מאמר שיטה

הליך כירורגי לResecting צלעות העכבר: מודל לתיקון עצם ארוך בקנה מידה גדולה

DOI:

10.3791/52375

⸱

21 בינואר 2015

 ,  ,  ,  , 
1Eli and Edythe Broad Center for Regenerative Medicine and Stem Cell Research, Keck School of Medicine, University of Southern California

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המטרה הכוללת של הליך זה היא לכרות בהצלחה חלק מהעצם מצלע של עכבר. ההליך פותח כמודל לחקר תיקון עצמות ארוכות בקנה מידה גדול.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מציג חוקרים למודל חדש לתיקון עצם בקנה מידה גדולה ניצול צלעות העכבר. הנוהל מפרט את הפעולות הבאות: הכנת בעלי החיים לניתוח, פתיחת קיר גוף החזה, חושף את הצלעות הרצויות מהשרירים הבין- שמסביב, מוציא את החלק הרצוי צלעות ללא גרימת pneumothorax, וסוגר את החתכים. בהשוואה לעצמות השלד התוספים, הצלעות נגישות מאוד. בנוסף, לא, קיבוע פנימי או חיצוני הוא הכרחי שכן הצלעות הסמוכות מספקות קיבוע טבעי. הניתוח משתמש באופן מסחרי אספקה ​​זמינה, הוא פשוט ללמוד, ונסבל היטב על ידי בעלי החיים. ההליך יכול להתבצע עם או בלי הסרת קרום העצם שמסביב, ולכן התרומה של periosteum לתיקון ניתן להעריך. תוצאות מצביעות על כך שאם periosteum נשמר, תיקון חזק מתרחש ב1-2 חודשים. אנו מצפים כי שימוש בפרוטוקול זה לאעידוד מחקר לתיקון צלעות ושהממצאים יאפשרו פיתוח הדרכים חדשות כדי לעורר תיקון עצם במקומות אחרים בגוף.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מתיש פגיעה בשלד, דלקת מפרקים ניוונית כרוניות, והבעיות החמורות הקשורות לניתוח שחזור להשפיע על יעילות כלכלית, משפחת רווחה, ואיכות החיים. בעוד הפסקות קטנות ונגעים יכולים לרפא די טובה, בני האדם אינם מסוגלים לתקן את הפגמים גדולים, ולכן יש להסתמך על נהלי שחזור כדי לשחזר מבנה ותפקוד. שחזור עשוי להיות כרוך בשתלים אלוגנאית או heterogeneic, עצם morcellized, פיגומים מושתלים, או הארכת עצמות. למרבה הצער, הם לא רק שם גורמי תחלואת persistant כרוכים בטיפולים אלה, אך הכוח המקורי של עצם תיקון מושגת רק לעתים רחוקות. לפיכך, גישות קליניות חדשות יש צורך.

כיוון אחד לפתח שיטות חדשניות לטיפול בפגמים מגזריים הוא ללמוד מצבים שבהם תיקון בקנה מידה גדולה מתרחש באופן טבעי. דו-חיים מפורסמים יכולים להתחדש אלמנטי שלד, ואילו יונקים נחשבים מוגבלים בההוא יכולת. עם זאת, מאז תחילת המאה ה -20, כמה דיווחים על ההתחדשות בצלע האדם שפורסמו מצביעים על כך שבני האדם לא יכול להיות כל כך מוגבל 1-4. נכון לעכשיו תופעה זו ידועה בעיקר על ידי מנתחים פלסטיים המשתמשים בחומר צלעות ללסת, פנים ואוזן שיקום, אך הוא לא זוכה להערכה 5 באופן רחב יותר. כדי ללמוד תיקון זה בפירוט רב יותר, פיתחנו מודל כירורגית באמצעות העכבר. שימוש בפרוטוקול זה, חוקרים יכולים לזהות את הגורמים המולדים המעורבים ולהשתמש במידע זה כדי להקל על ריפוי שלד במקומות אחרים.

ישנם יתרונות רבים לשימוש בצלעות כמודל ללימוד תיקון שלד. ראשית, צלעות המקיפות לספק, קיבוע טבעי (בהשוואה לכריתה של עצם הירך 6,7). זה מקטין את הסיכון לתחלואה של תופסנים פנימיים וחיצוניים ומפשט את ההליך כירורגי. שנית, שכבות שרירים דקות של wa החזהיהיה לספק לגישה קלה וראות מצוינת ההופכת את assay להשוות את הנוחות של כריתות calvarial 8. שלישית, בניגוד לcalvariae המהווים על ידי התאבנות intramembranous, צורת הצלעות ידי התאבנות endochondral ולגדול באורך באמצעות הארכה בצלחות גידול נמצאים בשני קצוות של diaphysis מרכזי. לכן, תיקון של הצלעות עשוי להיות דומה יותר לתיקון של עצמות השלד התוספים הארוכות. יתר על כן, מצאנו כי בהשוואה לעצם הירך, periosteum של הצלעות עבה יותר וניתן להשפיע בקלות רבה יותר. לפיכך, חוקרים המבקשים assay תיקון עצם לצורך לימוד periosteum או בדיקת טיפולים בתאים, סוכנים תרופתיים, ו / או פיגומי רקמה עלולים למצוא את מודל כירורגים זה שימושי. לסיכום, מודל כריתת צלע זו מספק הקשר שבתוך ללמוד תיקון עצם בקנה מידה גדולה טבעית ביונקים כמו שאף כזה מודל בשימוש כללי קיים כיום.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: כל הנהלים הנן בהתאם לפרוטוקול בעלי חיים אושר על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) באוניברסיטת הדרום קליפורניה.

1. הכנה לניתוח

  1. הנח את הכלים כירורגיים ההכרחיים ומתכלות (מעוקר, פריטי 1-18 ברשימת חומרים) ולסדר מיקרוסקופ לנתח וטראנס-מאייר סיבים אופטי במנדף או על שולחן downdraft.
  2. הנח את העכבר לבגרות מינית (20 - 30 גר ', 1-3 חודשים) בחדר אינדוקציה עם isoflurane 4% כדי לגרום להרדמה.
  3. לאשר הרדמה עם כפה ו / או בדיקת קמצוץ זנב.
  4. החל משחה לעיניו של העכבר, כדי למנוע יובש בעיניים במהלך הניתוח.
  5. הזז את העכבר לבמה מיקרוסקופ. מניחים את העכבר לחרטומו של צינור התחזוקה ומקם רוחבי. לספק נרתיק התחממות סמוך לבעלי החיים כדי לעזור לשמור על טמפרטורת גוף.
    לאE:. מיקום של העכבר הוא תלוי בהעדפה ו / או שרירות לבו של המנתח אישי, צד או שמאלה או ימינה הוא בסדר.
  6. התאם isoflurane - 2, 3% לתחזוקה, ולצפות בקצב נשימה.
  7. הזרק עצירות תת עורי (אגף לרוחב של הרגל) (0.05 מ"ג / קילוגרם) על כאבים שלאחר ניתוח עם מחט 25 G. הרגל עשויה עווית שהיא תגובה נורמלית.

חתך 2. פתיחה

  1. לזהות את הצלעות הרצויות על ידי מישוש, ולנקות את השטח של שיער עם מכונת גילוח.
    הערה: צלעות 8-10 מומלצות מאז צלעות 1-7 קרובות יותר לריאות ו11-13 הם קצר באופן משמעותי. ספירת הצלעות צריכה להתחיל עם הצלעות מקורי ביותר כמספר 1.
  2. הכן את האזור עם לסירוגין povidone- יוד וisopropanol (70%) בניקוי (3x מומלץ לעתים קרובות על ידי שימוש בבעלי חיים פרוטוקולים).
  3. לחתוך חתך 2 סנטימטרים דרך העור, ישירות מעל ומקביל לצלע הרצויה עם מספריים מיקרוכירורגיה בגודל בינוניים. Incisדואר דרך שכבות שרירים ושומן הבסיסיות.
  4. מניחים את כל 3 השכבות (עור, שרירים, שומן) למפשק לחשוף את אזור הניתוח, תוך מזעור גודל החתך.

3. מוציא את הצלעות

  1. לחתוך את השרירים הבין- מעל את החלק הרצוי צלעות עם אזמל 5.0 מ"מ. מיקום חתך זה כ -5 מ"מ הפרוקסימלי למפרק chondrocostal כמו זה שבי הצלעות היא לא כמעוקלת מאוד. בזהירות להפריד את השריר מהעצם עם מלקחיים טיפ נאה.
  2. כדי ליצור כריתה תוך שמירה על קרום העצם בבעלי החיים, לחתוך את קרום העצם, לאורכו של צלע עם אזמל 5.0 מ"מ. בזהירות להפריד periosteum מעצם הבסיס רוחבי עם מלקחיים טיפ נאה. להתקדם בזהירות, כperiosteum הוא מאוד עדין ויש לו עקביות דביקה.
  3. הבא לעשות חתך דרך העצם בקצה אחד עם מיקרו מספריים בסדר. במידת הצורך, למדוד את הכריתה עםreticle במיקרוסקופ או מד סוג השליט. לאחר מכן, הרם בזהירות את העצם מתוך periosteum ולחתוך את הקצה השני.
    הערה: המשך בזהירות. זהו הצעד העדין ביותר, כמו משיכת ללא מוציא את הצלעות מתחת יקרע את קרום pleural ולגרום לחזה אוויר. אם קרום pleural נקרע זה יהיה ברור בקלות כמו הפנים של חלל בית החזה יהיו גלויים.
  4. אם דימום מתרחש כתוצאה מחיתוך העצם, להפעיל לחץ בסוף לחתוך עם מקל אוזניים ל4-5 שניות כדי לעצור את הדימום.
    הערה: בהזדמנות נדירה שהדימום ממשיך, ייתכן שתהיה צורך לעצור ולהרדימו איבוד דם משמעותי כיתפשר התאוששות (ללא החלפת נוזל, מקסימום הדם אשר ניתן בצורה בטוחה לאיבוד הנפח הוא 10% מכלל נפח הדם או 7.7 -. 8 μl / g לעכבר 25 גרם, זה שווה ערך לכ 180-200 μl 9).
  5. מייד למקם את הצלעות הוסרו ל4% PFA לניתוח בעתיד.
    הערה: אם הכריתה של שתי העצמות וperiosteum היא להתבצע, להשמיט את החתך והפרדה (שלב 3.2) periosteum. מאז periosteum מצורף מאוד הדוק לקרום pleural להתקדם בזהירות, מתגרה הצלעות מהקרום pleural עם מלקחיים כדי למנוע קריעה.

4. סגירת החתך

  1. תפר את השרירים הבין- מעל שרוול periosteal נותר עם 9-0 תפרים (2 תפרים הם בדרך כלל מספיק). הנח את התפרים ישירות מעל קצות החתך של הצלעות, לפעול כמדדים למיקום ניתוח.
  2. הסר את מפשק. תפר את השרירים ושומן שמעליה עם 9-0 תפרים (3-4 תפרים הם בדרך כלל מספיק). בעכברים עם שכבות עבות במיוחד של שריר ו / או שומן, תפר כל שכבה בנפרד (לדוגמא, שכבת 1 של תפרים לשכבה השרירית ושכבה 1 של תפרים לשכבת השומן).
  3. סגור אתעור עם תפרי 7-0 (4-5 תפרים הם בדרך כלל מספיק).
  4. אבטח את החתך עם דבק תפר, צובט את הקצוות יחד עם מלקחיים גדולים.
  5. לאט לגמול את העכבר מעל isoflurane ידי ההתאמה ראשונה ל -1% לכמה דקות ואז לכבות.
  6. מניחים את העכבר תחת מנורת חום ולהשאיר עד התודעה הוא חזר, 5 - 10 דקות. לאחר ההכרה הוא חזרה ובמהלך כל תקופת ההחלמה, העכבר צריך לעבור וambulate כרגיל ולא מראה סימנים של מצוקה.

שחזור 5. וניתוח

  1. לספק ניהול כאב שלאחר ניתוח כולל הממשל של עצירות בצורת ג'לטין פה ב 0.5 מ"ג / קילוגרם כל 12 שעות במשך 48 שעות. אוראלי אינו דורש ריסון בעלי החיים שעלולים לגרום לכאב באזור בית החזה.
  2. לשמור על העכבר בכלוב עם גישה חופשית למזון ומים בתקופת ההחלמה. לאחר החתך הוא יבש, יכולות להיות שותף שוכנו חיות נשיות ואילו גברs חייבת להישאר מבודדת כדי למנוע לחימה.
  3. לאחר תקופת ההחלמה, בצע את ההליך שאושר להמתת חסד. הסר את כלוב הצלעות לקיבעון וניתוח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעלי חיים בדרך כלל להתאושש במהירות מהליך זה, חתך מחלים טוב, ובעלי החיים מפגינים התנהגות נורמלית. ההליך משתמש אספקה ​​זמינה באופן מסחרי ואחרי אימון, ניתן להשלים בתוך פחות 1 שעה. לפני השימוש בהליך זה כדי להפיק נתונים ניסיוניים, חשוב לנתח את הכריתה בנקודת זמן יום 0 כדי לקבוע אם כל שברי עצמות גדולים עשויים להישאר באזור הכריתה. אחת דרכים להעריך הליך נכון היא להעריך את בעלי החיים על ידי X-ray או ההדמיה microCT לאחר הניתוח, אם כי זה בדרך כלל דורש אישורי בטיחות קרינה מיוחדים. במקום זאת, נ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאשר לומדים פרוטוקול זה ראשון, לקבוע היכן לאתר את החתך הראשוני יכול להיות מאתגר. עם זאת, בפועל על עכברים מורדמים עוזר המנתח ללמוד היכן למקם את החתך הראשוני ולחשוף את הצלעות הרצויות כך שעברו כריתה. עבודה על גופות גם משפרת את המיומנויות המוטוריות העדינה הדרושות כדי להסיר את חלק הצלעות עם או בלי קרום העצם. בנוסף, מישהו חדש להליך זה עלול למצוא את המניפולציה של הכלים העדינים ודקים תפרים להיות קשה. בעוד קשירה מ, עודף משיכת התפר יכולה לקרוע את הרקמות. לכן, כמה תפירה בפועל גם על גופות יכו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לחברי מעבדת מריאני על הקריאה הביקורתית של כתב היד. מקורות המימון שלנו היו: מלגת מחקר של חוקר רפואי בקסטר (ל-M.K.S.), מלגות לתואר ראשון ב-USC ומלגות הפרובוסט, הדיקנית ג'ואן מ. שפר ומלגות רוז הילס, (ל-M.K.S). אנו מכירים גם במלגת CIRM BRIDGES דרך מכללת פסדינה סיטי (ל-T.T.T). וקרן המחקר והחדשנות של ג'יימס ה. זומברג', יוזמת הרפואה הרגנרטיבית של USC ו-NIAMS NIH תחת פרס מספר R21AR064462 (ל-F.V.M).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מספריים מיקרו-דיסקציה בגודל בינוני (Vannas-Tü מספריים קפיציים bingen 5 מ"מ)Fine Science Tools15003-08
מספריים מיקרו-דיסקציה עדינים (Vannas Spring Scissors - קצה חיתוך 2 מ"מ)Fine Science Tools15000-04קצה מעוקל מועיל
מיקרו-אזמל 5.0 מ"מFine ScienceTools 10315-12ניתן להחליף אזמלים עדינים אחרים
Dumont 55 מלקחייםFine Science Tools11295-51
מפרק Fine Science Tools17004-05יכולת כוונון נוחה
מחזיקי מיקרו מחטיםFine Science Tools12060-01
9.0 תפרי ניילון (Ethilon), נקודת התחדדות הטובה ביותרEthicon2819G אונקודת התחדדות דומה הטובה ביותר אך חיתוך הפוך הוא גם טוב
7.0 תפרי פרולן (פרולן)ב-Ethicon8700H או דומה6-0, נקודת המחט יכולה להשתנות
מלקחיים גדולים (מלקחיים של אדסון)Fine Science Tools11006-12מותגים אחרים הם משחת עיניים סיכה משובחת
(דמעות אקווה)Akorn17478-062-35
דבק תפרים (דבק רקמות מקומי GLUture)ל-Abbot32046-01יש זמן עבודה מצוין
ShaverWahl9918-6171 או מנורת
Zoo MedLF-5
נורת אינפרא אדום, 75WZoo MedRS-75
RC2 מערכת הרדמת מכרסמיםVetEquip 922100
IsoFlo (Isoflurane)Abbot05260-05
בופרנורפין (בופרנקס)רקיט בנקיזר12496-0757-1
BetadinePurdue Frederick67618015017
ג'לטין בטעם, ג'לי פטלB000E1FYL0מורכב ממוצק, לעקביות של 'ג'יגלרים'
ניתן להשתמש גם מהדק דומה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Philip, S. J., Kumar, R. J., Menon, K. V. Morphological study of rib regeneration following costectomy in adolescent idiopathic scoliosis. Eur Spine J. 14 (8), 772-776 (2005).
  2. Munro, I. R., Guyuron, B. Split-rib cranioplasty. Ann Plast Surg. 7 (5), 341-346 (1981).
  3. Taggard, D. A., Menezes, A. H. Successful use of rib grafts for cranioplasty in children. Pediatric neurosurgery. 34 (3), 149-155 (2001).
  4. Head, J. R. Prevention of Regeneration fo the Ribs: A problem in thoracic surgery. Archives of Surgery. 14 (6), 1215-1221 (1927).
  5. Kawanabe, Y., Nagata, S. A new method of costal cartilage harvest for total auricular reconstruction: part I. Avoidance and prevention of intraoperative and postoperative complications and problems. Plastic and reconstructive surgery. 117 (6), 2011-2018 (2006).
  6. Cheung, K. M., et al. An externally fixed femoral fracture model for mice. Journal of orthopaedic research : official publication of the Orthopaedic Research Society. 21 (4), 685-690 (2003).
  7. Matthys, R., Perren, S. M. Internal fixator for use in the mouse. Injury. 40, Suppl 4. S103-S109 (2009).
  8. Cooper, G. M., et al. Testing the critical size in calvarial bone defects: revisiting the concept of a critical-size defect. Plastic and reconstructive surgery. 125 (6), 1685-1692 (2010).
  9. Ask the Vet. JAX NOTES. 499, Available from: http://jaxmice.jax.org/jaxnotes/archive/499c.html (2005).
  10. Flecknell, P. A., Roughan, J. V., Stewart, R. Use of oral buprenorphine ('buprenorphine jello') for postoperative analgesia in rats--a clinical trial. Laboratory animals. 33 (2), 169-174 (1999).
  11. Rigueur, D., Lyons, K. M. Whole-mount skeletal staining. Methods in molecular biology. 1130, 113-121 (2014).
  12. Evans, D. J. Contribution of somitic cells to the avian ribs. Developmental biology. 256 (1), 114-126 (2003).
  13. Colnot, C., Thompson, Z., Miclau, T., Werb, Z., Helms, J. A. Altered fracture repair in the absence of MMP9. Development. 130 (17), 4123-4133 (2003).
  14. Lu, C., et al. Cellular basis for age-related changes in fracture repair. Journal of orthopaedic research : official publication of the Orthopaedic Research Society. 23 (6), 1300-1307 (2005).
  15. Zilberman, Y., Gafni, Y., Pelled, G., Gazit, Z., Gazit, D. Bioluminescent imaging in bone. Methods in molecular biology. 455, 261-272 (2008).
  16. Pelled, G., Gazit, D. Imaging using osteocalcin-luciferase. Journal of musculoskeletal. 4 (4), 362-363 (2004).
  17. Elefteriou, F., Yang, X. Genetic mouse models for bone studies--strengths and limitations. Bone. 49 (6), 1242-1254 (2011).
  18. Srour, M. K., et al. Natural large-scale regeneration of rib cartilage in a mouse. J. Bone Miner. , (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים