הכנת תאים חסידים הדמיה הקרינה רנטגן על ידי קיבוע כימי

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כיצד לקבוע את הכמות וההתפלגות של מתכות בדגימה באמצעות פלואורסצנציה של קרני רנטגן סינכרוטרון. אנו מתמקדים בתאים נצמדים, ומתארים את שיטת הקיבוע הכימי להכנת דגימה זו. לאחר מכן אנו מתארים כיצד להרכיב ולדמות את הדגימה באמצעות צילומי רנטגן סינכרוטרונים.

תקציר

הדמיית פלואורסצנציה של קרני רנטגן מאפשרת לנו למדוד באופן לא הרסני את ההתפלגות המרחבית והריכוז של מספר יסודות בו זמנית על פני שטחי דגימה גדולים או קטנים. הוא יושם בתחומים רבים של המדע, כולל מדעי החומרים, מדעי הגיאוגרפיה, חקר יצירות של מורשת תרבותית וביולוגיה כימית. במקרה של ביולוגיה כימית, למשל, הדמיית התפלגות המתכות בתוך התאים מאפשרת לנו לחקור הן יוני מתכת טבעיים בתאים, והן מתכות שהוכנסו באופן אקסוגני כגון תרופות וננו-חלקיקים. בשל האופי המיובש במלואו של כמעט כל הדגימות הביולוגיות, קיבוע קריו ואחריו הדמיה בטמפרטורה קריוגנית מייצגים את שיטת ההדמיה האידיאלית הקיימת כיום. עם זאת, בנסיבות ששילוב כזה אינו נגיש או מעשי בקלות, קיבוע כימי מבוסס אלדהיד נותר שימושי ולעיתים בלתי נמנע. מאמר זה מתאר בפירוט רב ככל האפשר בהכנת תאי יונקים דבקים על ידי קיבוע כימי להדמיה פלואורסצנטית בקרני רנטגן.

מבוא

X-ray הדמיה הקרינה מאפשרת לשניהם זהות והכמות של אלמנטים קיימים במדגם להיפתר במרחב. תקרית צילומים רנטגן, של אנרגיה נבחרה להיות גדול יותר מהאלקטרון מחייב אנרגיה של היסוד הכבד ביותר של עניין, להתגבר על אנרגית הקשר של אלקטרונים פנימי קליפה לגרעין ^1. זה יוצר "חור" בקליפת האלקטרונים. כאלקטרונים גבוהות אנרגיה ליפול לתוך חורים אלה, צילומי רנטגן ניאון נפלטים אורך הגל שהוא תלוי בהפרדת האנרגיה של אורביטלים אלה. מאז את מרווח האנרגיה של אורביטלים אופייני לאלמנט מסוים, פליטת הקרינה X-ray יש גם אורכי גל אופייניים, תלוי באלמנט. זה פליטה זה באורך גל אופייני המאפשר זיהוי של האלמנטים הנוכחיים. כיול של עוצמת הקרינה מאפשר לכמת את האלמנטים הנוכחיים.

microscop הקרינה רנטגןy (XFM) הפך יותר ויותר מנוצל, בין ההיתר בשל פיתוח מקורות מאוד מבריקים X-ray סינכרוטרון, כגון אלה באביב-8 ביפן, המתקן האירופי הקרינה Synchrotron (ESRF) בצרפת, והפוטון המתקדם המקור ( APS) בארה"ב ^2. מקורות אלה מספקים קורות X-ray גבוהה מאוד בעוצמה. באותו הזמן, שיפורים באופטיקה רנטגן, כגון טכנולוגית צלחת האזור, אפשרו התמקדות של קורות אלה לכתמים תת-מיקרון, אם כי לא באופן בלתי יעיל ^3. עם מאוד קורות בעוצמה גבוהה, גם כמות קטנה יחסית של אור שיכול להיות ממוקדת מספיק כדי להלהיב את מתכות אנדוגני בתאים, אות ייצור שניתן למדוד עם טכנולוגית גלאי זמינה כרגע. כך, מחקר על הביולוגיה הכימית של מתכות בתא הוא יישום אחד בפרט שעושה שימוש ברבים מההתפתחויות האחרונות בטכניקה זו ^4-10.

ישנם גורמים קריטיים רבים כדי להיחשב בעת יישוםשוכב XFM לחקור את ההפצה וכימות הבסיסיות של תאי יונקים בתרבית או דגימות ביולוגיות אחרות. ראשית, המדגם צריך להיות כל הזמן בשלמות, גם מבני והן ביחס לרכב היסודות שלה, על מנת שהמדידה יהיה משמעותי. שנית, המדגם חייב גם יישמר בדרך כלשהי, כך שהוא קשוח לניזקי הקרינה שיכול להיגרם על ידי קרן רנטגן ממוקדת. אחת דרכים שמדגם יכול לפגוש שני הקריטריונים הללו בבת אחת הוא להיות מוקפאים במהירות לתוך קרח זגוגי, אמורפי ^11,12. הקפאה מהירה מושגת לעתים קרובות באמצעות טכניקות שונות, כגון הקפאת הקפאה לצלול או בלחץ גבוה הקפאת ^13-16. הדעה מקובלת היא שההקפאה שומרת ארכיטקטורה הסלולר כוללת והרכבים כימיים בדגימות ביולוגיות קרובות למצב טבעי ככל האפשר. קיבעון כימי, ומצד שני, בשל החדירה האיטית וסלקטיבית של fixatives לתאים ורקמות כמו well שינויים לאחר כבחדירות קרום, עשויים לאפשר יונים סלולריים שונים במיוחד יוני diffusible כגון Cl, Ca ו- K להיות דלפו, שאבדו או הועברו, וכך הופכים חקירה של האלמנטים האלה לא טובים ^17-19. למרות היתרון ברור של cryo-קיבעון על קיבעון כימי באופן כללי, לתאי יונקים חסיד בפרט, יש הקפאת מגבלות שונות ^20-23. הברור ביותר הוא שלא לכל מעבדת מחקר גישה קלה למכשירי הקפאה. רוב המקפיאים לחץ גבוה הנוכחיים או אפילו לצלול מקפיאים הם יקרים ובעלות רק על ידי קבוצת משנה של מתקני cryo, אשר עשויים להיות רחוק מהמקום שבי תאים מודגרת. היתרון של הקפאה עשוי להיסחר בחסרון של מתח נסיעות מונח על התאים. וכך, בעוד ההקפאה היא ללא ספק הדרך המחמיר ביותר לשמירת דגימות לבדיקת הקרינה רנטגן, זה בהחלט לא נגיש ביותר לכל החוקרים בכל הנסיבות;זה גם לא תמיד חיוני - אם המתכות של ריבית הדוקה למקרו-מולקולות הניתנים לקביעה, ואת הרזולוציה שבי המדגם יהיה צילמה גדולה מהניזק לאולטרה-המייקר שעלול להתרחש במהלך ייבוש. מודע לאזהרות ^24, קיבעון כימי וייבוש עשוי להיות בחירה מתאימה.

גורמים אחרים בניסוי הדמיה הקרינה רנטגן מוצלח כוללים ניתוח נכון. ההדמיה הקרינה רנטגן היא ביסוד ספקטרוסקופיה פליטת הקרינה רנטגן בשילוב עם סריקה סריקה כדי לספק רזולוציה מרחבית. ספקטרום פליטת הקרינה X-ray שנאסף מכיל שילוב של חופף פסגות פליטה, רקע, ואת פסגות פיזור אלסטי והקשיחות של קורה האירוע. תוכנה המאפשרת דה-פיתול של תרומות אלה, וראויים של פסגות הפליטה, הייתה התפתחות קריטית לתחום זה ^25. כמו כן, הפיתוח וdist המסחריribution של תקני סרט דק של הרכב ידוע, המשמש לכיול עוצמת הקרינה יחסית לכמות חומר, גם היה מאוד חשוב.

פרוטוקול זה מספק תיאור של הכנת תאים חסיד ידי קיבוע כימי וייבוש באוויר. צעד חיוני בתהליך זה הוא הצמיחה של התאים על חלונות סיליקון ניטריד, אשר לעתים קרובות אינו דבקים גם, מה שהופך את השטיפה עדינה במפתח אופנה מסוים להצלחה.

פרוטוקול

1. הכנה של מכשירים, מצעים, תרבות מדיה וכלים

1. טיפול של הסיליקון Nitride (Si ₃ N ₄₎ חלונות.
   1. לפתוח את הכמוסה מעט על ידי סחיטת קצה אחד המכיל את החלון באופן שלא לסחוט את החלון עצמו כזה, תוך סיבוב בקצה השני של הכמוסה ביד השנייה.
   2. בדוק זוג הפוך, פינצטה קנס שקצה תחת סטראו לוודא שאין דבק, פערים או עיקולים בקצה. אחרת, החלונות עשויים להיות שבורים על ידי פינצטה או לעוף משלהם במהלך השלבים הבאים.
   3. הסר את החלון מהכמוסה ידי אחיזה במסגרת של החלון עם פינצטה בזהירות, תוך כדי לחיצות הכמוסה בעדינות לקראת הסוף הפתוח הפעלת לחץ בכיוון כדי להפוך את הכמוסה רחבה יותר שבו הקצוות של החלון צריכים לצאת.
2. חלון מראש לשטוף (לא חובה).
   1. אם תרצה, חלונות קדם שטיפה בעדינות על ידי טבילתםבמים מזוקקים למשך 5 שניות, ואחריו 2 דקות לשטוף באתנול 70% ולשטוף 2 דקות ב 100% אתנול.
3. פרזול וחיטוי חלונות בצלחת התרבות.
   1. להדביק את החלונות, להגדיר את החלון עם צד שטוח עד בתחתית צלחת התרבות, מקום חתיכת הסרט בשקופית זכוכית נקייה. חותך על רצועת סנטימטר במורד הצד השני של הקלטת הארוכה. קח פרוסת הקלטת מהצד הקצר (ב⅛ "על ידי ¾") בסכין גילוח נקי.
   2. להשתמש בפינצטה כדי להחיל את פרוסת הקלטת לקצה של הרשת או חלון. השתמש מספיק כדי לדבוק אותו היטב ללא כיסוי פתיחת החלון עצמו. מניפולציה של הקלטת דבקה עם פינצטה, להגדיר את החלון למטה, אל החלק התחתון של המנה התרבות. השתמש בקצה פינצטה לדבוק קלטת לתחתית צלחת התרבות בתקיפות.
   3. החל רצועת קלטת נוספת לקצה האחר ולדבוק זה לתחתית בתקיפות בחוד של פינצטה.
   4. ברגע שכל החלונותמוקלט, לעקר חלונות בתרבות מנות עם אולטרה סגול (UV). להשיג זאת על ידי הצבת הצלחת תחת מנורת UV בזרימה למינרית במשך כ -1 שעה.
   5. (אופציונאלי) אם חלונות הם להיות מראש מצופים עם פולי-ליזין, עושה זאת לאחר חלון עיקור. מעיל החלון עם 10 μl של 0.01% תמיסה סטרילית poly-L- ליזין עבור שעה 1 באינקובטור 37 ° C, ולאחר מכן לשטוף את הפתרון שנותר עם התקשורת והתרבות.
4. הכן מאגרים לשטיפה סופית לפני XFM.
   1. הכן או טריס-גלוקוז או N piperazine-, '-bis N (חומצת ethanesulfonic) (צינורות) -sucrose חיץ חופשי מכל עקבות מתכות עם osmolality ושווה ערך ה- pH מלוח חיץ פוספט של Dulbecco (D-PBS) ללא סידן ומגנזיום. השתמש באחד מהמאגרים אלה כדי לשטוף תאים לאחר תאים קבועים כימי.
      1. כדי להפוך את פתרון טריס-גלוקוז (10 מ"מ טריס, 260 מ"מ גלוקוז, חומצה אצטית 9 מ"מ,) להוסיף 1.4 גרם של גלוקוז, 36 מ"ג של בסיס טריס ו16 μl של חומצה אצטית 20 מיליליטר של מים ultrapure. לאחר מכן, להתאים את הנפח סופי 30 מיליליטר עם מים ultrapure. אין צורך בהתאמת pH. אחסן בRT עד שבוע.
      2. כדי להפוך את הצינורות-סוכרוז (20 צינורות מ"מ, 200 מ"מ סוכרוז) להוסיף 0.18 גרם של צינורות וגרמו 2.0 של סוכרוז 20 מיליליטר של מים ultrapure ולהתאים את ה- pH ל 7.4 עם כמויות קטנות של חומצה אצטית מרוכזת. לאחר מכן, להתאים את הנפח סופי 30 מיליליטר עם מים ultrapure. אחסן בRT עד שבוע.
         הערה: הסיבה להימנע משימוש PBS בשטיפה הסופית היא שהריכוזים של פוספט, כלוריד ואשלגן בPBS כל כך גבוהים שזה יכול להפריע לXFM אם הוא לא הוסר לחלוטין לפני ייבוש באוויר.
5. הכן מאגרים לציפוי תא.
   1. הכן או להוציא את כל אמצעי התקשורת, כגון בינוני RPMI 1640, 1x פתרון טריפסין-EDTA, D-PBS, וכל חומרים כימיים אחרים לפי צורך לשורת התאים חסיד מסוימת כבדרך כלל להיעשות לpassaging התאים חסיד oעניין f, ולחמם אותם עד 37 מעלות צלזיוס.

2. ציפוי של תאים

1. למנת התרבות המעוקרות המכילה את החלונות, בזרימה למינרית, בעדינות להוסיף מדיה (10 מיליליטר למנת תרבות 100 מ"מ), בצד של צלחת התרבות עם זה נטוי בזווית. הימנע מיצירת מתח פנים מיותרים או להפיל תקשורת ישירות על גבי משטח של חלונות סיליקון ניטריד. כאמצעי תקשורת נוספת, להקל לאט זווית ההטיה למעייל הרשת וחלון עם תקשורת.
2. הכן את שורת התאים חסיד של עניין כראוי, trypsinizing או מגרד את תאי הנחה של הצלחות כרגיל לpassaging שורת התאים. לבצע כל ספירת תאים, או תכשיר אחר נחוצה לפני יישום התאים לצלחת הטרי.
3. הוספת תאים לצלחת התרבות עם חלונות בצפיפות תאים מה שצריך כדי להגיע בדרך כלל 50% -70% בתוך מפגש 24-72 שעות, ולדגור על 37 מעלות צלזיוס חממת humidified עם 5% פחמן דו חמצני.
4. שים לב הצמיחה של התאים מעת לעת, באמצעות מיקרוסקופ אור הפוכה, עד שצפיפות התא הרצויה (בדרך כלל 70% מפגש 50%) הוא הגיע.

3. קיבוע של תאים

1. הכן paraformaldehyde 4% טריים בD-PBS על ידי דילול מניות שנרכשו (paraformaldehyde כגון 25%) והתאמת ה- pH 7.4 עם חומצה אצטית (להימנע מהוספת עודף נתרן לדוגמא).
2. כאשר תאים כבר גדלו כרצוי, וכל כתמים חיוניים (כגון Hoescht) יושמו וצלמו, להסיר את המדיה על ידי שאיפה עדינה, הטיה הצלחת בזווית של 45 מעלות ביד אחת, וaspirating ביד עם פיפטה האחרות .
   הערה: במקום תקשורת pipetting בילה, אלטרנטיבה היא לבחור את החלון עד, לטבול את החלון לתוך צינורות microcentrifuge עם D-PBS פעמיים ולאחר מכן למקם אותו לכלי חדש תרבות עם פתרונות מקבע עבור 20 דקות ואחריו 2 פעמים לשטוף PBS כדי להסיר את fixatives השייר. אם זה נבחר, ללכת directly לשלב 3.5.
3. יש לשטוף את הצלחת בעדינות עם D-PBS ולהחליף את הנוזל להסיר מייד על ידי הוספה בעדינות 4% PFA / PBS הטרי תוך כדי לחיצה על הצלחת בזווית של 45 מעלות, pipetting לכיוון הצד של המנה, ומרגיע לאט זווית ההטיה כדי לאפשר הפתרון מקבע כדי לכסות את החלונות. שמור את התאים מכוסים במקבע במשך 20 דקות ב RT.
4. הסר את הנוזל על ידי שאיפה עדינה, שוב כאמור לעיל, הטיה הצלחת מעט וaspirating ביד.
5. החלף את הנוזל הוסר בעדינות על ידי הוספה כמה מהצינורות / הפתרון סוכרוז, תוך שימוש בשיטת ההטיה וpipetting מתואר בשלב 3.3.
6. חזור על שלבי 3.4 ו -3.5.
7. הכן את החומרים לייבוש.
   1. לאסוף מגבות ונטולי מוך כגון Kimwipes, ולשלוף אחד של רחבה ולכן הוא שימושי מאוד במהירות ובקלות.
   2. הכן מקום נקי, ברמה שאינה להגדיר את החלון לייבוש. יצא מחצלת רשת גומי מהסוג המשמש במיקרוסקופ אלקטרונים, שבו יש כל כך רכסיםהחלון יכול להיות שעונה על קצה אחד בזמן שהוא מתייבש. זה יהיה לשמור על החלון מלהיתקע על פני השטח הייבוש כהוא מתייבש, ולנקז כל חיץ שנותר עד לקצה של המדגם.
8. למרוט בזהירות את הקלטת המצורפת לחלון כדי להחזיק את החלון עד מתוך הנוזל. אחזר חלונות שיורדים מהקלטת על ידי מריחת כמות קטנה של צינורות / סוכרוז כדי לגרום להם לצוף ולאחר מכן לאסוף אותם עם פינצטה ההפוכה.
9. בזהירות (בלי לגעת בחלון עצמו) וביסודיות למחות כל צינורות / סוכרוז עודף מקצה החלון עם Kimwipe. גם למחות אזור מסוכסך הגב באמצעות קיפול מעוגל של Kimwipe.
   הערה: המטרה היא שהתגבשות קטנה כמו של מלחים או מאגרים על פני השטח של החלון ככל האפשר.
10. הנח את החלון על מחצלת הרשת. ודא שהחלון לא שוכב על מזרן הרשת, אבל שעונה על קצה (שימוש ברכסים של מחצלת הרשת) ונגיעה קטנה כמו של הרשתמחצלת האפשר. בואו חלון היבש.

4. הרכבה לדוגמא והדמיה

1. לאחר המדגם התייבש, לאמת את הנוכחות של תאים על החלונות באמצעות מיקרוסקופ אור. לבצע אימות זה, לפני הכנת הדגימות לתחבורה לסינכרוטרון.
2. חבילה של Windows לתחבורה לbeamline סינכרוטרון אירוח הניסוי שלך. בעדינות להדביק את החלונות עם סרט על שני צדדים לשקופיות זכוכית, ולאחר מכן להדביק את שקף הזכוכית עם קלטת לתחתית צלחת פטרי פלסטיק. קלטת עצומה צלחת פטרי.
   הערה: לפני שלב זה, ניתן לבצע את הפעולות הבאות בכל מעבדה טיפוסית. השלבים הבאים יהיו הטוב ביותר להיעשות בbeamline סינכרוטרון.
3. הסר את הסרט מהחלון בעדינות עם פינצטה. למרוח לק על ציפורניים, באפילו ציפוי דק לאורך הקצה של החלון, כדי לאבטח את החלונות לבעל אלומיניום הניתן על ידי משתפי הפעולה beamline בסינכרוטרון.
4. הכנס את בעל אלומיניום לkinematic הר, ולאחר מכן למקם אותו למקומו במיקרוסקופ X-ray. הר המדגם על תושבת חיבורו לשלבים ממונעים, בתוך חדר המדגם בbeamline.
5. לאחר היציאה ממדגם אזור X-ray מכשיר מיקרוסקופ (לול עשוי מקירות מלא עופרת), התקנת הסריקה. שימוש בתוכנת beamline ספציפי, בחר את האזור המתאים של המדגם לסרוק, בעת הצגת עמדתה של קרן רנטגן על המדגם באמצעות מצלמה מצוידת בצלב שיער-וידאו ועם מצלמה scintillator במורד הזרם מיושר מראש.
6. בחר את הרזולוציה המתאימה למדגם, המבוסס על הערכה של הגודל של התכונה הקטנה ביותר של עניין. הדמיה תאי יונקים יחידים (~ 20-40 מיקרומטר בגודל), להשתמש ברזולוציה של .25-0.5 מיקרומטר. הדמיה אזורים של רקמות, והבחנת שכבות תאים מזה, להשתמש ברזולוציה של 2-20 מיקרומטר.
7. בחר את הזמן המתאים להתעכב למדגם, המבוסס על הערכה של הכמות נפגשאל הווה עניין. לסריקת סקירה מהירה, או אם כמויות גבוהות של מתכות הן מופיע, השתמש בסריקות לטוס עם זמנים להתעכב של 30-300 msec לפיקסל. אם חומר קטן הוא הווה, או למדוד מתכות של שפע יחסי נמוך, להשתמש בסריקות צעד עם פעמים להתעכב של 1-2 שניות לכל פיקסל.
8. לתכנת את הסריקות לתוך תוכנת beamline הספציפי. לרכוש תמונת סריקה סריקה. לעבוד יחד עם משתפי הפעולה beamline כדי לנתח את הנתונים עם תוכנה שיזהו את פסגות אנרגיה האופייניות לכל רכיב.

תוצאות

היכולת של הדמיה הקרינה רנטגן על מנת לספק מידע על דגימות ביולוגיות מותנית דגימות אלה שמכינים באופן כזה שהם חזקים לנזקי קרינה בזמן בקנה המידה של הניסוי, ובכל זאת הכימית שלהם והתכונות מבניות היטב השתמר. בצפיית התוצאה ממדגם שהוכן כפי שתואר לעיל וצלם, אפשר לראות שיש שוני באלמנטים הנוכחיים - מצביע על כך שהקיבעון נשמר היבטים של התאים אלה (איור 1).

לעומת זאת, מחפש במקום במדגם שבו תהליך זה לא הלך טוב, והח...

דיון

ההדמיה הקרינה רנטגן שימושית בתחומים רבים, כולל geosciences, מדע חומרים, וביולוגיה כימית ^26-34. התקדמות בצילומי רנטגן סינכרוטרון, והפוקוס שלהם, יצרה מאוד קורות בעוצמה גבוהה. X-ray הממוקד קורות מספיק כדי לעורר את מתכות אנדוגני בתאים קיימות כיום, לייצר אות שניתן למדוד עם טכנולוגית גלאי להיסחף סיליקון זמין כרגע. ומחקר על הביולוגיה הכימית של מתכות בתא הוא יישום אחד בפרט שעושה שימוש ברבים מההתפתחויות האחרונות בתחום זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
חלונות סיליקון ניטריד	סילסון בע"מ / J B J ביזנס פארק / נורת'המפטון רואד, נורת'המפטון NN7 3DW, בריטניה	SiRN-5.0-200-2.0-200. סדר לפי גודל. גודל הממברנה: 1.5 מ"מ על 1.5 מ"מ. עובי: 200  ננומטר. גודל מסגרת: 5  מ"מ x 5 מ"מ. עובי מסגרת: 200 ומיקרו מ'.	מקור חלופי: SPI Supplies / Structure Probe, Inc. ווסט צ'סטר, פנסילבניה.
פינצטה הפוכה	מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית, ת.ד. 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, טלפון: 215-412-8400, שיחת חינם: 800-523-5874, פקס: 215-412-8450	78520-5X	EMS 5X, NC – פינצטה עדינה במיוחד
מחצלת רשת גומי	מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית, ת.ד. 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, טלפון: 215-412-8400, שיחת חינם: 800-523-5874, פקס: 215-412-8450	71170	מחצלת רשת עגולה
חומצה אצטית	סיגמא-אולדריץ', 3050 Spruce St., סנט לואיס, MO 63103, טלפון: 800-325-3010, פקס: 800-325-5052	338826	מתכות קורט חומצה אצטית מרוכזת
PIPES מאגר	Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, טלפון: 800-325-3010, פקס: 800-325-5052	P6757	מאגר PIPES מוצק
תמיסת מלאי פורמלדהיד	מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית, ת.ד. 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, טלפון: 215-412-8400, שיחת חינם: 800-523-5874, פקס: 215-412-8450	RT 17113	10 x 10 מ"ל אמפולות של 20% פרפורמלדהיד מימי