ג'לים polyacrylamide לInvadopodia וגרירת חיל מבחני בתאי הסרטן

הנוקשות של ECM גידולים הקשורים זוהתה כגורם משמעותי בהתנהגות נהיגה ממארת על ידי הגדלת התכווצות actomyosin ^1-3. בעוד השפעה זו בעיקר הודגמה עם תאי סרטן השד, נמצאו נוקשות מטריצה ​​לשנות תכונות פולשנית של תאים שמקורם במגוון רחב של סוגי הסרטן ^4-8 טוענים כי נוקשות גידול עשוי לשחק תפקיד בסוג אחר של סרטן. לחדור רקמות צולבות במהלך נדידה פולשנית, תאים סרטניים לנצל בליטות דבקים אקטין עשיר הידוע בשם invadopodia שלמקם proteinases להשפיל ECM ⁹ focally. Invadopodia נחשב לסימן היכר של תאים פולשניים והיה מעורב בפלישת תאי גידול וגרור ^10,11. מחקרים קודמים הראו כי נוקשות מטריצה ​​יכולות לווסת מספרי invadopodia וקשורים השפלה ECM ^4,12 באמצעות פעילות שרירן השני וחלבוני mechanosensitive ^12. בהתחשב במתאם בין צפיפות גידול ותוקפנות סרטן ^13,14, משתמע מתוצאות אלה מנגנון שבאמצעותו תאי הסרטן עשויים להגיב לרקמות גידול נוקשה לנהוג פלישה וגרורות דרך התכווצות actomyosin.

בקשיחות ECM מבחנה ובצפיפות רקמת vivo הוכח לווסת התנהגות פולשנית של תאים סרטניים ^1,15-17. בעוד התכווצות actomyosin נראית חשוב בתהליך זה, סכסוך לימודים נוכחי, האם יכולת גרורתי מתואמת לעלתה או ירד כוחות התכווצות ^6,18-20. יתר על כן, הוא נשאר לא ידוע אם כוחות אלה ישירות לתווך פעילות invadopodia ^21. מצאנו לאחרונה כי כוחות התכווצות תאי הסרטן היו תלויים בנוקשות מטריצה ​​והיו חזוי של השפלה ECM על ידי invadopodia ^5. תוצאות אלו מצביעות על כך שכוחות סלולריים עשויים לשחק תפקיד חשוב בהתקדמות סרטן על ידי תיווך ac invadopodiativity בתגובה לתכונות מכאניות של מייקרו-הסביבה של הגידול.

על מנת לתאם את המאפיינים פולשנית והתכווצות של תאים סרטניים ^5, שינינו פרוטוקול ליצירת PaaS עם קשיחויות שונות ששימשו בעבר לחקירת פעילות invadopodia קשיחות תלויה ^4,12,22. על ידי כימי crosslinking פיברונקטין פלזמה האנושי לאורך PaaS, יכול לשמש הידרוג שונה אלה כבסיס לשני invadopodia ומבחני כוח המתיחה על מנת להבטיח שתאים חוו את אותו הקשיחויות בשני הניסויים ^5. במבחני invadopodia, פיברונקטין מספק תחום מחייב טבעי לג'לטין לקשר ECM המעולף לPaaS לזהות הפחתת מטריצה. במבחני כוח המתיחה, פיברונקטין מספק ליגנד להידבקות סלולרית ישירה לאתר התקות microsphere המשמשות לחישוב כוחות מתיחה הסלולר. תוצאות שיטה זו במה שאנו קוראים רכים, קשים,וPaaS הנוקשה שחייבים מנות תחתית זכוכית ויש לי moduli אלסטי, E, של 1,023, 7307, והאבא 22692 ⁵ שמשתרעים על פני מגוון רחב של תכונות מכאניות דיווחו לרקמות נורמליות וסרטניות ^23.

1. הכנת Coverslips הזכוכית לPaaS

1. coverslips הנקי 12 מ"מ עם מגבוני מוך נמוכים.
2. להבת coverslips 12 מ"מ וcoverslip 14 מ"מ בmicrowell של כל צלחת תחתית זכוכית 35 מ"מ על ידי העברתם באמצעות להבת מבער בונזן באמצעות פינצטה.
3. פנק את microwells עם 200 μl של 0.1 N NaOH למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
4. לשאוב ואוויר יבש microwells למשך 30 דקות.
5. פנק את microwells עם 50-100 μl של 3-aminopropyltrimethoxysilane במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר במנדף. כימיקל זה מגיב עם פלסטיק; לכן, השימוש בטפטפות זכוכית ולא למלא את microwells לחלוטין להימנע ממגע עם פלסטיק הצלחת.
6. שטוף את microwells עם מים ultrapure במשך כ -10 דקות עד 3-aminopropyltrimethoxysilane מתבהר.
7. יש לשטוף את microwells עם המים ultrapure פעמיים באמצעות בקבוק לחיץ.
8. שטוף את microwells עם 2 מיליליטר של מים ultrapureטמפרטורת חדר לא על כיסא נדנדה להגדיר במהירות בינונית (~ 1 הרץ) במשך 10 דקות.
9. לשאוב ואוויר יבש microwells למשך 30 דקות.
10. פנק את microwells עם 2 מיליליטר של 0.5% פתרון glutaraldehyde בטמפרטורת חדר על כיסא נדנדה להגדיר במהירות בינונית (~ 1 הרץ) למשך 30 דקות.
11. שטוף את microwells עם 2 מיליליטר של מים ultrapure בטמפרטורת חדר על כיסא נדנדה להגדיר במהירות בינונית (~ 1 הרץ) במשך 10 דקות. חזור על פי שניים יותר עבור הסכום כולל של 30 דקות.
12. microwells יבש בזווית תלולה (60º או יותר) למשך 30 דקות.
    הערה: כלים יכולים להיות מאוחסנים במשך 2 חודשים בdessicator.

2. הכנת למבחני PaaS Invadopodia

1. לפתרון 1 מיליליטר של PAA הרך (acrylamide 8% ו 0.05% BIS), לשלב 200 μl של acrylamide 40%, 25 μl של 2% BIS, וμl 574 של המים ultrapure (טבלת 1).
2. לפתרון 1 מיליליטר של PAA הקשה (acrylamide 8% ו -0.35% BIS), לשלב 200 μl של acrylamide 40%, 175 & #181; l של 2% BIS, וμl 409 של המים ultrapure (טבלת 1).
3. לפתרון 1 מיליליטר של PAA הנוקשה (acrylamide 12% ושל 0.60% BIS), לשלב 300 μl של acrylamide 40%, 300 μl של 2% BIS, וμl 169 של המים ultrapure (טבלת 1).
4. דגה הפתרונות במשך 15 דקות. הוסף 200, 215, ו -230 μl של 1 מ"ג / מיליליטר פיברונקטין פלזמה האנושי במי ultrapure לפתרונות PAA הרכים, קשים, ונוקשה, בהתאמה. לכל הפתרונות, להוסיף 1 μl של 10 מ"ג חומצה אקרילית N-hydroxysuccinimide מיליליטר אסתר / (NHS), 5 μl של 100 מ"ג / מיליליטר persulfate אמוניום, ו -2 μl של N, N, N ', N'-tetramethylethylenediamine (TEMED ; טבלת 1). מערבבים עם pipetting העדין ולהימנע מיצירת בועות בפתרונות.

טבלת 1: מרכיב volumes וכתוצאה מכך moduli אלסטי לPaaS רך, קשה, ונוקשה המשמש במבחני invadopodia. AA = acrylamide, FN = פיברונקטין, APS = persulfate אמוניום.

5. פיפטה 8.48 μl של פתרון PAA למרכזו של כל microwell.
   הערה: כרך זה באופן תיאורטי מניב PAA של 75 מיקרומטר בעובי.
6. בעדינות להוריד את צד הבערה של coverslip 12 מ"מ על הטיפה בmicrowell באמצעות פינצטה.
7. אפשר פתרון PAA דחוק לפלמר במשך 15-30 דקות. ודא פילמור על ידי בדיקת פתרון השאריות.
8. הוסף 2 מיליליטר של 1x PBS לכל מנה ולהסיר 12 מ"מ coverslips עם פינצטה.
   הערה: 10x PBS נעשה במעבדה ומורכבת מ0.011 M KH ₂ PO _4, 1.54 M NaCl, ו0.056 M Na _{2 4} HPO.
9. שטוף את microwells עם 2 מיליליטר של 1x PBS בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות. חזור על פי שניים יותר עבור הסכום כולל של 15 דקות.

3. Pפיצוי של PaaS למבחני כוח מתיחה

1. לפתרון 1 מיליליטר של PAA הרך (acrylamide 8% ו 0.05% BIS), לשלב 200 μl של acrylamide 40%, 25 μl של 2% BIS, ו- 566 μl מים ultrapure (טבלה 2).
2. לפתרון 1 מיליליטר של PAA הקשה (acrylamide 8% ו -0.35% BIS), לשלב 200 μl של acrylamide 40%, 175 μl של 2% BIS, וμl 401 של המים ultrapure (טבלה 2).
3. לפתרון 1 מיליליטר של PAA הנוקשה (acrylamide 12% ושל 0.60% BIS), לשלב 300 μl של acrylamide 40%, 300 μl של 2% BIS, וμl 161 של המים ultrapure (טבלה 2).
4. דגה הפתרונות במשך 15 דקות. הוסף 200, 215, ו -230 μl של 1 מ"ג / מיליליטר פיברונקטין פלזמה אנושית לפתרונות PAA הרכים, קשים, ונוקשה, בהתאמה. Sonicate 8 μl של 200 ננומטר microspheres האדום ניאון (עירור / פליטה של ​​580/605 ננומטר) למשך 30 שניות. לכל פתרון, להוסיף 8 μl של 200 microspheres ניאון האדום ננומטר,1 μl של 10 מ"ג / מיליליטר חומצה אקרילית NHS אסתר, 5 μl של 100 מ"ג / מיליליטר persulfate אמוניום, ו -2 μl של TEMED (טבלה 2). מערבבים עם pipetting העדין ולהימנע מיצירת בועות בפתרונות.

טבלה 2:. כרכי מרכיב וכתוצאה מכך moduli אלסטי לPaaS רך, קשה, ונוקשה המשמש במבחני כוח המתיחה AA = acrylamide, FN = פיברונקטין, APS = persulfate אמוניום.

5. פיפטה 8.48 μl של פתרון PAA למרכזו של כל microwell.
   הערה: כרך זה באופן תיאורטי מניב PAA של 75 מיקרומטר בעובי.
6. בעדינות להוריד את צד הבערה של הדואר 12 מ"מ coverslip לאגל בmicrowell באמצעות פינצטה.
7. אפשר פתרון PAA דחוק לפלמר במשך 15-30 דקות. ודא פילמור על ידי בדיקת פתרון שאריות.
8. הוסף 2 מיליליטר של 1x PBS לכל מנה ולהסיר 12 מ"מ coverslips עם פינצטה.
9. שטוף את microwells עם 2 מיליליטר של 1x PBS בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות. חזור על פי שניים יותר עבור הסכום כולל של 15 דקות.

4. הכנת ECM למבחני Invadopodia

1. מחממים את פתרון ג'לטין (ג'לטין 1% וסוכרוז 1%) ל -37 מעלות צלזיוס.
2. פנק את PaaS עם 150 μl של פתרון ג'לטין 1 דקות לאחר מכן בזהירות לשאוב מעומק microwells כאשר מחזיקים את המנות תחתית הזכוכית בזווית של 45 מעלות.
3. ייבש את השכבה שנותרה דקה של ג'לטין על PaaS בmicrowells בזווית תלולה (60 ° או יותר) כדי לייעל את הייבוש למשך 60 דקות.
4. פנק את microwells עם 2 מיליליטר של פתרון glutaraldehyde 0.5% צונן על iCe במשך 15 דקות ואחריו בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות.
5. שטוף את microwells עם 2 מיליליטר של PBS 1x במשך 5 דקות. חזור על פי שניים יותר עבור הסכום כולל של 15 דקות.
6. פנק את microwells עם 2 מיליליטר של פתרון borohydride נתרן 1 דקות. לטפוח בעדינות מנות על ספסל כדי להסיר בועות כי טופס על פני השטח של ג'לטין.
7. לשאוב ולשטוף את microwells עם 2 מיליליטר של PBS 1x במשך 5 דקות. חזור על פי שניים יותר עבור הסכום כולל של 15 דקות.
8. לדלל פתרון פיברונקטין הפלזמה אנושי FITC שכותרתו 50 מיקרוגרם / מיליליטר עם PBS 1x ו צנטריפוגות ב 175,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. כך או לרכוש פיברונקטין שכותרתו זמין מסחרי או לתייג אותו באופן הבא:
   1. ממיסים 5 מ"ג פיברונקטין ב 10 מיליליטר של חיץ borate (tetrahydrate metaborate 170 נתרן מ"מ ו -40 מ"מ NaCl) ומקום בצינורות דיאליזה.
   2. תווית פיברונקטין על ידי הנחת צינורות ב200 מיליליטר של חיץ borate המכיל 6 מ"ג FITC המומס בטמפרטורת חדר על stirrer מגנטילהגדיר בהגדרה הנמוכה ביותר עבור 1.5 שעות בחושך.
   3. Dialyze עם 500 מיליליטר של PBS 1x על stirrer מגנטי מוגדר בהגדרה הנמוכה ביותר במשך 3 ימים בחדר קר כהה (4 ° C) עם שני נפח משתנה ביום.
   4. ריכוז פיברונקטין FITC שכותרתו לחשב על בסיס הצפיפות האופטית של aliquots המדולל (1: 200) ב 280 ננומטר וnm 493 כ[ OD ₂₈₀ - (0.36 x OD _493)] / 1.4 פעמים גורם לדילול של 200 פעמים 2 (המהווה לגליצרול ריכוז פיברונקטין בשלב הבא) וכתוצאה מכך ביחידות מיליליטר / מ"ג.
   5. Dialyze הלילה בפתרון גליצרול 50% על stirrer מגנטי מוגדר בהגדרה הנמוכה ביותר ללילה בחדר קר וחשוך על 4 מעלות צלזיוס.)
9. פנק את microwells עם 150 μl של פתרון פיברונקטין FITC שכותרתו בטמפרטורת חדר למשך 60 דקות בחושך.
10. בזהירות לשאוב פתרון פיברונקטין שכותרתו FITC מהחלק התחתון של microwells כאשר מחזיקים את המנות תחתית הזכוכית בבזווית של 45 מעלות ולאחר מכן למלא את מנות תחתית כוס עם 70% אתנול פתרון בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות במכסת מנוע תרבית תאים חשוכות לעיקור. כמו כן למלא מכסי צלחת תחתית זכוכית או לנגב לנקות עם מגבוני מוך נמוכים הספוגים באתנול 70%.
11. לשטוף כלים תחתית זכוכית על ידי מילוי אותם עם 1x PBS במשך 5 דקות. חזור פעמים נוספות עם 2 מיליליטר של 1x PBS עבור הסכום כולל של 15 דקות.

5. הכנה והדמיה של מבחני Invadopodia

1. להוסיף 25,000 תאים סרטניים ב 2 מיליליטר של מדיום invadopodia (1: 1 DMEM וRPMI 1640 עם 5% בסרום דל חלבון, 10% בסרום שור עוברי, ו- 20 / מיליליטר ng של גורם גדילה באפידרמיס הוסיף טרי) למאכלי תחתית הזכוכית ו דגירה הלילה.
2. לשאוב ולטפל microwells עם 2 מיליליטר של פתרון paraformaldehyde 3.7% בטמפרטורת חדר בחושך במשך 20 דקות כדי לתקן את התאים.
3. לאחר שתי שטיפות מהירות עם 2 מיליליטר של 1x PBS, טיפול בmicrowells עם 2 מיליליטר של 0.1% פתרון Triton X-100 בטמפה החדרrature בחושך במשך 5 דקות כדי permeabilize התאים.
4. לאחר שטיפה מהירה אחד עם 2 מיליליטר של 1x PBS, טיפול בmicrowells עם 3% אלבומין בסרום שור חסימת פתרון בטמפרטורת חדר בחושך במשך 60 דקות כדי לחסום את התאים.
5. דגירה microwells עם 150 μl של נוגדן עכבר נגד cortactin (1: 750) בחסימת פתרון בטמפרטורת חדר בחושך במשך 60 דקות.
6. לשטוף microwells עם 2 מיליליטר של 1x PBS במשך 5 דקות. חזור על פי שניים יותר עבור הסכום כולל של 15 דקות.
7. דגירה microwells עם 150 μl של עז אנטי עכבר 633 נוגדן (1: 500) וphalloidin 546 (1: 750) בחסימת פתרון בטמפרטורת חדר בחושך במשך 60 דקות.
8. לשטוף microwells עם 2 מיליליטר של 1x PBS במשך 5 דקות. חזור על פי שניים יותר עבור הסכום כולל של 15 דקות.
9. להוסיף שש טיפות של הרכבה בינונית כדי למלא בכל microwell ולכסות עם 22 x 22 coverslips.
10. cortactin תמונה ויקטין לזהות invadopodia באמצעות מסנני עירור ופליטה של ​​632/647 ננומטר ו556/570 ננומטר, בהתאמה, באמצעות עדשת טבילת שמן גבוה NA, 40X על מיקרוסקופ הפוך רחב בתחום. באופן דומה, פיברונקטין התמונה לזהות השפלה ECM באמצעות מסנן עירור ופליטה של ​​492/518 ננומטר.

6. הכנה והדמיה של מבחני כוח מתיחה

1. להוסיף 15,000 תאים סרטניים ב 2 מיליליטר של מדיום invadopodia למנות תחתית הכוס ודגירת הלילה.
2. לשאוב בינוני במנות תחתית הזכוכית ולהחליף עם 2 מיליליטר של L-15 בינוני, עם אותו התוספים (5% בסרום דל חלבון, 10% בסרום שור עוברי, ו- 20 / מיליליטר ng של גורם גדילה באפידרמיס הוסיף טרי), מראש -warmed עד 37 מעלות צלזיוס.
3. דגירה המנות תחתית זכוכית בתא סביבתי על מיקרוסקופ הפוכה מראש equilibrated עד 37 ° C עם לחות גבוהה עבור שעה 1.
4. קח ארבעה סטים של תמונות באמצעות NA גבוה, 40X עדשה על מיקרוסקופ שדה רחב הפוך עם שלב אוטומטי לציון עמדות סלולריות:
   1. תאי תמונה לp של PaaS באמצעות ניגוד שלב (תמונת "שלב").
   2. microspheres ניאון תמונה באמצעות מסנני עירור ופליטה של ​​560/645 nm על ידי התמקדות במקצת עד שהשכבה הראשונה של microspheres בחלק העליון של PaaS מתחת לתאים מתחדד ("הדגיש" תמונה).
   3. בנוסף, יתמקד לתחתית PaaS (באמצעות microspheres כסמנים) ולקחת את תמונה (תמונה "מלמטה"). הערה: המטרה של תמונה זו היא להקליט z-העמדה כדי לקבל את עובי PAA בפועל בכל עמדה לחישובי כוח המתיחה כפי שמתואר בנציגי תוצאות.
   4. לאחר תמונות אלה נרכשו במספר עמדות, לערבב בעדינות ב220 μl של 10% פתרון Triton-X כדי להסיר תאים. microspheres תמונה בחלק העליון של PaaS בכל עמדה כ( תמונת "null") שתוארה קודם לכן.

בassay invadopodia, invadopodia מזוהה בדרך כלל על ידי colocalization של סמנים כמו אקטין וcortactin במבני punctate בתוך גוף התא (איור 1). שני invadopodia פעיל המשפיל ולא משפיל ניתן לספור ונבדלים באם מבנים אלה colocalized עם אזורים שחורים חסרי אות ניאון בפיברונקטין FITC שכותרתו (איור 1). Invadopodia נספרים באופן ידני, והשפלה ECM לכל תא נקבעה על ידי thresholding ידני האזורים השחורים האלה בתוך קווי המתאר של התאים.

בassay כוח המתיחה, ארבע תמונות שנתפסו בכל מקום סלולארי מתאפיין בעמדת שלב (איור 2). ראשון, "שלב" ו- "הדגיש" תמונות שצולמו של כל התאים של עניין. תמונה "תחתונה" של PAA נלקחה גם בכל עמדה על מנת לחשב עובי הידרוג'ל. לאחר הסרת tהוא תאים, תמונה "null" נלקחת במיקום כל שלב מסומן. עיוותים בPaaS מחושבים על בסיס השינוי בעמדות microsphere בין "הדגיש" ותמונות "null". התקות אלה ואת התכונות מכאניות של PaaS (E ומקדם פואסון להניח כ0.5) משמשים לאחר מכן לחישוב כוחות מתיחה (איור 2). כמה שיטות שונות קיימות לחישוב כוחות המתיחה 24 המבוססים על כמה גיבוש פתרון Boussinesq למחצית שטח אלסטיות אינסופי 25. בעוד הפרטים של ניתוחים אלה הם מעבר להיקף של הטקסט הזה, יש לנו רישיון תוכנת LIBTRC ממיכה דמבו באוניברסיטת בוסטון שמשתמש בשיטה שתוארה לעיל לחישוב כוחות המתיחה 26. שיטה חישובית מסוימת זה מפצה על עובי סופי בחישוביה המחייב את העובי של PaaS בכל עמדה שמחושב על בסיס difference בz-העמדה ותמונות ", הדגישו" "מלמטה". יש קבוצות מחקר רבות חבילות מחשב דומות זמינות או בוחרות לכתוב תוכניות משלהם. בנוסף, קיימות שיטות אחרות לחישוב כוחות מתיחה המבוססים על גישות מתמטיות שונות 24.

איור 1: assay invadopodia יכול לשמש כדי לזהות invadopodia והשפלה ECM הקשורים תמונות הקרינה רחב בתחום דוגמא invadopodia בתא SCC-61 (ראש וקרצינומה של תאי קשקש צוואר) על PAA קשה עם ג'לטין 1% וFITC-. פיברונקטין שכותרת. Invadopodia מזוהה בדרך כלל על ידי colocalization של שני סמנים כגון אקטין וcortactin (אדום וכחול בתמונה השכבה, בהתאמה). Invadopodia ניתן נרשמת כשני פעילים המשפילים (colocalized עם אזורים שחורים מחוסרing אות FITC ככונתה על ידי חצים צהובים) ולא משפיל (כונה על ידי חצים לבנים). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2: assay כוח המתיחה יכול לשמש כדי לקבוע כוחות מתיחה סלולריים שנוצרו על ידי cytoskeleton אקטין על ידי מעקב העקירה של microspheres המשובץ בתמונות שלב וקרינה רחב בתחום PaaS דוגמא של תא SCC-61 על PAA קשה (. "שלב"), וmicrospheres ישירות מתחת לתא במשטח העליון של PAA ("הדגיש"). יכולה גם לקחת תמונה של החלק התחתון של PAA מאוחר יותר לחישוב העובי המקומי שלה ("מלמטה"). לאחר התא מוסר, תמונה נלקחה שוב של microsphereים במשטח העליון של PAA ("ריק"). עמדות Microsphere בין "הדגישו" וניתן לעקוב תמונות "null" להניב "שדה עקירה." התקות Microsphere ותכונות מכאניות PAA לאחר מכן ניתן להשתמש כדי לחשב "שדה כיוון מתיחה." לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של נתון זה.

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לסרטן של המכון הלאומי לבריאות במספר פרס K25CA143412 (פארח). ברצוננו להכיר בכך שתמיכה נוספת סופקה על ידי המחלקה אף אוזן הגרון. התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי לבריאות.