מאמר שיטה

שיטות להערכת Cytotoxicity ודיכוי חיסוני של תכשירי מוצרים דליקים טבק

DOI:

10.3791/52351

⸱

10 בינואר 2015

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Wake Forest University Health Sciences, 2R&D Department, R.J. Reynolds Tobacco Company

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באמצעות מבחני תאים חד-גרעיניים מדם היקפי אנושי (PBMC) ex vivo, הראינו כי תכשיר מוצר טבק דליק מדכא באופן ניכר ציטוקינים המופרשים תוך תאיים בתיווך קולטנים ויכולת ציטוליטית של PBMCs אפקטיביים. בדיקות מהירות אלה עשויות להיות שימושיות בהערכת המוצר והבנת ההשפעות הפוטנציאליות ארוכות הטווח של חשיפה לטבק.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בין שינויי pathophysiological אחרים, חשיפה כרונית לעשן סיגריות גורמת לדלקת ודיכוי מערכת חיסונית, אשר נקשר לרגישות מוגברת של מעשנים לזיהומי חיידקים ושכיחות גידולים. Ex vivo דיכוי של מערכת חיסונית בתיווך קולט בתאי הדם היקפיים mononuclear אנושיים (PBMCs) טופל במרכיבי עשן הוא גישה אטרקטיבית ללמוד מנגנונים ולהעריך את ההשפעות ארוכת הטווח הסבירה של חשיפה למוצרי טבק. כאן, אנו מותאמים שיטות לבצע מבחני vivo לשעבר באמצעות PBMCs מגורה על ידי lipopolysaccharide חיידקים, יגנד רצפטור-4-כמו אגרה. ההשפעות של מדיום כל ממוזג עשן (WS-CM), הכנת מוצר טבק דליק (TPP), וניקוטין נחקרו על הפרשת ציטוקינים והרג תאי מטרה על ידי PBMCs במבחני vivo לשעבר. אנו מראים כי ציטוקינים מופרשים IFN-γ, TNF, IL-10, IL-6, IL-8 וציטוקינים תאיים IFN-47 ;, TNF-α, וMIP-1α דוכאו בPBMCs החשופה-WS-CM. פונקצית cytolytic של PBMCs מפעיל, כפי שנקבעו על ידי assay תא מטרת K562 הורג גם מופחתת על ידי חשיפה לWS-CM; הניקוטין היה מינימאלי יעיל במבחנים אלה. לסיכום, אנו מציגים סדרה של מבחני השתפרו להעריך את ההשפעות של עקר במבחני vivo לשעבר, ושיטות אלה יכולים להתאים בקלות לבדיקת מוצרים אחרים בעלי עניין.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גוף משמעותי של נקודות ידע לתופעות לוואי הבריאותיות של עישון סיגריה כרוני, כולל מחלות לב וכלי דם (CVD), מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD) וסרטן 1,2. עישון סיגריות כרוני כבר ידוע לגרום לדלקת ודיכוי מערכת חיסונית, ושינויים אלה דיווחו לתרום לעלייה בסיכון לזיהום חיידקים וסרטן במעשנים 3. במבחנה וטכניקות vivo לשעבר שימושיות בהבהרת הבסיס המולקולרי של תופעות pathophysiological של עשן סיגריות 4-9 (טבלת 1) ומוכרות ככלים חשובים להדרכת תקנה החדשה של מוצרי טבק שונים 10,11.

לדוגמא, יש לנו הפגנו כי הכנות דליקים מוצר טבק (בעקר) כגון בינוני כל-מותנה עשן (WS-CM) וחומר חלקיקים כולל (TPM) הן הרבה יותר רעילות לתאים ומזיק לDNA מאשר בעקר או ניקוטין 12,13 אינו דליקים. עולה בקנה אחד עם העבודה שפורסמה, היא דיווחה לאחרונה כי בעקר או ניקוטין 12,13 דליקים. עולה בקנה אחד עם העבודה שפורסמה, שדיווחנו לאחרונה כי בעקר דליק גרם דיכוי חיסוני משמעותי. זה מעיד דיכוי Toll- כמו קולט -ligands (TLR), מגורה הפרשת ציטוקינים, וממוקד תא (K562) ההמתה בPBMCs במודל vivo לשעבר 14. בהתחשב במשמעות של דלקת בתהליכי מחלה נגרמים על-עשן סיגריות, אופטימיזציה נוספת של תנאי assay כדי להעריך את השפעות modulatory חיסון של עשן סיגריות מוצגת בדוח זה.

Vivo לשעבר מבחני בדרך כלל נמדדים תוך-תאיים ומופרשים ציטוקינים כמו גם הפונקציה של cytolytic ציטוטוקסיות תאי T וNK בתא K562 הורגת מבחני 14. מבחני מעורבים מראש דגירה עם WS-CM וניקוטין והגירוי הבא של PBMCים עם TLR אגוניסטים על פני תקופה של 3 ימים; הקריאות הסופיות מבוצעות באמצעות מבחני צמודי אנזים immunosorbent (ELISAs) ו / או cytometry זרימה. אנו מנוצלים lipopolysaccharide חיידקים (LPS), אשר נקשר לקולטנים TLR-4 ומעורר PBMCs כתוצאה מכך הייצור של ציטוקינים והפרשה של ציטוקינים תאיים. בנוסף לאופטימיזציה של צעדי assay השונים להערכת השפעות המערכת החיסונית של עקר, אנחנו גם שיטות הנוכחיות לPBMCs בידוד, מבחני מוות של תאים, ו- IL-8 כימות. שיטות אלה עשויות להיות מיושמות מטרה לענות על שאלות מחקר אחרות ומעודנות יותר כדי להעריך מוצרי טבק בהקשר הרגולטורי.

טבלת 1. פורסם דיווחים על במבחנה ושיטות לשעבר vivo משמשות ללמוד אפקטי pathophysiological varilus של הכנות מוצר טבק CS, בינוני עשן סיגריות.; CSC, עיבוי עשן סיגריות; מנוע חיפוש מותאם אישית, תמצית עשן סיגריות; ELISA, אנזים צמוד immunosorbent assay; GADPH, glyceraldehyde dehydrogenase 3-פוספט; qPCR, תגובת שרשרת של פולימראז כמותיים; RT, תגובת השרשרת של פולימראז כמותיים זמן אמת; TS, עשן טבק.

מחבר (שנת הלימוד) אל Laan et. (2004) אל מודי et. (2004) אל Oltmanns et. (2005) Vayssier (1998) אל Witherden et. (2004) אל Birrell et. (2008)
תאים המשמשים תאים אנושיים הסימפונות האנדותל (BEAS-2B), נויטרופילים אדם תאים אנושיים alveolar אפיתל (A549) תאי שריר חלקים בדרכי נשימה אנושיות (HASMC) תאים אנושיים premonocytic U937, מונוציטים אדם סוג מכתשי II תאי אפיתל (ATII) monocytic אדםשורת תאים (THP-1), מקרופאגים ריאות אנושיים
TPP משמש מנוע חיפוש מותאם אישית CSC מנוע חיפוש מותאם אישית TS מנוע חיפוש מותאם אישית CS
שיטה ELISA, qPCR, הגירה, שינוי electromobility Immunohisto-כימיה, אלקטרופורזה, ערכת Arrayscan, RT-PCR, ELISA ELISA, RT-PCR, qPCR, אלקטרופורזה משמרת ג'ל ניידות מיקרוסקופ אור, מיקרוסקופ אלקטרונים, אלקטרופורזה, ELISA qPCR, ELISA, ערכת E-toxate (Sigma), assay צלחת p65 (TransAM), אלקטרופורזה, ערכות immunoassay שונות
מדד IL-8, GM-CF, AP-1, NF-κB, הגירה acetyltransferases היסטון, deacetylases היסטון, NF-κB, IL-8, PI κB-α, GADPH HO-1, GADPH, RANTES, IL-8, eotaxin חלבוני הלם / עומס חום (HSP / Hsp70), גורם שעתוק HF, NF-κB,TNF-α חלבון פעילי שטח (SP-A, SP-C), IL-8, MCP-1, GRO-α, TNF-α, IL-1β, IFN-γ IL-8, IL-1β, IL-6, TNF-α, MIP1-α, GRO-α, MAPK / JNK / זירחון ERK, cJUN: DNA מחייב, גלוטתיון, p65: DNA מחייב
תוצאה סופית מנוע חיפוש מותאם אישית מטה-מווסת את ייצור ציטוקינים באמצעות דיכוי ההפעלה AP-1. H 2 O 2 וCSC לשפר acetylation של חלבוני היסטון, להקטין פעילות deacetylase היסטון, באופן דיפרנציאלי להסדיר שחרור ציטוקינים מעודדי דלקת. עשן סיגריות עלול לגרום לשחרורו של IL-8 מHASMC, משופר על ידי TNF-α, CSE 20% פחות שחרור IL-8, עיכוב של eotaxin וטווחים על ידי עשן סיגריות. TS הופעל גורם שעתוק HF, שהיה קשור עם ביטוי יתר Hsp70 ועיכוב של NFkB מחייב פעילות ושחרור TNF-α. alveo רמות chemokine תאים שמקורם ATII מופחת פשרהתיקון lar, תורם לנזק סיגריה מושרה עשן alveolar ואמפיזמה. נתונים לספק הסבר מכניסטי לזיהומים בדרכי הנשימה מדוע מעשנים גדלו. דיכוי התגובה המולדת מלווה בעלייה בIL-8.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: נכתב על הסכמה מהדעת לעשות מחקר זה התקבלה ביחידת מחקר קלינית מקומית באישור IRB, לשיטות עבודה קליניות טובות. עיבוד של דם, בידוד של PBMCs וניסויים תרבית תאים אחרים מבוצע בתנאים סטריליים, באמצעות אספקת microbiologically סטרילי וחומרים כימיים.

1. WS-CM הכנה

  1. צור WS-CM כפי שתואר קודם לכן 12.
    1. הכן WS-CM על ידי העברת עשן מארבע 3R4F סיגריות התייחסות דרך Roswell Park זיכרון מכון (RPMI) מדיום 1640 ללא פנול האדום באמצעות משטר העישון הבא: 35-60-2, עלים נפח במ"ל, מרווח נשיפה בשניות, ומשך נשיפה בשניות, בהתאמה. כל הכנה יוצרת מדגם 20 מיליליטר.
  2. צינור לייבל (ים) עם תאריך, השעה הושלמה, ושם סיגריה ומספר. אחסן 500 aliquots μl ב -80 ° C מייד לאחר העישון הושלם.
  3. לנתח aliquots של WS הקפוא-CM כדי לקבוע את רמות ניקוטין, nitrosamines הספציפי הטבק, ופחמימנים ארומטיים polycyclic כפי שתואר קודם לכן 12.

2. בידוד של PBMCs

  1. איסוף דם טרי מתורמים בריאים (שאינם צרכנים של מוצרי טבק) לבודד PBMCs מהדם טרי כמפורט להלן תחת אישור נפרד משרות היער המטביל בריאות 15 IRB.
    1. לפני הגעתו של תיק הדם, יש לו בקבוק 500 מיליליטר, מספריים, חיץ בידוד, ומלוח של Dulbecco פוספט שנאגרו (DPBS) (RT) מוכן במנדף תרבית תאים ברמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL-2). חיץ בידוד חייב להיות מוגן מפני אור.
    2. החזק את שקית הדם הפוך ולחתוך את הצינור ממש מתחת איפה זה כבר הידק עוזב לפחות 3 סנטימטר של צינורות.
    3. הסר את מכסה בקבוק 500 מיליליטר והחזק את הצינור מעל פתח הבקבוק. להרים את שקית הדם ולהפוך אותו כדי לאפשר לדם לזרום באופן חופשי מהשקית לתוך tהוא הבקבוק עד השקית ריקה. לאפשר לדם לזרום לקיר הפנימי של הבקבוק לעומת ישר למטה, כדי למנוע יצירת בועות.
    4. יוצקים חיץ בידוד לבקבוק של 1: 5 יחס של חיץ בידוד לדם. מכסה את הבקבוק היטב בעדינות להפוך אותו, סוף-על-קצה, 10 פעמים. השאר את הבקבוק בשכונה תרבית תאים כדי לדגור עם אורות כבויים, עבור שעה 1 ב RT.
    5. שכבת אור, בצבע קש תהיה לבנות מעל הדם. הסר שכבה זו בעזרת פיפטה 25 מיליליטר סרולוגית לצינורות 50 מיליליטר חרוטי. הסכום שנאסף עשוי להשתנות 50-300 מיליליטר, בהתאם לנושא שתרם דם.
    6. בצנטריפוגה הצינורות ב XG 200 עבור 10 דקות ב RT.
    7. לשאוב supernatant השקוף, ומשאיר את הכדור בצבע הדם הכהה. גלולה תהיה רופפת, אבל צמיגה.
    8. פיפטה 3 מיליליטר של חיץ בידוד ל -15 מיליליטר צינורות חרוטי.
    9. לגלולה הגלולה, להוסיף 20 מיליליטר של DPBS לכל 50 מיליליטר של נוזל בצבע קש שנאסף ביםTEP 2.1.5. המערבולת לערבב ביסודיות, ולאחד את נוזל resuspended מצינורות מרובים. נוזל זה מכיל מושעה תאי דם.
    10. עם pipet העברה, העברת 5 מיליליטר של תאי הדם הושעו על 3 מיליליטר של חיץ בידוד בשלב 2.1.8. הטה את צינור חרוטי 15 מיליליטר המכיל את ההשעיה התא לאט ובעדינות כדי ליצור שתי שכבות נפרדות. בצנטריפוגה הצינורות ב 400 XG במשך 40 דקות ב RT עם ההאצה מינימאלית וללא בלם.
    11. השתמש pipet העברה כדי להסיר את השכבה וכתוצאה מכך מעונן אמצע (מעיל באפי) המכילה PBMCs לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר. הימנע מציור שכבות ברורות השנייה מתחתיה. העבר את לא יותר מ- 25 מיליליטר לכל צינור חרוטי 50 מיליליטר.
    12. הוסף 25 מיליליטר של חיץ קר ריצה (או יותר כדי למלא את כל הנפח הנותר של צינור חרוטי 50 מיליליטר) לשטוף את התאים. צנטריפוגה התאים ב 400 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
    13. Resuspend גלולה עם 10 מיליליטר הפעלת מאגר. זה מכיל PBMCs. ספירת התאים ולהשתמש immediately או מניח על קרח להקפאה.

3. הקפאה להפשרת PBMCs

  1. צנטריפוגה PBMCs שנאספו בשלב 2.1.13 עבור 10 דקות ב 400 x גרם.
  2. מלא את מיכל ההקפאה עם אלכוהול איזופרופיל להוראות היצרן. זהירות: אלכוהול איזופרופיל הוא דליקה ורעילה בחריפות.
  3. Resuspend גלולה עם מדיום RPMI 1640 (4 מעלות צלזיוס) המכיל 20% בסרום שור עוברי (FBS) ו -10% sulfoxide דימתיל (DMSO). זה RPMI 1640 בינוני הקפאה. Resuspend גלולה עם סכום של הקפאה בינונית שיגרמו להשעיה יש כ 5 x 10 7 תאים / מיליליטר. מספר התאים זמינים להקפאה ישתנה.
  4. לוותר על 1 מיליליטר aliquots של השעיה תא לתוך 2 cryotubes מיליליטר ולמקם את cryotubes במכל ההקפאה. מניחים את מיכל ההקפאה עם cryotubes במקפיא ב -80 ° C לאחסון O / N ולאחר מכן להסיר את cryotubes ולהעביר לאחסון במקפיא קריוגני בין -150 ° C עד -190 ° C.
  5. הסר את cryotube מאחסון קריוגני ולהפשיר אותו במהירות עם תסיסה עדינה באמבט מים ב 37 ° C.
  6. מייד להעביר את PBMCs המופשר בcryotube לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר עם 10 מיליליטר מדיום 1640 RPMI שלם (4 ° C) המכיל 10% FBS, 1% פן / סטרפטוקוקוס ו -1% L- גלוטמין. התוכן של cryotube המופשר יש להעביר בהקדם האפשרי כדי להשיג תא מקסימאלי כדאיות 15.
  7. צנטריפוגה PBMCs ב 400 XG במשך 10 דקות.
  8. Resuspend גלולה עם מדיום 1640 RPMI מלא 5 מ"ל ולספור את התאים.
  9. למדוד כדאיות תא על ידי שיטות ותיקות כגון שיטת הרחקת trypan הכחולה. בדרך כלל כדאיות תא בשיטה זו היא כ -90 - 95%. PBMCs מוכנה לשימוש בניסויים עכשיו.

קביעת מוות 4. Cell

הערה: דילולים הרשומים כאן הם לצורך סטה זהdy. ניתן לשנות דילולים בהתאם.

  1. לדלל WS-CM או ניקוטין בצלחת 96-היטב באמצעות מדיום שלם RPMI להיקף כולל של 100 μl / טוב, כמפורט להלן.
  2. לדלל WS-CM לריכוזים הבאים: 0.1, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, ו -5 מיקרוגרם / מ"ל של יחידות שוה-ניקוטין (המבוסס על תוכן הניקוטין בWS-CM) 12.
  3. לדלל ניקוטין במדיום RPMI לריכוזים הבאים: 100, 200, 500, 750, 1000, 2000, 3000 ומיקרוגרם / מיליליטר. זהירות: הניקוטין הוא בחריפות רעילה ומסוכן לסביבה.
  4. הוספה של PBMCs התלויה במדיום להשלים RPMI לכל 100 μl גם בריכוז של 1 x 10 6 תאים / טוב. הנפח הכולל של תאים בתוספת WS-CM או ניקוטין יהיה 200 μl / טוב.
  5. לצורך מחקר זה, להכין שני סטים של צלחות כאמור לעיל. מכסה את צלחות דגירה צלחת אחת למשך 24 שעות וצלחת אחת לשעה 3 ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. התאם נקודות זמן בהתאם לצורך.
  6. לשטוף את התאים ב RT על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 3 דקות, aspirating supernatant, vortexing תחתית הצלחת עם צלחת מכוסות ולבסוף resuspending תאים עם 200 μl של חיץ פועל קר כקרח, ולחזור על שלב השטיפה עוד פעם אחת.
  7. להוסיף 95 μl של הפעלת מאגר ואחרי 5 μl של D-7 aminoactinomycin (7AAD) זה טוב להיקף כולל של 100 μl / טוב. דגירה את הצלחת בחושך בRT במשך 15 דקות.
  8. הוספה של הפעלת מאגר לצינורות אשכול 100 μl. להעביר את כל הנפח של השעיה תא מכל טוב של הצלחת לצינורות האשכול ולרכוש את הדגימות על cytometer זרימה.
  9. לקבוע את אחוז תאי 7AAD החיובי באמצעות זרימת cytometry תוכנת ניתוח.

5. קביעת EC 50

  1. EC 50 הערכים של WS-CM וניקוטין נקבעים על ידי צביעת 7AAD החיובי של PBMCs.
  2. ערך EC 50 מוגדר כקונצרט כלשהוentration בי 50% מהתאים כבר לא היו בר-קיימא בassay 24 שעות, והערכים באים לידי ביטוי כמיקרוגרם של יחידות / מיליליטר שוה-ניקוטין.
  3. לצורך המחקר הנוכחי, EC 50 הערכים נקבעו כ1.56 מיקרוגרם / מיליליטר ו1,650 מיקרוגרם / מיליליטר לWS-CM וניקוטין, בהתאמה.

6. ציטוקינים המופרשים

הערה: דילולים הרשומים כאן הם לצורך מחקר זה. יכולים להיות מותאמים דילולים בהתאם.

  1. לדלל WS-CM בצלחת 96-היטב באמצעות RPMI בינוני מלאה להיקף כולל של 100 μl / גם בריכוז של 0.3, 1.56, 3, ו -5 מיקרוגרם / מיליליטר של יחידות שוה-ניקוטין.
  2. לדלל ניקוטין לריכוזים הבאים: 100, 200, 500, 750, 1000, 2000, 3000 ומיקרוגרם / מ"ל. זהירות: הניקוטין הוא בחריפות רעילה ומסוכן לסביבה.
  3. הוספה של PBMCs התלויה במדיום להשלים RPMI לכל 100 μl גם בריכוז של 1 x 10 6 תאים / טוב.הנפח הכולל של תאים בתוספת WS-CM או ניקוטין יהיה 200 μl / טוב.
  4. מכסה את הצלחת והדגירה של 3 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  5. לשטוף את התאים ב RT על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 3 דקות, aspirating supernatant, vortexing תחתית הצלחת עם צלחת מכוסות ולבסוף השעיית תאים עם 200 μl של קרח קר חיץ ריצה וחוזר על שלב הכביסה עוד פעם אחת.
  6. הוסף 200 μl של מדיום שלם RPMI, ולחזור על שלב השטיפה עוד פעם אחת.
  7. הוסף 200 μl של 10 מיקרוגרם / בינוני LPS מיליליטר היטב כל אחד.
  8. מכסה את הצלחת והדגירה של 4 שעות, 24 שעות, 48 שעות, או 72 שעות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. התאם פעמים דגירה כנדרש.
  9. צנטריפוגה את הצלחת ב 300 × גרם במשך 3 דקות.
  10. קח 175 μl של supernatant מכל טוב וחנות במקפיא ב -80 ° C כדי לבצע את מבחני בשלבי 7 ו -8.

Assay מערך 7. Cytometric ביד

  1. להפשיר את supernatants התא שהוכן מהצעד 6.10 ושימוש בassay CBA. בצע את assay מערך חרוז cytometric (CBA) לפי הוראות היצרן.

8. IL-8 ELISA

  1. להפשיר את supernatants התא מצעד 6.10 ושימוש בELISA IL-8. בצע את assay ELISA לפי הוראות היצרן.

9. תאיים מכתים וcytometry הזרימה

הערה: דילולים הרשומים כאן הם לצורך מחקר זה. יכולים להיות מותאמים דילולים בהתאם.

  1. לדלל WS-CM בצלחת 96-היטב באמצעות RPMI בינוני מלאה להיקף כולל של 100 μl / גם בריכוז של 0.3, 1.56, 3, ו -5 מיקרוגרם / מיליליטר של יחידות שוה-ניקוטין.
  2. באותה הצלחת, לדלל ניקוטין לריכוזים הבאים: 2, 10, 50, 100, 500, 2000, 4000 ומיקרוגרם / מיליליטר. זהירות: הניקוטין היא בחריפות רעילה וhazar הסביבהdous.
  3. הוספה של PBMCs התלויה במדיום להשלים RPMI 100 μl בריכוז של 1 × 10 6 תאים / טוב. הנפח הכולל של תאים בתוספת WS-CM או ניקוטין יהיה 200 μl / טוב.
  4. מכסה את הצלחת והדגירה של 3 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  5. לשטוף את התאים ב RT על ידי צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 3 דקות, aspirating supernatant, vortexing תחתית הצלחת עם צלחת מכוסות ולבסוף resuspending תאים עם 200 μl של חיץ פועל קר כקרח, ולחזור על שלב השטיפה עוד פעם אחת.
  6. הוסף 200 μl של מדיום שלם RPMI לצלחת, וחזור על השלב לשטוף עוד פעם אחת.
  7. הכן את ריכוזי עבודה של 2 μl / מיליליטר GolgiPlug ו -10 מיקרוגרם / מיליליטר LPS באמצעות מדיום שלם RPMI ולהוסיף 200 μl היטב כל אחד.
  8. דגירה את הצלחת למשך 6 שעות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  9. בסופו של שלב 9.8, לשטוף את התאים עם חיץ ריצה (4 מעלות צלזיוס) ומסתובב ב 300XG במשך 3 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
  10. הוספה של Cytofix 100 μl לכל היטב דגירה במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
  11. שוטף את התאים 3 פעמים כמתואר בשלב 9.9 עם 1x Permwash (4 ° C) ב XG 300 דקות 3 על 4 מעלות צלזיוס.
  12. להוסיף 45 μL של 1x Cytoperm לכל ואחרי היטב על ידי 5 μl של כל אחד מהנוגדנים הבאים היטב כל אחד: TNF-α-Alexa פלואוריד 488, IFN-γ V500, PE MIP-1α. דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  13. שוטף את התאים פעמיים כמתואר בשלב 9.9 עם 1x Permwash (4 ° C) ופעם אחת עם הפעלת מאגר (4 ° C) ב XG 300 דקות 3 על 4 מעלות צלזיוס.
  14. Resuspend התאים עם 200 μl של paraformaldehyde 2% (4 מעלות צלזיוס). להעביר את התאים לתוך 12 × 75 מ"מ צינורות, ולנתח דגימות על cytometer זרימה. זהירות: Paraformaldehyde הוא מאכל, בחריפות רעילה וסכנה בריאותית.

Assay הריגת 10. K562

צריכים להיות מבוגרים תאי K562: הערהבתרבות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עם מדיום להשלים RPMI עד שהם מגיעים 80% מפגש לפני assay.

  1. הכן 5 מ"מ carboxyfluorescein פתרון succinimidyl אסתר מניות (CFSE) על ידי הוספת 18 μl של DMSO לבקבוקון.
  2. לדלל WS-CM או ניקוטין בצלחת 96-היטב באמצעות מדיום שלם RPMI להיקף כולל של 100 μl / טוב כדי להשיג את היחידות הרצויות שוה-ניקוטין או ריכוזי ניקוטין לכל אחד. זהירות: הניקוטין הוא בחריפות רעילה ומסוכן לסביבה.
  3. הוספה של PBMCs 100 μl לתוך מדיום שלם RPMI בריכוז של 1.5 x 10 6 תאים / טובה. הנפח הכולל של תאים עם WS-CM או ניקוטין יהיה 200 μl / טוב.
  4. מכסה את הצלחת והדגירה של 3 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  5. שוטף את תאי K562 על ידי הוספת 10 מיליליטר של DPBS ו צנטריפוגות ב 400 XG במשך 8 דקות ב RT.
  6. Resuspend התאים עם 10 מיליליטר של DPBS ולספור את תאי K562.
  7. הכן worki CFSEng פתרון על ידי הוספת 1 μl של פתרון מניות CFSE עד 1 DPBS מיליליטר.
  8. הוסף 1 מיליליטר של הפתרון עובד CFSE עד 1 מיליליטר של ההשעיה תא K562 המכילה 1 - 2 x 10 7 תאים. מערבולת דגירה בדיוק 2 דקות בRT.
  9. מייד להוסיף 200 μl של FBS. מערבולת דגירה בדיוק 2 דקות בRT.
  10. הוסף 10 מיליליטר של מדיום שלם RPMI וצנטריפוגות הצינור ב 400 XG במשך 8 דקות ב RT.
  11. הסר את supernatant RPMI ולשבור את גלולה וresuspend התאים עם 10 מיליליטר של מדיום שלם RPMI ולספור את תאי K562 שכותרת CFSE.
  12. שטוף את PBMCs ידי צנטריפוגה את הצלחת ב XG 300 דקות 3 ב RT. לשאוב supernatant באמצעות אחסון הנוזלים. החזר את המכסה ומערבולת תחתית הצלחת. הוסף 200 μl של מדיום שלם RPMI וחזור על שלב שטיפה עוד פעם אחת.
  13. להוסיף תאי K562 שכותרת CFSE ביחס של 01:15 (100,000 K562s: 1.5 x 10 6 PBMCs) זה טוב מדגם של צלחת PBMC ואני נוסףncubate במשך 5 שעות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  14. לשטוף את תערובת התא על ידי צנטריפוגה XG ב 300 דקות 3 ב RT. לשאוב supernatant על ידי השלכת הנוזלים. הנח את הכיסוי ומערבולת תחתית הצלחת.
  15. הוסף 200 μl של הפעלת מאגר ולחזור על שלב הכביסה מתואר בשלב 10.14 עוד פעם אחת.
  16. להוסיף 95 μl של חיץ ריצה ואחרי 5 μl של 7AAD היטב כל אחד להיקף כולל של 100 μl / טוב. דגירה את הצלחת בחושך בRT במשך 15 דקות.
  17. הוספת 100 μl של הפעלת מאגר לכל טוב ולהעביר את כל הנפח של השעיה תא מכל טוב של הצלחת לצינורות האשכול ולרכוש את הדגימות על cytometer זרימה.
  18. לקבוע את אחוז תאי 7AAD החיוביים וCFSE החיוביים באמצעות זרימת cytometry תוכנת ניתוח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התוצאות הוצגו כשגיאת ± סטנדרטית הממוצעת של הממוצע (ארבע דגימות תורם). מבחן t של הסטודנט בין דגימות בקרה שטופלו ולא טופלו בוצע באמצעות תוכנת Excel וכן השוואות מבחן t לכל הטיפולים עם הפקדים המתאימים שלהם. המובהקות הסטטיסטיות שצוינו על ידי: *, P <0.05; **, P <0.005; ***, P <0.0005.

כדי למדוד את ההשפעה של חשיפה לWS-CM וניקוטין, טופלו PBMCs עם ריכוזים שונים של WS-CM וניקוטין למשך 3 שעות או 24 שעות. מוות של תא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו ואחרים הוכיחו בעבר כי הטיפול בPBMCs עם עקר מדכא כמה תגובות, כוללים ביטוי והפרשה של ציטוקינים ופעולות פונקציונליות כגון תא המטרה להרוג 14. השיטות הניסיוניות שתוארו בעבודה הקודמת דורשות תקופות דגירה ארוכות יותר והיו צנועים בגודל 14. בהתחשב ביישומים הפוטנציאליים של מודל אטרקטיבי זה vivo לשעבר למחקר בסיסי והיישומים, אנחנו בדקנו אם כל אחד מפרמטרי assay במבחנים ביולוגיים אלה רבי שלבים יכול להיות מותאם. כאן, אנו מציגים פשוטים שיטות למדידת תגובות חיסוני ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין ניגודי אינטרסים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו ממומנת על ידי RJ Reynolds חברת הטבק (RJRT) במסגרת הסכם לשיתוף פעולה מחקרית עם בית הספר לאוניברסיטת Wake Forest לרפואה. GL פראסאד הוא עובד במשרה מלאה של RJRT.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
12 x 75 מ"מ צינורותBD Falcon352058
15 מ"ל צינורות חרוטייםקורנינג430790
2 מ"ל מיקרו-צינורותAxygenMCT-150-C-S
3R4F סיגריות ייחוסאוניברסיטת קנטקי, המכללה לחקלאות3R4F
50 מ"ל צינורות חרוטייםקורנינג430828
500 מ"לקורנינג430282
7AADBD Pharmingen559925
צלחת תחתונה שטוחה 96 בארותTermo Nunc439454
צלחות תחתונות עגולות 96 בארותBD Falcon353077
קולט אדים תרבית תאיםThermo Scientific1300 סדרה A2
צנטריפוגהEppendorf58110R
CFSEבדיקות מולקולריות Life TechnologiesC34554
צינורות אשכולקורנינג4401מזיק בבליעה,
ציטופיקס / ציטופרם (Permwash)BD Biosciences555028דליק
(דימתיל סולפוקסיד)סיגמא-אולדריץ'D8418
DPBSLonza17-512F
FBSסיגמא-אולדריץ'F2442
FCAP ArrayBD Biosciences652099Software מנתחת נתוני CBA
יחידת סינוןNalgene156-4020
Flow cytometerBD BiosciencesFACS Canto II8 צבעים, ב-Ex 405 ו-Em 785.
ציטומטר זרימהBD BiosciencesFACS Calibur4 צבעים ב-Ex 495 ו-Em 785.
תוכנת ניתוח ציטומטריית זרימההקפאה Tree StarFlowJo
Nalgene5100-0001מכיל DMSO,
GogliPlugBD Biosciences555029מסרטן, מגרה, קורוזיבי
H2SO4Sigma-Aldrich339741
ערכתציטוקינים דלקתיים אנושייםBD Biosciences551811
IFN-γ V-500 נוגדןBD Horizon561980רגיש לעור
IL-8 ELISA KitR and D SystemsDY208
מאגר בידודIsolymph, CTL Scientific Corp.1114868נוזל דליק,
אלכוהול איזופרופילסיגמא-אולדריץ'W292907
L-גלוטמיןGibco Life Technologies25030-081
LPSסיגמא-אולדריץ'L2630
MIP1-ואלפא; נוגדן PEBD Pharmingen554730רעילות חריפה, דרך הפה
MonensinSigma-AldrichM5273
NaClSigma-AldrichS7653
ניקוטיןSigma-AldrichN3876רעילות חריפה, סכנה סביבתית
ParafilmBemis" מ"
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148דליק, גירוי בעור
עט/סטרפטוקוקוסGibco Life Technologies15140-122
RPMI 1640Gibco Life Technologies11875-093
מאגר ריצהMACS Running Buffer, Miltenyi Biotech130-091-221
Th1/Th2 CBA KitBD Biosciences551809
TNF ואלפא; Alexa Fluor 488 נוגדןBioLegend502915
העברת פיפטהפישר סיינטיפיק13-711-20
Tris BaseSigma-AldrichT1503
DMSO מיכל מגרה מגרה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. How Tobacco Smoke Causes Disease: The Biology and Behavioral Basis for Smoking-Attributable Disease, A Report of the Surgeon General. , U.S. Department of Health and Human Services. (2010).
  2. Zeller, M., Hatsukami, D. The Strategic Dialogue on Tobacco Harm Reduction: a vision and blueprint for action in the US. Tob. Control. 18, 324-332 (2009).
  3. Sopori, M. Effects of cigarette smoke on the immune system. Nature Reviews Immunology. 2, 372-377 (2002).
  4. Birrell, M. A., Wong, S., Catley, M. C., Belvisi, M. G. Impact of tobacco-smoke on key signaling pathways in the innate immune response in lung macrophages. J. Cell Physiol. 214, 27-37 (2008).
  5. Laan, M., Bozinovski, S., Anderson, G. P. Cigarette smoke inhibits lipopolysaccharide-induced production of inflammatory cytokines by suppressing the activation of activator protein-1 in bronchial epithelial cells. J. Immunol. 173, 4164-4170 (2004).
  6. Moodie, F. M., et al. Oxidative stress and cigarette smoke alter chromatin remodeling but differentially regulate NF-kappaB activation and proinflammatory cytokine release in alveolar epithelial cells. Faseb J. 18, 1897-1899 (2004).
  7. Oltmanns, U., Chung, K. F., Walters, M., John, M., Mitchell, J. A. Cigarette smoke induces IL-8, but inhibits eotaxin and RANTES release from airway smooth muscle. Respir. Res. 6, 74(2005).
  8. Vayssier, M., Favatier, F., Pinot, F., Bachelet, M., Polla, B. S. Tobacco smoke induces coordinate activation of HSF and inhibition of NFkappaB in human monocytes: effects on TNFalpha release. Biochem. Biophys. Res. Commun. 252, 249-256 (1998).
  9. Witherden, I. R., Vanden Bon, E. J., Goldstraw, P., Ratcliffe, C., Pastorino, U., Tetley, T. D. Primary human alveolar type II epithelial cell chemokine release: effects of cigarette smoke and neutrophil elastase. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 30, 500-509 (2004).
  10. Hatsukami, D. K., Biener, L., Leischow, S. J., Zeller, M. R. Tobacco and nicotine product testing. Nicotine Tob. Res. 14, 7-17 (2012).
  11. Ashley, D. L., Backinger, C. L., van Bemmel, D. M., Neveleff, D. J. Tobacco Regulatory Science: Research to Inform Regulatory Action at the Food and Drug Administration's Center for Tobacco Products. Nicotine Tob. Res. , (2014).
  12. Arimilli, S., Damratoski, B. E., Bombick, B., Borgerding, M. F., Prasad, G. L. Evaluation of cytotoxicity of different tobacco product preparations. Regul. Toxicol. Pharmacol. 64, 350-360 (2012).
  13. Gao, H., Prasad, G. L., Zacharias, W. Differential cell-specific cytotoxic responses of oral cavity cells to tobacco preparations. Toxicol In Vitro. , (2012).
  14. Arimilli, S., Damratoski, B. E., Prasad, G. L. Combustible and non-combustible tobacco product preparations differentially regulate human peripheral blood mononuclear cell functions. Toxicol. In Vitro. 27, 1992-2004 (2013).
  15. Arimilli, S., Damratoski, B. E., Chen, P., Jones, B. A., Prasad, G. L. Rapid isolation of leukocyte subsets from fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells in clinical research. Cryo Letters. 33, 376-384 (2012).
  16. Schmid, I., Krall, W. J., Uittenbogaart, C. H., Braun, J., Giorgi, J. V. Dead cell discrimination with 7-amino-actinomycin D in combination with dual color immunofluorescence in single laser flow cytometry. Cytometry. 13, 204-208 (1992).
  17. Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. J. Immunol. Methods. 325, 51-66 (2007).
  18. Taga, K., Yamauchi, A., Kabashima, K., Bloom, E. T., Muller, J., Tosato, G. Target-induced death by apoptosis in human lymphokine-activated natural killer cells. Blood. 87, 2411-2418 (1996).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

K562CFSELPS

מאמרים קשורים