Method Article

טכניקות לעיני עיבוד מושתלים בתותב רשתית למותאם למקום Histopathological ניתוח: חלק 2 Epiretinal שתלים עם נעצי רשתית

DOI:

10.3791/52348

⸱

February 14th, 2015

 ,  ,  ,  ,  , Bionic Vision Australia Consortia
1Bionics Institute, 2Department of Pathology, The University of Melbourne, 3Cochlear Limited, 4Department of Anatomical Pathology, St Vincent's Hospital Melbourne, 5Medical Bionics Department, The University of Melbourne

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מתארים טכניקות היסטולוגיות להדמיית רקמת עין הסמוכה ישירות למתכת אפירטינלית ותותבת רשתית.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תותבות רשתית לטיפול בצורות מסוימות של עיוורון צוברות תאוצה בניסויים קליניים ברחבי העולם עם מכשירים מסחריים שנכנסים כיום לשוק. על מנת להעריך את בטיחותם של מכשירים אלה, במחקרים פרה-קליניים, יש צורך בטכניקות אמינות. עם זאת, רכיבי המתכת הקשה המשמשים בחלק משתלי הרשתית אינם תואמים לתהליכים היסטולוגיים מסורתיים, במיוחד בהתחשב באופי העדין של הרקמה שמסביב. כאן אנו מתארים טכניקות להערכת בריאות העין הסמוכה ישירות לשתל רשתית המאובטח באופן אפירטיני עם מקל מתכת.

תותבות רשתית כוללות מערכי אלקטרודות במגע עם רקמת העין. המיקום הנפוץ ביותר להשתלה הוא המיקום האפירטינלי (החדר האחורי של העין), שבו השתל מאובטח לרשתית באמצעות נעיצת מתכת החודרת לכל שכבות העין. שיטות קודמות לא הצליחו להעריך את רקמת העין הפרוקסימלית עם הנדבק באתרו, בגלל חוסר היכולת של טכניקות היסטולוגיות מסורתיות לחתוך חפצי מתכת. כתוצאה מכך, היה קשה להעריך נזק מקומי, אם קיים, שנגרם על ידי החדרת נעץ.

לכן, פיתחנו טכניקה להמחשת הרקמה סביב נעיצת רשתית ושתל. שינינו טכניקה מבוססת, המשמשת לעיבוד והדמיה של רקמות גרמיות קשות סביב שתל שבלול, עבור הרקמות הרכות והעדינות של העין. כיוונו והטמענו את רקמת העין הקבועה, כולל השתל והידוק הרשתית, בשרף אפוקסי, כדי לייצב ולהגן על מבנה הדגימה. לאחר מכן דגימות משובצות נטחנו, מלוטשות, מוכתמות וצולמו בהגדלות שונות בעומקים מצטברים דרך הדגימה. טכניקה זו אפשרה הערכה אמינה של תקינות רקמת העין והציטו-ארכיטקטורה הסמוכה למתקן המתכת.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רטיניטיס פיגמנטוזה (RP) הוא הפרעה תורשתית הגורמת לאובדן נרחב של קולטני אור, שהם התאים בשכבה החיצונית של הרשתית אחראית על transducing אור, בצורה של פוטונים, לפעילות עצבית. חשוב לציין, בחולים עם RP בדרך כלל יש נוירונים שיורית בשכבות האחרות של הרשתית שלהם שעדיין פועל. תותבות רשתית הן מסוגלות להחזיר כמה ראייה מוגבלת לחולים אלו על ידי מיקוד הנוירונים ששרדו אלה עם גירוי חשמלי כדי להפעיל 1,2 מסלול הראייה שלהם. תוצאות תפיסתי ממחקרים קליניים הראו מבטיחות תוצאות מוקדמות ולאחרונה כמה מכשירים שאושרו לשימוש מסחרי. נכון לעכשיו, יש שלושה מקומות עיקריים אנטומיים בי תותבות רשתית קליניות הוצבו: epiretinally 3,4, subretinally 5,6 וsuprachoroidally 7,8. התקנים שונים עושים שימוש בחומרים שונים וצורתם מותאמתלמיקום שבו הם מושתלים. עם זאת, כולם ליצור תפיסות חזותיות על ידי הפעלת תאי העצב שיורית של הרשתית עם פולסים חשמליים.

יש פוטנציאל לכל תותבת רפואית לניזק לרקמות עקב השפעות מכאניות של המיקום הראשוני או כוחות מתמשכים שלאחר מכן. במקרה של גירוי מושתל, כמו תותבות רשתית, יש שיקול נוסף שהפרמטרים החשמליים צריכים להיות בגבולות בטוחים. בטיחות מטופל היא בעל חשיבות עליונה, ולכן התקנים חייבים להיבדק בקפדנות במחקרים פרה-קליניים לפני קידום להגדרה קליני 9-15. במאמר הנלווה שלנו, שתארנו שיטה להערכת histopathology המקומי של העין סביב שתל ממוקם בחלל suprachoroidal 16. בכתב היד הנוכחית, אנו מתארים טכניקה המאפשרת הדמיה של רקמות העין שמסביב מערך אלקטרודות המודבק על הרשתית epiretinally, בפרה-קליני (Feמודל קו) (איור 1).

מיקום epiretinal הוא העמדה מנוצל בדרך כלל לאיתור תותב חזותית. מערכי אלקטרודה ממוקמים כאן הם מודבקים בדרך כלל לרשתית עם נקודת סימון מתכת שחודרת את כל השכבות של העין 17-20. לפני הטכניקות מתוארות בכתב היד הנוכחי, זה היה קשה להעריך את הרשתית ורקמות אחרות המקיפות את נקודת סימון מייד במדויק. קיבעון עין סטנדרטי באמצעות ניטראלי שנאגרו פורמלין גרם לנזק ברשתית artifactual בשל תנועת ההפרש של הרשתית ולובן העין נגד נקודת סימון הקבוע. לכן כל נזק ממשי שנגרם על ידי סימון ומערך epiretinal לא יכול להיות שנצפה בצורה מדויקת. בנוסף, חתך ברקמת העין לא יכול להתבצע עם נקודת סימון הרשתית באתר כחפצי מתכת לא ניתן לחתוך בקלות עם מנגנון היסטולוגית מסורתי; הסרת סימון לפני עיבוד היסטולוגית היה גםלא רצוי כמו זה גם הוביל לנזק ברשתית artifactual.

מטרת המחקר הנוכחי הייתה כפולה: 1) כדי להפחית artefact היפרדות הרשתית, כך שכל נזק שייגרם על ידי סימון ומערך שתל epiretinal ניתן להעריך באופן מהימן; ו -2) כדי להמחיש את ארכיטקטורת הרשתית סמוכה לנקודת סימון מבלי להסיר אותו. על מנת להשיג מטרת 1, טכניקת קיבעון חדשה נוצלה (כפי שמתוארת במאמר הנלווה 16), אשר מפחית delamination רשתית artifactual. על מנת להשיג מטרה 2, אנחנו שונה הטבעה, טחינה, וליטוש טכניקה, שפותחה במקור עבור בתצפית באתרו של אלקטרודות שתל שבלול 21-23. השיטות שתוארו בכתב היד הזה מאפשרים הדמיה של הרשתית מסביב ובצמוד לנקודת סימון באתר תוך מזעור נזק לרשתית artifactual ולכן מאפשר הערכה מדויקת של כל נזק פוטנציאלי שנגרם על ידי סימון ומערך epiretinal.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: כל ההליכים אושרו על ידי רויאל ויקטוריאני עין ואוזן של ועדת בית החולים בעלי החיים מחקר ואתיקה (RVEEH AEC; # 10-199AB). טופלו הנושאים לפי הבריאות הממלכתית ו" הקוד האוסטרלי עיסוק לטיפול ושימוש בבעלי חיים למטרות מדעיות "של המועצה למחקר רפואי (2013) ואת" צער בעלי חיים Act "(1986; ותיקונים). כל נהלי ההערכה ואלקטרו כירורגים, הקליניים בוצעו בהרדמה וכל המאמצים שנעשו כדי למזער את הסבל.

1. Enucleation וקיבוע

הערה: בצע את הליך enucleation וקיבעון שתואר בפירוט בכתב יד הלוויה 16, מטפלת נוסף סביב כבלי מכשיר או יציאות vitrectomy, אם קיימים. בקצרה, מדובר ב:

  1. Transcardially ינקב את הנושא עם מי מלח חם ואחרי buffe הניטרלי הקרפורמלין האדום.
  2. לקשור תפרים לגלגל העין לשמש כציוני דרך.
  3. Enucleate עין 16, שמירה על כבלי מכשיר וכל תיקון / כרטיסיות קובץ מצורף.
  4. פוסט לתקן את העין בפתרון של דוידסון ל18-36 שעות.
  5. העבר ל -50% אתנול ל6-8 שעות.
  6. העבר ל -70% אתנול ושומר במקרר (4 מעלות צלזיוס) עד לנתיחה.

2. הסרת אלקטרודה וDissection.

הערה: לא כל שתלי epiretinal יהיו את אותו גורם צורה, אבל באופן כללי יהיה מערך אלקטרודות וצורה כלשהי של חומר מוביל גמיש וconformable. מכשירים המודבקים על הרשתית כוללים חור נקודת סימון שבו נקודת סימון המתכת חודר את המערך ואחורי של העין, שמירה על אלה יחד.

  1. Visualise השתל והנקודה שבה מובטחת לרשתית.
    1. באמצעות סכין 15 מעלות לעשות חתך טרנס-קרני היקפי ולהסיר את הכובע של הקרנית לexpOSE הקשתית והעדשה שבבסיס.
    2. באמצעות סכין 15 מעלות, disinsert סיבי zonular של העדשה ולהסיר את העדשה בטוטו, וחושף את התא האחורי עם שתל epiretinal ונקודת סימון המתכת באתר.
  2. בהתאם לשתל והמחקר מתבצעים, להסיר רכיבים זרים לפני נתיחה נוספת.
    הערה: בדוגמא הנוכחית, מערך epiretinal נבחנים כלל חבילת אלקטרודה היהלומים והאלקטרוניקה אב טיפוס הרמטית שוכנת בתוך מנשא סיליקון קונפורמי (מיוצר בבית; מתייחס ל -20).
    1. כאן, לחלץ בזהירות את חבילת אלקטרודה יהלומים על ידי נתיחה בסדר עם אזמל. לעזוב את הגוף של השתל סיליקון יחד עם נקודת סימון הרשתית והשרידים של חיווט הפלטינה (איור 2). אם מערך / דיור מוטבע אינו חלק מעיצוב המכשיר תחת חקירה, ואז להשמיט את הצעד הזה (2.2).
  3. זהירותלנתח מדגם הכולל את סימון ורקמה סובב בכיוון הרצוי. השתמש במספריים לנתיחה קנס לחתוך רצועות בעובי מלאה מהחלק האחורי של העין, כולל לובן העין, דמית העין ורשתית. קח לדוגמה, אשר נותן חתך אורך של נקודת סימון, המציג את כל שכבות הרשתית בסמוך לנקודת סימון (איור 2)
    הערה: הכיוון הרצוי עבור המדגם עשוי להשתנות בהתאם לתוצאה המסוימת הרצויה. לדוגמא, אם רוצה לבחון את קרבתו של נזק נקודת סימון לדיסק האופטי אז הדיסק האופטי צריך להיות כלול בתוך המדגם.

3. התייבשות, הטבעה, הרכבה, ליטוש, מכתים, והדמיה

  1. מייבש את המדגם על פני שלושה ימים בשלבים מתקדמים אתנול:
    1. מייבש את המדגם באתנול 70% עבור שעה 2 פעמיים.
    2. מייבש את המדגם באתנול 80% עבור שעה 2 פעמיים ולאחר מכן O / N.
    3. מייבש את המדגם ב -90% אתנול עבור 2 twic hrדואר.
    4. מייבש את המדגם באתנול 100% עבור שעה 2 פעמיים ולאחר מכן O / N.
  2. מייבש את המדגם באצטון 100% עבור שעה 2 פעמיים.
    1. הסר את המדגם מאצטון ולבחון אותה תחת מיקרוסקופ אור כפי שהאוויר מתייבש בRT. להעביר את המדגם כדי אפוקסי (ראה שלב 3.4) ממש לפני שהוא מתחיל להסתלסל / קריסה.
      הערה: הסרת נוזל מתוצאות הרקמות הרכות בתאים והתכווצות התמוטטו. הערכה של מתי מסתלסל רקמה / הקריסה מתרחשת מפותחת עם ניסיון.
  3. הכן שרף אפוקסי כיתה רפואית בהתאם להוראות יצרן. כדי לרפא את השרף, השתמש באחת 55 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 או 24 שעות בRT. מניחים בתא ואקום ל~ 5 דקות ב~ 50 mbar להסרת בועות אוויר. להסדיר את הוואקום ידני כאבק מוגזם תגרום לתערובת אפוקסי לרתיחה וסילוק גזים לא יתרחשו ביעילות
    הערה: בצע שלב 3.3 במקביל לצעד 3.2.
  4. להטביע את sample בשרף אפוקסי ברור. לטבול את רקמת העין באפוקסי degassed במכל סגר מתאים ולהשאיר O / N ב RT כדי לרפא.
  5. תשמור על עצמך כדי להטביע את המדגם בכיוון הרצוי (איור 2) על ידי שינוי גודל ומחדש הטבעת בלוק אפוקסי נרפא. -להטביע מחדש את הגוש לשנות את הגודל המכיל את רקמת העין, כך שהציר של נקודת סימון הארוך מכוון במקביל לתחתית התבנית (כוס צהובה - איור 3 א).
  6. הר השרף בבעל דגימת טחינה ולטחון את המדגם (230 - 250 סל"ד עם מים על, טחינה ידנית) משתמש בנייר סיליקון קרביד (החל עם 800 רשת; 3C דמויות ו3E).
  7. עבור מכתים, טובל את פני קרקע בכתם כחול toluidine ל3-5 דקות, או עד שכתם המפתחת (איור 3F).
  8. יש לשטוף במים ברז (איור 3G).
  9. תמונת פני הקרקע של הדגימה עם היקף לנתיחה בהספק גבוה כדי להמחיש את השכבות הסלולריות שלרשתית (איור 3H). החל ירידה של מים מזוקקים על פני השטח העליונים של אפוקסי מעל הדגימה כדי להחליק את העקיפה בממשק האוויר אפוקסי. השתמש במקור סיבים אופטי "מתכווננת" אור להאיר את המדגם.
  10. חזור על שלבים 3.6-3.9, בכל פעם שחיקה משם עובי שנקבע מראש של מדגם (תוספת טחינת מינימום מדויקת ושחזור של בעל דגימה היא 20 מיקרומטר).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול הקיבעון באופן משמעותי מופחת ניתוק וdelamination של 16 רשתית artifactual. אוריינטציה של הדגימה בתוך בלוק אפוקסי הושגה באופן עקבי באמצעות התהליך בן שני שלבים שתואר הטבעה. הליך שחיקה מצטבר נדרש רמה מתונה של מיומנות ידנית על מנת להשיג תוצאות אופטימליות, אבל נעזר בבעל הדגימה מתכווננת אשר סיפק בקרה טובה על הרזולוציה תוספת. בכל המקרים (n = 5) נקודת סימון היה ממוקם במקום והקרקע / מלוטש עם תוצאות רצויות ועקביות. רשתיות סמוכות לנעצים היו פתירות ומוכתמות כראוי. ליטוש פני השטח של בלוק שרף אפוקסי עם # 800 נייר סיליקון קרביד P הכיתה היה מספיק כדי תמונת macrostructure הסלולרית של הרקמה המוטבעת. נייר גבוה יותר בכיתה, או slurry יהלומים עשוי לשמש כדי למרק נוסף פני השטח בכל עומק נתון אם תרצה בכך. מיקרוסקופ לנתיחה וסיבים אופטיים "מתכווננת" ניהול תאורההמקור לא נמצא מתאים להדמיה את פני השטח של בלוק הקרקע ודגימת הרקמה המוטבעת. המיקום של מקור האור היה מגוון על ידי ניסוי וטעייה כדי למצוא את מיקום וזווית שנתן התאורה ולעומת זאת הטובות ביותר מבעד למיקרוסקופ. מוסיף טיפה של מים מזוקקים על פני השטח של הבלוק, מעל המדגם, היה שימושי כדי להפחית את עקיפת אור דרך ו / או עיוותים חלקות בממשק אוויר אפוקסי. איור 4 מראה תמונות דוגמא של רקמת רשתית דמיינו מייד בסמוך לרשתית טיטניום טקטיקת שימוש בטכניקה זו. היפרדות רשתית ללא artifactual ומתקפל שניתן לראות משני צדי סיליקון (איור 4 א). פיר סימון גלוי משובץ בסיליקון; ראש נקודת סימון חדרה הרשתית ולובן העין. יש היפרדות רשתית אינה artifactual ברשתית שני הצדדים בלא כתם של סיליקון (איור 4C). הטכניקה הוכיחה כי, במקרה זה, יסדואר הוא חוסר ארגון ברשתית בסמוך לנקודת סימון והדחיסה של הרשתית בצד אחד, בשל זווית אלכסונית הכנסה. שים לב כי התמונות שהוצגו הן רק איורים של ההצלחה של הטכניקה, לא נציג של histopathology נקודת סימון-נזק באופן כללי.

figure-results-1
איור 1. מיקום של מערך אלקטרודות epiretinal. (א) תרשים סכמטי של העין מראה חתך מוגדל של לובן העין האחורי, דמית העין ורשתית מנוונת (חסר קולטניות אור). מערך אלקטרודות מתואר בכחול, מודבק epiretinally. (ב) בעזרת מחשב-ציור של מערך אלקטרודות epiretinal. , משולב במעגל ('שבב') וחבילת האלקטרודה; ב, טיטניום נקודת סימון רשתית; ג, דיור סיליקון רפואי; ד, נקודת יציאה ליתרון. לוח שונה מillustrati מקוריבאדיבות סיפקה של Bionic Vision Australia, זכויות היוצרים בית קרוצ'ה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-2
איור 2. הסרת אלקטרודה ונתיחה של העין. צילומי מאקרו טווח דינמי הגבוה של עין חתולית enucleated עם נקודת סימון epiretinal באתר. () קיבעון הודעה עם המקבע של דוידסון לשימור ארכיטקטורת רשתית 16, עין enucleated הייתה גזור. חבילת מערך אלקטרודות הוסרה מנישא סיליקון (מתאר רבוע מקווקו מציין את מיקום מקורי של מערך אלקטרודות) עם סימון (חץ) וגוף של השתל סיליקון שנותר. (B) עין הייתה גזור עם חתך אורכי הסמוך ל נקודת סימון(קו מקווקו). נקודת סימון נשאר תקוע בקיר האחורי של עיינית (חץ), התייצב בעיקר על ידי לובן העין. סעיף הרקמה המכיל את נקודת סימון היה מוכן להטבעת שרף וטחינה (מגזר ימין), ואילו הסעיף המכיל את הרשתית מתחת למערך אלקטרודות שהוסר היה מוכן לעיבוד סטנדרטי היסטולוגית 16 (קטע משמאל). שליט עם מרווחים של 0.5 מ"מ מוצג בקצה התחתון של כל לוח. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-3
איור 3. embedment אפוקסי וטחינה של סימון ורקמת רשתית. תצלומים של אפוקסי המשובץ ודגימת רקמה מיושרת, טחינה, מכתים והדמיה של סימון ורקמת רשתית. () מיקס מדגם k היה מוטבע בגוש שרף אפוקסי. השימוש בתבנית, מדגם אוריינטציה כך מטוס האורך מקביל לתחתית התבנית. (ב) הבלוק נרפא אפוקסי המכיל מדגם נקודת סימון. (C) בלוק אפוקסי הוצגה בבעל דגימת טחינה, מוכן לטחינה . (ד) המדגם חוקיים מקטעים כך הדמיה של רקמות הקרקע מכילים את שכבות הרשתית סלולריות וציר אורך של סימון. (E) המדגם היה קרקע משתמש בנייר סיליקון קרביד על מטחנה סיבובית. (F) משטח הקרקע של הבלוק היה מוכתם בtoluidine הכחול לזהות שכבות רשתית. (G) הבלוק נשטף במים ברז כדי להסיר כתם עודף. (H) toluidine שכבות כחולות מוכתמות ברשתית וסימון היו צילמו באמצעות היקף נתיחה מופעל גבוה.

מודעה / 52,348 / 52348fig4highres.jpg "/>
איור 4. כוח תמונות גבוהות ונמוכות של נקודת סימון והרשתית. בנקודות שונות במהלך תהליך טחינת התמונות צולמו בהיקף לנתח, מראה סעיפים אורך של נקודת סימון (כוכבית) חודר דרך העין ויציאה בלובן העין ('S' ), סמוך סיליקון (חשיש) וtoluidine כחול מוכתמים ורשתית בלא כתם ('R'). שים לב אלה הם תמונות דוגמא רק כדי להדגים את טכניקת ההדמיה ההווה, ואינם מייצג את כל תוצאות היסטולוגיה החדרת השתל או נקודת סימון epiretinal. שרידי קרקע של חיווט הפלטינה נראים בלוחות לספירה ('W'). (א) צריכת חשמל נמוך, תמונה ללא רבב של נקודת סימון חודר הרשתית ולובן העין. תמונה רבה עוצמה של היפרדות הרשתית (B) ומתקפל ברשתית בלא כתם סמוך למוביל סיליקון בתמונת כוח תמונת א '(C) נמוכה במרכז פיר סימון. (E) במדגם נפרד (D), ללא ספק סיליקון, תמונה המופעלת גבוהה של רשתית צבעונית הכחולה toluidine מתחת לידית נקודת סימון מוצגת, מייד לפני טחינת פיר סימון ארכיטקטורת רשתית צבעונית כחולה toluidine רגיל (F) (GCL: שכבת תאי הגנגליון ברשתית; INL: שכבת גרעין פנימית; ONL: שכבה חיצונית גרעינית; יחסי ציבור: קולטני אור; T: שכבת מחזירת אור של חתולים). דמיין באותה הטכניקה שחיקה . ברים סולם בכל לוח הם: A ו- C = 2 מ"מ; B ו- D = 500 מיקרומטר; E = 200 מיקרומטר; F = 100 מיקרומטר.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טכניקות היסטולוגית סטנדרטיים איננו יכולות לעבד את שתלי מתכת קשים באתר בשל מגבלות בחיתוך אובייקטים אלה עם מתכת, זכוכית או אפילו להבי יהלום. נייר הלוויה שלנו 16, הראה שהשימוש בטכניקת קיבוע כל-עין שונה יכול להפחית delamination רשתית artifactual. בכתב היד הנוכחית, טחינה הוקמה וליטוש טכניקה המאפשר הדמיה שתלי שבלול 21-23 באתר שונה לתותבות רשתית. נקודת סימון טיטניום, המשמש לאבטחת מערך אלקטרודות לרשתית, epiretinally, הייתה מוטבע באפוקסי יחד עם רקמות העין שמסביב. בלוק שרף אז זה היה מכוון כראוי וקרקע בהדרגה / מלוטש כדי לחשוף את מורפולוגיה הרקמה מייד בסמוך לנקודת סימון המתכת. תמונות של פני השטח המלוטשים של הגוש בעומקים שונים צולמו עם מיקרוסקופ לנתיחה חזק. טכניקה זו שימושית עבור: חזותי וevaluating תגובת הרקמות סמוכה לשתל epiretinal; כדי להעריך את הטראומה הניתוחית הקשורים בהשתלה של השתל; כדי לקבוע את התגובה הביולוגית לרכיבי מתכת קשים; ולמדוד את המרחק בין השתל ואת פני השטח של הרשתית.

טכניקה זו תהיה שימושית בעתיד מחקרי בטיחות בהדמיה באתרו של האזור הסמוך לנקודת סימון רשתית או (לדוגמא, מתכתי) חפצים אחרים קשים בעין. זו יש יישום ישיר בהערכת הבטיחות פרה-קלינית של תותבות מודבקות על הרשתית epiretinally. זה יכול להיות גם שימושי להערכת נזק לרקמות באזורי רשתית במגע עם שתלים ממוקמים במיקום תת-רשתית.

ישנן מספר דרכים כדי לוודא שהטכניקה שבוצעה כהלכה. בכל שלב, הרשתית צריכה להישאר מחובר אל השכבות החיצוניות של העין. אם יש היפרדות רשתית artifactual ברוטו, זה עשוי הודיאכל בעיה עם הקיבעון. כאשר המדגם הוא משובץ ומחדש חוקיים בשרף הסופי לחסום את הרשתית צריך להיות קרוב למאונכים עם-טחינת הפנים של הבלוק; זה יהיה למזער חיתוך אלכסוני. כדאי לבדוק שמספר צעדי שחיקה מצטברים (של גודל צעד ידוע) נדרש לעבור אובייקט (כגון סימון ברשתית) לתאם בהתאם לממדים של האובייקט.

הטכניקה יכולה להיות מותאמת בכמה דרכים. סריטות על פני השטח של בלוק אפוקסי הקשורים בתהליך שחיקה יכולות להיות מופחתות עם ליטוש עדין כיתה בהדרגה. לצורך המחקר הנוכחי, השתמשנו 800, 1000, 1200, 2400, 4000 ונייר סיליקון קרביד הכיתה. להדביק יהלומים יכולים לשמש גם כדי לשפר את לסיים את פני השטח. לסיים את פני השטח עדינים נותן תמונה באיכות גבוהה אך במחיר של זמן ליטוש נוסף. שיקול מרכזי נוסף לשיפור התוצאה של טכניקה זו הוא הבחירה והאיכות של optics ותאורה המשמשים ללכידת התמונה. כתמים אחרים בסיסיים היסטולוגית - במיוחד כתמי Nissl, ניתן להשתמש במקום של toluidine כחול, אבל עשוי לדרוש אופטימיזציה נוספת. כתמים מסוימים להכתים את השרף, כמו גם את הרקמות (למשל, Eosin), ולכן ייתכן שיהיה צורך פולני רדוד לאחר הצביעה כדי להסיר discolouration רקע. כתמים המתמחים, צבעי ניאון והמכתים immunohistochemical לא ניסו, אבל אם תוצאה מאוד ספציפית היא רצויה, הזמן הנדרש לביצוע כתמים אלה בכל רמה שחיקה עשוי להיות מונע. עם זאת, ייתכן שניתן להכתים את הרקמה כולה לפני שלב ההטבעה (שלב 3.4) 24.

המגבלה העיקרית של שיטה זו היא שברגע שהאזור של עניין כבר השחיז, לא ניתן יהיה לאחזר אותו, ולכן, זה נבון כדי ללכוד תמונות רבות (אולי מיותר) במגוון רחב של הגדלה בכל שלב של השחזה וליטוש. זהחשוב גם להשתמש במרווחים קטנים עבור כל התאמת עומק שחיקה. מגבלה נוספת של שיטה זו היא ששל הגדלה האופטית ורזולוציה בהשוואה לרקמה רכובה על שקופיות זכוכית ונצפתה עם מיקרוסקופ רגיל (שידור) אור. לעניין prototyping והערכת הבטיחות של מכשיר שתל רומן, ההערכה פתולוגית ברוטו היא עניין עיקרי. טכניקה זו מספקת שיטה יעילה להתבוננות נזק רלוונטי קליני הקשורים לנקודת סימון רשתית. בעזרת תרגול, הזמן הכולל הנדרש כדי לאסוף לטחון, פולני ולצלם דגימה נתון (מוטבעת פעם אחת) הוא דומה לזמן שייקח לסעיף בלוק פרפין או סעיף קפוא.

יש גם פוטנציאל לטכניקות הנוכחיות ליוארך ליישומים מחוץ להיקף של שתלי רשתית. טכניקה זו מתאימה להערכת הרקמה סמוכה לשתל קשה, שבו הפקת שתל היא לא feasible או יפגע בממשק. לדוגמא, טכניקה זו יכולה להיות מורחבת כדי להעריך שתלים עשויים ממתכת (לדוגמא, פלטינה, ניטינול, וכו ') שלא ניתן לחתוך עם טכניקות היסטולוגית קונבנציונליות, כגון כמה מוח עמוק או אלקטרודות עצבים היקפיים, cannulae עבור משלוח סמים, סטנטים כלי דם או שתלים אורתופדיים.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לסופרים אין מה לחשוף. אירפאן דורמו הוא עובד של Cochlear Ltd.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניקול ולה (אוניברסיטת מקווארי) לאספקת ריאגנטים; אלכסיה סונדר (מכון ביוניקה; BI), מישל מקפדרן (BI), כריס וויליאמס (BI) לתמיכה ניסיונית; צוות מרכז המחקר הביולוגי של בית החולים המלכותי הוויקטוריאני לעיניים ואוזניים (RVEEH) לטיפול בבעלי חיים; סו פירס (RVEEH) לייעוץ וטרינרי; אנתוני בורקיט (Bionic Vision Australia; BVA), תמרה בראון (BVA) וצוות BVA לתמיכה אדמיניסטרטיבית.

מחקר זה נתמך על ידי מועצת המחקר האוסטרלית (ARC) באמצעות יוזמת המחקר המיוחדת שלה (SRI) במענק מדע וטכנולוגיה של ראייה ביונית ל-Bionic Vision Australia (BVA). מכון ביוניקס מקבל תמיכה בתשתיות תפעוליות מהממשלה הוויקטוריאנית ומכיר גם בתמיכה מקרן משפחת ברטלי וקרן הצדקה ג'יי טי ריד. למממנים לא היה כל תפקיד בתכנון המחקר, איסוף וניתוח נתונים, החלטה לפרסם או הכנת כתב היד.

המחברים של Bionic Vision Australia Consortia עבור כתב יד זה הם (a-z):

פנלופה ג'יי אלן, אוון ברנס, קייט א. פוקס, קומראבלו גנסאן, דייוויד ג'יי גארט, המיש מפין, ג'ואל וילאלובוס וג'ונתן יאו.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
אצטוןChem-SupplyAA008פרופנון BHD רפואי
כיתה Epo-Tek 301אפוקסי אפוקסי טכנולוגיהחלק א' 1675-54-3 חלק ב' 9046-10-0
אתנול 70-75% v/vMerck PTY בע"מ4.10261אלכוהול
אתנולMerck PTY בע"מ90143אלכוהול
טולואידין כחול Oסיגמא-אולדריץ'T3260
Ethylenediamine חומצה טטראצטיתSigma-Aldrich
TegraPol מכונת שחיקה/ליטושStruersTegraPol-25
מחזיק דגימה AccuStopStruersAccustop
מיקרוסקופ אורLeicaMZ16
עדשת אובייקטיביתLeica2.0x Planapo אובייקטיבי
מיקרוסקופ דיגיטלי מצלמהLeicaDFC-420C
Leica חבילת יישומים v4.1.0
תוכנת מיקרוסקופ

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shepherd, R. K., Shivdasani, M. N., Nayagam, D. A., Williams, C. E., Blamey, P. J. Visual prostheses for the blind. Trends Biotechnol. 31, 562-571 (2013).
  2. Santos, A., et al. Preservation of the inner retina in retinitis pigmentosa. Arch Ophthalmol. 115, 511-515 (1997).
  3. Humayun, M. S., et al. Visual perception in a blind subject with a chronic microelectronic retinal prosthesis. Vision Res. 43, 2573-2581 (2003).
  4. Roessler, G., et al. Angiographic findings folowing tack fixation of a wireless epiretinal retina implant device in blind RP patients. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 249, 1281-1286 (2011).
  5. Chow, A. Y., et al. The artificial silicon retina microchip for the treatment of vision loss from retinitis pigmentosa. Arch Ophthalmol. 122, 460-469 (2004).
  6. Zrenner, E., et al. Subretinal electronic chips allow blind patients to read letters and combine them to words. Proc Biol Sci. 278, 1489-1497 (2011).
  7. Fujikado, T., et al. Testing of semichronically implanted retinal prosthesis by suprachoroidal-transretinal stimulation in patients with retinitis pigmentosa. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, 4726-4733 (2011).
  8. Saunders, A. L., et al. Development of a surgical procedure for implantation of a prototype suprachoroidal retinal prosthesis. Clin Experiment Ophthalmol. , (2013).
  9. Lee, S. W., et al. Development of microelectrode arrays for artificial retinal implants using liquid crystal polymers. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 5859-5866 (2009).
  10. Sakaguchi, H., et al. Transretinal electrical stimulation with a suprachoroidal multichannel electrode in rabbit eyes. Jpn J Ophthalmol. 48, 256-261 (2004).
  11. Majji, A. B., et al. Long-term histological and electrophysiological results of an inactive epiretinal electrode array implantation in dogs. Invest Ophthalmol Vis Sci. 40, 2073-2081 (1999).
  12. Walter, P., et al. Successful long-term implantation of electrically inactive epiretinal microelectrode arrays in rabbits. Retina. 19, 546-552 (1999).
  13. Ray, A., Chan, L., Thomas, B., Weiland, J. D. Effects of prolonged stimulation at the electrode-retina interface. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 1, 1285-1287 (2006).
  14. Colodetti, L., et al. Pathology of damaging electrical stimulation in the retina. Experimental eye research. 85, 23-33 (2007).
  15. Nayagam, D. A. X., et al. Chronic Electrical Stimulation with a Suprachoroidal Retinal Prosthesis: A Preclinical Safety and Efficacy Study. PLoS One. 9, e97182(2014).
  16. Nayagam, D. A. X., et al. Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50411(2013).
  17. Laube, T., et al. Development of surgical techniques for implantation of a wireless intraocular epiretinal retina implant in Gottingen minipigs. Graefe's Archive For Clinical And Experimental Ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur klinische und experimentelle Ophthalmologie. 250, 51-59 (2012).
  18. Gerding, H., et al. Successful long-term evaluation of intraocular titanium tacks for the mechanical stabilization of posterior segment ocular implants. Mat.-wiss. u. Werkstofftech. 32, 903-912 (2001).
  19. Seo, J. -M., et al. Silicon retinal tack for the epiretinal fixation of the polyimide electrode array. Current Applied Physics. 6, 649-653 (2006).
  20. Hadjinicolaou, A. E., et al. Electrical stimulation of retinal ganglion cells with diamond and the development of an all diamond retinal prosthesis. Biomaterials. 33, 5812-5820 (2012).
  21. Briggs, R. J., et al. Comparison of round window and cochleostomy approaches with a prototype hearing preservation electrode. Audiol Neurootol. 11, Suppl 1. 42-48 (2006).
  22. Shepherd, R., et al. An improved cochlear implant electrode array for use in experimental studies. Hear Res. 277, 20-27 (2011).
  23. Tykocinski, M., et al. Comparison of electrode position in the human cochlea using various perimodiolar electrode arrays. Am J Otol. 21, 205-211 (2000).
  24. Hardie, N. A., MacDonald, G., Rubel, E. W. A new method for imaging and 3D reconstruction of mammalian cochlea by fluorescent confocal microscopy. Brain Res. 1000, 200-210 (2004).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Retinal ProsthesisEpiretinal ImplantMetal TackEpoxy Resin EmbeddingTissue DehydrationProgressive GrindingToluidine Blue StainingHigh Power Dissection MicroscopeCross Sectional ImagingOcular Tissue Analysis

Related Articles