני.
   הערה: זו מחשבת אתקוטרו של המקום ומציג את הערך.
4. סמן את התאים של עניין על ידי לחיצה על אותם בזמן שהסמל "נקודה אחת" נבחר. לעשות את זה למקום סמן נקודה על כל תא. כאן, המסנן הכחול והאובייקטיבי 10X משמשים כדי להמחיש את הנוירונים דופמין. בדוק שוב ולכוון את לייזר IR על הכובע שבו אין רקמות מתחתיו כמתואר בשלבים 4.9 ו4.10.
5. ברגע שהתאים מסומנים, בחר את "לך - לגזור וללכוד" הכרטיסייה בסרגל כלי Microdissection וליזר IR באופן אוטומטי לפטר את התאים בכל מסומנים נבחרו. בנוסף, במידת הצורך, לירות לייזר IR ידני בכל נקודת העניין (איור 5D).
6. הזז את הכובע מסעיף ועל אזור פתוח של השקופית כדי לבדוק אם התאים נתפסו על כובע LCM. ודא שהתאים של העניין יוסרו מהשקופית (איור 5 ב, ה) ומחוברים לכובע LCM (איור 5 ג, ו). ה מסמךהוא תהליך על ידי לחיצה על הלשונית "תמונה לכידת" בסרגל כלי מיקרוסקופ.
7. בסיום איסוף רקמות, להסיר את הכובע על ידי לחיצה ימנית על הכובע ובחר "מעבר ל" ואז" לפרוק. "

לכידת 6. לייזר של פרט דופמין נוירונים משל PEN ממברנה שקופיות

1. כדי ללכוד תאים בודדים משל שקופיות קרום PEN בשתי לייזרי IR ו- UV, בחר באפשרות "גזור וללכוד" כרטיסייה בסרגל כלי Microdissection. בחר בכרטיסייה "נקודה אחת" כדי לסמן את התאים של עניין. השתמש בכרטיסייה "הקו גזור" להתוות כל תא. הקפד לבדוק את לייזר IR כמתואר בשלב 4.9 ו4.10 ולבדוק לייזר UV כדי לקבוע את עוצמת הצורך לחתוך המינימום חשבה PEN הקרום ורקמות (איור 4 ו -5)
2. בחר את "לכידת וCut" כרטיסייה בסרגל כלי Microdissection. בעת איסוף תאים בודדים באמצעות טכניקה זו, להיותבטוח לירות לייזר IR ראשון ואחרי לייזר UV כחתיכות קטנות האלה יכולים ללכת לאיבוד אם הם נחתכים החוצה לפני שהודבקו לכובע LCM.
   הערה: תהליך זה יכול להיעשות גם באופן ידני על ידי ירי לייזר IR בנקודת העניין והתאים שתוארו באופן אישי עם לייזר UV.
3. לאחר איסוף התאים של עניין, הזז את כובע LCM כמתואר לעיל בשלב 5.7 כדי לקבוע אם התאים הוסרו ושצורפו לכובע (איור 6).
4. בסיום איסוף רקמות, להסיר את הכובע על ידי לחיצה ימנית על הכובע ובחירה באפשרות "מעבר ל" ואז" לפרוק. "

7. לכידת אזור tegmental הגחון משקופיות Silane-prep

1. כדי לזהות את האזור של עניין, להשתמש בשקופית מעובד אימונוהיסטוכימיה.
   הערה: להדגמה זו אזור tegmental הגחון מבודד (איור 7 א).
2. לטעון כובע LCM ולבדוק את הלייזרים כמו בשלבזה 4.9 ו4.10.
   הערה: בדרך כלל, משמש כובע LCM מאקרו אבל יכול לשמש גם כובע HS (ראה איור 8).
3. כדי לבודד אזור של רקמה (כלומר, אזור tegmental הגחון) משקופית Silane-prep, בחר בכרטיסייה "LCM" בסרגל כלי Microdissection, ולאחר מכן בחר בכרטיסייה "פוליגון-החיצונית". להתוות את האזור של עניין בחלון וידאו חי. בהתאם לגודל השטח לאוסף, להתוות את האזור של עניין בהגדלה נמוכה (אובייקטיבי 2X). לאוסף, לעומת זאת, המכשיר משתמש במטרת 10X כך להתאים ולכוון את לייזר IR תחת מטרת 10X לפני הלכידה.
4. בחר את "לך - הלכידה ולחתוך" כרטיסייה בסרגל כלי Microdissection.
   הערה: המחשב באופן אוטומטי לירות לייזר IR בכל האזור נבחר השלם (איור 7F, I). אם קרום LCM לא נמס מספיק בכל האזור, הלייזר יכול להיות מפוטר אדםually או כל התהליך חוזר ונשנה.
5. הזז את כובע LCM הנחה של הרקמות כדי לקבוע כיצד גם הרקמה נאספה.
   הערה: מעבר אחד בשיטה זו בדרך כלל משאירה כמה רקמות מאחורי בשקופית (ראה Figure7G). במקרה זה, לחזור על הבחירה וללכוד צעד לעיל. חוזר על פעולה זו יכולה להגדיל את כמות הרקמה שנאסף (איור 7J).
6. בסיום איסוף רקמות, לפרוק את הכובע על ידי לחיצה ימנית על הכובע ובחירה באפשרות "מעבר ל" ואז" לפרוק. "

8. לכידת אזור tegmental הגחון מPEN ממברנה שקופיות

1. השתמש בשקופית מעובד אימונוהיסטוכימיה כמדריך לבחירת האזור של עניין מהרקמה בשקופית קרום PEN כאמור לעיל.
2. בחר בכרטיסייה "גזירה וללכוד" בסרגל כלי Microdissection. בחר בכרטיסייה "חותך קו" ומתאר את האזור של עניין באמצעות immunohistocheמיסטרי כותרת שקופית כמדריך.
   הערה: התכנית באופן אוטומטי להוסיף נקודות לליזר IR לצרף את הרקמה לכובע. השתמש בכרטיסייה "נקודה אחת" כדי להוסיף כתמים נוספים כדי לאבטח את הרקמה לכובע טוב יותר.
3. תחת 10X האובייקטיבי, אש הבדיקה ולכוון את לייזר IR ו- UV כפי שמתואר ב4.9 ו4.10. בדוק שליזר UV יכול לחדור את הקרום בשקופית ושקיצוץ זה מתאים למיקום על מסך המחשב. השתמש בכוח לייזר UV שהוא רק מספק לחתוך את הקרום ורקמות אך אינו פוגע ברקמות (איור 5).
4. בחר את "לך - הלכידה ולחתוך" כרטיסייה בסרגל כלי Microdissection.
   הערה: המחשב באופן אוטומטי לירות לייזר IR בכל המקומות שכותרתו בתוך הרקמה לצרף אותו לכובע אז לירות לייזר UV לחתוך את שקופית קרום PEN ורקמה (איור 7 ג). כתמים מומסים IR נוספים עשויים להיות נחוצים כדי לצרף tis כראוילתבוע לכובע LCM, אשר ניתן גם להוסיף באופן ידני.
5. הזז את כובע LCM הנחה של הרקמות כדי לקבוע אם הרקמה הוסרה מהסעיף (איור 7 ג) ומחוברת לכובע (איור 7 ג).
6. בסיום איסוף רקמות, כדי להסיר את הכובע, לחץ לחיצה ימנית על הכובע ובחר "מעבר ל" ואז" לפרוק. "

9. בידוד של RNA

1. כדי לאסוף RNA מהתאים או רקמות שנתפסו, דגירה קרום כובע LCM במאגר תמוגה RNA למשך 30 דקות על 37 מעלות צלזיוס.
   הערה: לכובעי HS, מתאם נגיש המאפשר לשימוש רק 10 μl של חיץ תמוגה על הכובע ומתחבר לצינור 0.5 מיליליטר microcentrifuge. כובעי מאקרו דורשים 50 μl של חיץ תמוגה ומצרף ישירות לצינור 0.5 מיליליטר microcentrifuge.
2. לאחר דגירה, לסובב את מאגר תמוגה לתוך צינור 0.5 מיליליטר microcentrifuge.
3. כדי להבטיח תמוגה של כל התאים o מלאהרקמת r, לקלף את קרום כובע LCM של הכובע והמקום במאגר תמוגה.
4. כדי לבדוק את שלמות RNA, RNA השימוש מבודד מהרקמות שנותרו בשקופית לאחר LCM למדוד שלמות RNA.
   הערה: עקב RNA המדגם המוגבל שהושג עם LCM, זה בדרך כלל לא מעשי לבדוק שלמות RNA על RNA הבודד LCM, לעומת זאת, RNA מהרקמות שנותרו מספקת אינדיקטור טוב של כל השפלה RNA בשל קיבעון, אימונוהיסטוכימיה וזמן במהלך הליך LCM.

Results

מיקרוסקופ איורים 6 ו 7 להדגים את יכולות בידוד של תאי עצב בודדים דופמין. הרזולוציה אנטומיים הנוכחית היא סביב 5-10 מיקרומטר כגודל הנקודה הקטן ביותר שניתן לייצר באופן עקבי על LCM כובעים לבודד תאים. המגבלה היחידה לבידודה של סוגי תאים מסוימים היא היכולת לדמיין את התאים. למרות LCM הוא מסוגל לבודד נוירונים בודדים דופמין, זיהום של חלקים של תאים ללא תווית צמודים ככל הנראה מתרחש. לכן, המדגם הסופי הוא אוסף מרוכז של נוירונים דופמין, לא אוכלוסייה טהורה של נוירונים דופמין. טכנולוגיה זו היא גם מסוגלת לבודד אזורים קטנים של רקמה כגון גרעינים או אזורים נפרדים במוח, כפי שמוצג בבידוד של אזור tegmental הגחון. פרסומים קודמים הוכיחו שימוש ברקמת המוח, כמו גם לבודד רקמה פתולוגית מהרקמה נורמלית ^5,11.

class = "jove_content"> מכיוון שהשימוש הנפוץ ביותר של תאים ורקמות המבודדים באמצעות LCM הוא ניתוח RNA, הנהלים שהוצגו היו מוטבים כדי לשמור על שלמות RNA. על מנת לקבוע את האיכות של RNA שנשארה הבא LCM, RNA היה מבודד, באמצעות עמודות ספין סיליקה מבוססות, מרקמות בשקופיות הבאות LCM, או לאחר הליך טירוזין המהיר hydroxylase ניאון אימונוהיסטוכימיה או הקיבעון באצטון. איכות RNA נמדדה ובהשוואה לערכים לRNA RNA מהמוח כולו זמין באופן מסחרי (איור 9). איכות RNA הופחתה בדגימות RNA מרקמות המשמשות לLCM עם יושרה נמוכה לאחר אימונוהיסטוכימיה (רין לא זמין) ואחריו קיבעון אצטון (רין 2.6) בהשוואה לRNA המוח כולו (רין 8.2) כפי שניתן לראות בירידה היחסית ב גובה שיא rRNA S28 לעומת שיא S18. עם זאת, RNA נשמר להקות 18S ו -28 וביטוי גנים יכול להימדד באמצעות Q-PCR.

= "Jove_content"> כדי למדוד את הכמות של RNA המתקבל מתאי העצב שנרכשו באמצעות LCM, נוירונים דופאמין (50, 100 ו -200 נוירונים דופאמין) היו מבודד מאזור tegmental הגחון מעל שקופיות Silane-הכנה. RNA היה מבודד באמצעות עמודות ספין סיליקה מבוססות והכמות של RNA נמדדה. בהתבסס על עקומת הסטנדרט שנוצרה, כולל של 17.3, 24.8 pg ו50.9 pg / μl היו מבודד מ-50, 100 ו -200 נוירונים דופאמין, בהתאמה (איור 10 א). כדי למדוד כמות RNA עם Q-PCR, טווח ריכוזים של RNA המוח כולו וRNA מנוירונים דופאמין תומללו הפוכים וגן β-אקטין נמדד באמצעות Q-PCR כפי שתואר בעבר ^5. בהתבסס על מדידות אלה, ריכוז של 3.55, 6.82 ו20.58 pg / μl חושבו מ -50, 100 ו -200 נוירונים דופאמין, בהתאמה (איור 10 ב).

כדי להמחיש עד כמה בידוד של נוירונים דופמין משווה לבידודה של כל vאזור entral tegmental עם LCM, גנים ספציפיים נוירון דופמין (Nurr1, hydroxylase טירוזין, וטרנספורטר דופאמין) נמדדו עם Q-PCR בשני אלה סוגים שונים של דגימות והשוואה לביטוי של β-אקטין (איור 11). מאחר וערכי _t C הנמוך נוצרים עם ריכוז גבוה יותר של הגן של עניין, ירידה _בt ΔC מציינת ביטוי מוגבר של גני נוירון דופמין ביחס לβ-אקטין. זו ממחישה כיצד הבידוד של תאי עצב בודדים דופמין מרכז את הביטוי של גנים ספציפיים נוירון דופמין. בדגימות הגחון אזור tegmental, גנים ספציפיים נוירון דופמין הם בדילול החוצה כמו תאים אחרים (נוירונים שאינם דופאמין ותאי גלייה) יהיה גם אספו המבטאים β-אקטין אבל לא מבטאים גני נוירון דופמין.

איור 2. לכידת לייזר באמצעות לייזר אינפרא אדום (IR) לכידה ואולטרה הסגול (UV) חיתוך לייזר. על מנת לרכוש שטחים גדולים של רקמה או להקל על ההתאוששות של תאים באמצעות לייזר UV, רקמות הוא רכוב על שקופית עם קרום מחובר לשקופית לאורך הפינה מחוץ (שקופיות קרום PEN). כובע LCM מושם על tהוא רקמה והליזר ללכוד IR משמש כדי להמס את קרום הכובע ולצרף את הרקמה לכובע LCM (שלב 1 ו -2). חיתוך לייזר UV משמש אז כדי לחתוך דרך הממברנה השקופיות ורקמות (שלב 3 ו -4), כך שכאשר הכובע מוסר הרקמה היא להסיר את השקופית ונשארת על כובע LCM (שלב 5).

איור 3. לכידת הלייזר Microdissection מערכת מפת דרכים. יש מערכת Microdissection זה לייזר לכידת חלל במשך 3 שקופיות בכל פעם. כאשר שקופיות נטענות לתוך מיקרוסקופ, תמונות בהגדלה נמוכה מפת דרכים עבור כל שקופית נוצרות. בחירת אזור בתמונת מפת הדרכים מעבירה את חלון תמונת חיה לאזור זה. למטרות הדגמה, mesencephalon העכבר נותח לסעיף 10 מיקרומטר על 3 שקופיות. השקופית הראשונה שכותרתו עבור immunoreactivi hydroxylase טירוזיןty באמצעות diaminobenzidine ככרומגן (). סעיפים היו רכובים על שני שקופיות Silane-prep (B) או שקופיות קרום PEN (C). שתי שקופיות אלה תויגו באמצעות אימונוהיסטוכימיה hydroxylase טירוזין הניאון המהירה. חיצים ב( C) מצביעים על הזיקה של קרום PEN לשקופית הזכוכית. אין רקמה מחוץ גבול זה יכול להיות שנאסף עם LCM.

איור 4. שימוש בלייזר ללכוד IR. הלייזר ללכוד IR משמש כדי להמס את קרום כובע LCM לצרף את הרקמה לכובע LCM ולהסיר אותו משאר הרקמות. הלייזר ללכוד IR חייב להיות בכוח מספיק כדי להמס את קרום כובע LCM מספיק ליצור קשר עם שקופיות רקמות וזכוכית הבסיסיות. התמונה למעלה ממחישה כאשר הלייזר לא היה מספיק כדי להמס את הקרוםלשקופית (השאיר שתי נקודות). כאשר הקרום נמס נוגע שקופיות הזכוכית, קווי המתאר שחורים עבים ניתן לצפייה (מקום נכון). עוצמת הלייזר יכולה להיות מותאמת על ידי שינוי המתח (3-100 mW), Pulse (100-1,000,000 μsec) ו# להיטים של הלייזר. בנוסף, חזר ירי של לייזר IR באותו המקום גם יכול להמס את הקרום נוסף. המטרה של לייזר IR צריכה להיות מותאמת בכל עת כובע LCM מועבר או כאשר המטרה היא שונה. בר סולם = 100 מיקרומטר.

איור 5. שימוש בUV חיתוך לייזר. חיתוך לייזר UV משמש לחיתוך דרך הממברנה PEN והרקמות. לפני השימוש בעוצמה המינימלית הדרושה כדי לחתוך את הקרום ורקמות צריכה להיות לקבוע מאז לייזר UV יכול לגרום נזק לרקמות. מעל, שלוש הנקודות (חצים) של עוצמות לייזר UV שונות מוצגות ב גודל נקודה השמאלית מספיק לסעיפי 10 מיקרומטר, נקודת האמצע לחלקים עבים והמקום הנכון הוכחת עוצמת לייזר UV כי הוא גבוה מדי. סרגל = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6. בידוד ישיר של נוירונים immunoreactive hydroxylase טירוזין באמצעות לייזר IR. נוירונים דופמין מוצגים לאחר תיוג ניאון מהיר עבור hydroxylase טירוזין (). כאשר לייזר IR הוא ירה המסת קרום כובע LCM על הנוירונים האלה (D), הסרת הכובע מרימה תאים אלה הנחה של השקופיות (B, E). אז יכולים להיות דמיינו נוירונים אלה כפי שצורפו לכובע LCM (C, F). בר סולם = 250 מיקרומטר.= יעד "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52336/52336fig6large.jpg" = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 7. בידוד ישיר של נוירונים immunoreactive hydroxylase טירוזין משקופיות קרום PEN באמצעות לייזרי IR ו- UV. Hydroxylase טירוזין נוירונים שכותרתו מוצגים לעיל (א '). יכולים להיות מחוברים נוירונים אלה לכובע LCM באמצעות לייזר IR ולחתוך משקופית קרום PEN באמצעות לייזר UV (B). סרגל = 250 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 8. עקיף בידוד של אזור tegmental הגחון באמצעות immunoreactivity hydroxylase טירוזין. המיקום של נוירונים דופמין באזור tegmental הגחון היה דמיין בסעיף שימוש בטכניקות אימונוהיסטוכימיה סטנדרטית (A ו- E). סעיף זה אימונוהיסטוכימיה שכותרתו שימש כתבנית לאתר את אזור tegmental הגחון בסעיפים בלא כתם סמוך (B ו- F). השימוש בליזר UV, אזור tegmental הגחון היה מחובר לכובע LCM עם לייזר IR ולחתוך מהשקופית עם לייזר UV (C ו- D) ומוצג מצורף לכובע HS LCM (D). אזור tegmental הגחון מבודד משקופיות Silane-prep רק באמצעות לייזר IR מוצג גם מחובר לכובע מאקרו (FK). שים לב שיש צורך יותר מניסיון אחד כדי לאסוף ביותר של הרקמה מאזור זה (השווה G ו- J). בר סולם = 500 מיקרומטר.טען / 52,336 52336fig8large.jpg "target =" / _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איכות איור 9. RNA. electropherograms נציג ותמונות ג'ל הקשורים של RNA זמין מסחרי המוח כולו () ו- RNA מבודד מסעיפים לאחר קיבוע אצטון וLCM (B) או אימונוהיסטוכימיה המהירה ניאון hydroxylase טירוזין וLCM (C). למרות איכות RNA הופחתה בסעיפי מעובד אימונוהיסטוכימיה, בהשוואה לRNA המוח כולו, electropherograms להפגין RNA בעיקר שלם המבוסס על הנוכחות של פסגות rRNA S18 וS28. ריכוז RNA המוח כולו היה 6.487 pg / μl עם רין של 8.2. ריכוז RNA רקמה הקבוע אצטון היה 5.036 pg / μl עם רין של 2.6. הושג RNA לאחר שעות אימונוהיסטוכימיה מודעת ריכוז של 4.474 pg / μl ורין לא היה זמין.

כמות RNA איור 10.. כדי לקבוע את הכמות של RNA בתאי עצב שהושגו עם LCM, עקומת תקן של ריכוזי RNA הופקה באמצעות fluorospectrometer וQ-PCR. למדידות fluorospectrometer (), הגרף הגדול מציג את הטווח גבוה יותר של כמויות RNA והגרף הקטן מציג את הרגישות של assay זה עד 10 pg / μl. ריכוזים של RNA המתקבלים מ-50, 100 ו -200 נוירונים דופאמין היו 17.3, 24.8 ו50.9 pg / μl, בהתאמה. שימוש Q-PCR למדוד כמויות RNA (B), הריכוזים של RNA המתקבלים מ-50, 100 ו -200 נוירונים דופאמין היה 3.55, 6.82 ו20.58 pg / μl, בהתאמה.

es / ftp_upload / 52,336 / 52336fig11highres.jpg "/>
ריכוז איור 11. של גנים ספציפיים נוירון דופמין עם הבידוד של תאי עצב בודדים דופמין. ההבדל _בt C _(t ΔC) בין גני נוירון דופמין ספציפיים (Nurr1, hydroxylase טירוזין, וטרנספורטר דופאמין) וβ-אקטין בדגימות של תאי עצב דופמין באזור tegmental הגחון מבודד עם LCM בהשוואה לביטוי בניתוחים של אזור tegmental הגחון כל מוצגים. מאחר וערכי _t C הנמוך נוצרים עם ריכוז גבוה יותר של הגן של עניין, ירידה _בt ΔC מציינת ביטוי מוגבר של גני נוירון דופמין ביחס לβ-אקטין כמו תאים אחרים (נוירונים שאינם דופאמין ותאי גלייה) תהיה ייאסף בדגימות אזור tegmental הגחון המבטאות β-אקטין אבל לא מבטאים גני נוירון דופמין.

Discussion

LCM הוא טכניקה רבת עוצמה לנתיחה של אוכלוסיות של תאים או אזורים של רקמה מסעיפי רקמות בדידות בשקופית מיקרוסקופ והבידוד הבא של RNA, מייקרו-רנ"א, DNA וחלבונים. השימוש בLCM בשילוב עם ניתוח תוך שימוש בטכנולוגיות תפוקה גבוהה כגון microarray, רצף RNA דור הבא, ניתוח אפיגנטיים של DNA ופרוטאומיקה הופך יותר ויותר נפוץ כמו הרגישות של טכניקות אלה משפר את כמות חומר המוצא צורך מופחתת ^8-12. עם LCM, רזולוציה אנטומיים טוב יותר מושגת למדגם, וההבנה מצעדים במורד הזרם של דגימות אלה היא מאוד משופרת. אזהרה אחת עם LCM היא שהיא מספקת מדגם מרוכז של התאים של עניין, אך לא בהכרח אוכלוסייה טהורה של תאים. גבולות הדיוק אומר שיהיה כמה זיהום מרקמות סמוכות. עם זאת, טכניקה זו עושה להתרכז התאים של ענייןכדי למזער את השפעות הקשורות לרקמות ותאים ולמקסם את ההשפעות הניסיוניות בתאים של עניין.

ישיר מול אימונוהיסטוכימיה העקיפה

מאז LCM מנוצל כיום בעיקר לבידוד והמדידה של RNA, RNA שמירת שלמותה הוא קריטריון חשוב מאוד. שמירה על שלמות RNA היא הרציונל העיקרי מאחורי השימוש באימונוהיסטוכימיה עקיפה כדי להדריך את נתיחת רקמות אשר מסירה את הצורך להכתים את הרקמה ישירות שיכול לבזות את RNA (איור 10). כאשר השאלה הניסיונית, לעומת זאת, דורשת בידוד של אוכלוסייה ספציפית של תאים, כגון תאי עצב דופמין, נדרש אימונוהיסטוכימיה ניאון ישירה. באמצעות פרוטוקול תיוג אימונוהיסטוכימיה מהיר יכול למזער את ההשפלה של RNA במהלך ההליך. הפעמים דגירה קצרות נובעות מהשימוש בריכוזים גבוהים של אנטי ראשוניים ומשנייםגופים, ריכוזים שסביב 10-20 לקפל גבוהים יותר ממה הוא הכרחי עבור אימונוהיסטוכימיה קונבנציונלית עם דגירה 2 שעות. אם לעומת זאת, פעמים דגירה ארוכות יותר נדרשות, בראון וסמית משמשים מאגרי מלח גבוהים לעכב השפלה RNA ולקבל RNA באיכות טובה עם זמנים ארוכים דגירה (עד 20 שעות) ^13. גם גישה זו יכולה לשמש אם יש זמן ניכר הנדרש בין התיוג של הרקמה וגישה להגיע למערכת LCM.

בחירה של שקופיות - קרום PEN, Silane-הכנה ושקופיות זכוכית ללא ציפוי

השימוש בשקופיות זכוכית ללא ציפוי לLCM דווחו ^14. במעבדה שלנו, מגלשות Silane-prep כבר מצאו להיות בחירה אופטימלית, כציפוי זה מספיק מצרף את הרקמה לשקופית אימונוהיסטוכימיה ללא אובדן של רקמה אך עדיין מאפשר לצירופה של הרקמה לכובעי LCM והסרת מהשקופית . יש לי שקופיות זכוכית ללא ציפויהראה כמה אובדן רקמה עם הליך אימונוהיסטוכימיה. אם נעשה שימוש באימונוהיסטוכימיה עקיפה, לעומת זאת, שימור רקמה הופך פחות בעיה. עם התייבשות נכונה, תאים או רקמות לכידת הנחה של שקופיות Silane-הכנה לא הייתה בעיה. כל אחת מהגישות השונות לנוירונים בידוד או אזורים במוח המתואר במאמר זה יש יתרונות וחסרונות. לבידוד של נוירונים דופמין הבודדים, השימוש בשקופיות Silane-prep יש את היתרון של אופטיקה טובה יותר ופחות יקר מאשר שקופיות קרום PEN. החסרון הוא שתאים לפעמים לכידה יכולים להיות קשים אם יש התייבשות מספיקה (ראה להלן) וכמה רקמות ניתן להשאיר בשקופית. היתרון של שקופיות קרומי PEN הוא שהשימוש בשילוב של לייזר הלייזר וUV IR מבטיח כי נוירונים דופאמין ייאספו. אי-איסוף תאים משקופיות קרום PEN כמעט אף פעם לא מתרחש, כפי שהוא פחות תלוי בהתייבשות מאשר שקופיות הזכוכית. יתרון נוסף הוא שליזר UV יכול לשמש כדי להתקרב לצורה של תאי העצב של עניין באופן הדוק יותר, בהשוואה למעגל עבור לכידת תאי עצב משל שקופיות זכוכית עם לייזר IR. לבידוד של אזורים של רקמה, שקופיות קרום PEN עדיפות בהרבה ולהצדיק את העלות הנוספת. גישה זו גורמת להסרת כל הרקמה לגזור על הקרום שלם, היא הרבה יותר מהר מאשר לכידת שטח גדול של רקמות באמצעות לייזר IR לבד ויכולים להיות שנאספו קטעי רקמה עבים יותר. רק באמצעות לייזר IR מחייב את קרום כובע LCM הוא נמס לגמרי על אזור הרקמה כולה. בנוסף, אוסף שלם של הרקמה אופייני ודורש בדרך כלל ניסיונות מרובים. למרות שזה לוקח יותר זמן מאשר בידוד רקמה משקופית קרום PEN, אם הרקמה זמינה כבר בשקופית זכוכית או לייזר UV אינו זמין, זה הוא אפשרות מעשית כמו רוב הרקמות ניתן לאסוף (איור 8J).

"> צעדים קריטיים ove_content

Incubations אתנול 100% הם אחד הצעדים החשובים ביותר. על מנת לאסוף תאים משקופיות Silane-הכנה נדרשת התייבשות של הרקמה שלמה. לכן, כל מים לא הוסרו, אשר מזוהה בעיקר עם הדגירה אתנול 100%, ישפיעו על היכולת להרים תאים מהשקופיות. כדי לטפל בבעיה זו, לעתים קרובות לשנות את פתרונות אתנול 100% כספיגה של מים מהאוויר או ההעברה משלבי כביסה קודמות יכול להשפיע על ההתייבשות. בנוסף, מסננות מולקולריות רגילות לספוג כל זיהום מים. מערכת LCM אידיאלית צריכה להיות ממוקמת בחדר קטן עם מסיר לחות כדי לשמור על תנאי לחות נמוכים.

סעיפי cryostat טובים הם קריטיים לLCM הנכון. סעיפים צריכים להיות שטוח עם קפלים ברקמות ממוזערות. מקפל ברקמה יגדיל את המרחק בין כובע LCM ולמנוע ממנו ליצור קשר עם tהוא הרקמה. לאחר מכן הוא הופך להיות קשה כדי להמס את כובע הקרום מספיק על הרקמה. לשקופיות זכוכית, בדרך כלל עובי סעיף צריך להיות בין 6 ל 12 מיקרומטר. ניתן ללכוד קטעים עבים עם שקופיות קרום PEN.

LCM מציע יכולת טכנית לעשות ניתוחים מאוד מדויקים של רקמות ותאים משקופיות מיקרוסקופ. זה מגדיל באופן דרמטי את הרזולוציה של ניתוח נוסף בהשוואה לנתיחת ברוטו של פיסות רקמה. אמנם, LCM יכול להיות זמן ועבודה אינטנסיבית, היא אינה דורשת הכשרה או מומחיות נרחבות ו, כאשר בשילוב עם טכנולוגיות תפוקה גבוהה אחרות, יכול לשפר באופן משמעותי את ההבנה של תהליך ביולוגי כאשר תאים בדידים או אזורים אנטומיים משמשים.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Veritas Laser Capture Microdissection System	Life Technologies, Grand Island, NY	דגם חדש יותר נמכר
CapSure Macro LCM	Caps Life Technologies, Grand Island, NY	LCM0211
CapSure HS LCM Caps	Life Technologies, Grand Island, NY	LCM0213
PEN Membrane Slides	Life Technologies, Grand Island, NY	s4651
Silane prep-slides	Sigma-Aldrich, סנט לואיס, MO	S4651
95% אתנול-RNase Free	Sigma-Aldrich, סנט לואיס, MO	E7148
100% אתנול-RNase Free	Sigma-Aldrich, סנט לואיס, MO	E7023
Rnase Free Triton	Sigma-Aldrich, סנט לואיס, MO	T8787
מסננת מולקולרית	EDM Millipore, Billerica, MA	MX1583D
נוגדן נגד טירוזין הידרוקסיאז	EDM Millipore, Billerica, MA	Ab152
Alexa Fluor 488 עז נגד ארנב IgG	Life Technologies, גרנד איילנד, ניו יורק	A-11008
2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies, סנטה קלרה, קליפורניה	G2939AA
Stratagene MX 3005P	Agilent Technologies, סנטה קלרה, קליפורניה	401513
Nanodrop 3300 פלואורוספקטרומטר	Thermo Scientific
Quant-iT RiboGreen	Life Technologies, גרנד איילנד, ניו יורק	R11490
RNaseZap	Life Technologies, גרנד איילנד, ניו יורק	AM9780