מאמר שיטה

פרוטוקול פשוט ומהיר לללא אנזימי רקמות אנושיות טריות לנתק לניתוח להחדרה לימפוציטים

DOI:

10.3791/52392

⸱

6 בדצמבר 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Molecular Immunology Unit, Université Libre de Bruxelles, 2Institut Jules Bordet, Université Libre de Bruxelles, 3Institut d'Immunologie Médicale, Université Libre de Bruxelles, 4Flow Cytometry Core Facility, Université Libre de Bruxelles

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר דיסוציאציה לא אנזימטית מהירה של שברי רקמות אנושיות טריות לצורך הערכה איכותית וכמותית של תאי CD45+ (לימפוציטים/לויקוציטים) הקיימים ברקמות אנושיות נורמליות וממאירות שונות. בנוסף, ניתן לאסוף ולאחסן את הסופרנטנט המתקבל מהרקמה הראשונית הומוגנטית לצורך ניתוח או ניסויים נוספים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היכולת של תאים ממאירים ללהתחמק ממערכת החיסון, המתאפיינת בבריחת גידול משני תגובות חיסון מולדים ובעלי כושר הסתגלות, מקובל כיום כסימן היכר חשוב של הסרטן. המחקר שלנו על סרטן השד מתמקד בתפקיד הפעיל שלימפוציטים גידול הסתננות לשחק בהתקדמות גידול ותוצאת מטופל. לקראת מטרה זו, פיתחנו מתודולוגיה לבידוד המהיר של תאי הלימפה שלמים מרקמות נורמליות ולא נורמליות במאמץ כדי להעריך אותם בסמוך למדינה האם שלהם. Homogenates הוכנה באמצעות תכנית Dissociator מכאנית שתי התאוששות כדאיות ותא גדלה תוך שמירת רקמות לעומת ביטוי קולט משטח לאנזים-מעוכלות. יתר על כן, עיכול אנזימטי של החומר מסיס שנותר לא התאושש CD45 תאים + נוספים מצביעים על כך שמדידות כמותיות ואיכותיות בhomogenate העיקרי העשויים באמת משקפות תת-אוכלוסיות שחדרו בfragm הרקמהאף אוזן גרון. תאי הלימפה בhomogenates אלה יכולים להיות בקלות מאופיינת באמצעות חיסוני (פנוטיפ, הפצה, וכו ') או מולקולרי (DNA, RNA ו / או חלבון) מתקרב. גם תאי CD45 + יכולים לשמש לטיהור תת-אוכלוסייה, התרחבות במבחנה או הקפאה. יתרון נוסף של גישה זו הוא שsupernatant הרקמה העיקרי מhomogenates יכול לשמש כדי לאפיין ולהשוות ציטוקינים, כמוקינים, נוגדנים ואנטיגנים הנמצאים ברקמות נורמליות וממאירים. פונקציות זה פרוטוקול טוב מאוד לרקמות שד אנושיות וצריכה להיות ישימות למגוון רחב של רקמות נורמליות ולא נורמליות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המיקרו-סביבה של הגידול מורכבת מסוגי תאים שונים עם מחקרים רבים המראים שכל אחד מהם ממלא תפקידים מובהקים וחשובים בגידול1,2. אלה כוללים, בין היתר, תאי חיסון חודרים, תאי סטרומל, תאי אנדותל ותאי גידול3. מחקרי Ex vivo של לימפוציטים חודרים לגידול (TIL; תאי CD45+ או לויקוציטים, שהם בעיקר לימפוציטים בגידולי שד) מדגימות רקמה אנושית טריות מקשים על ידי תדירותם הנמוכה, גדלי המדגם הקטנים הזמינים לעתים קרובות למחקר והפוטנציאל לאובדן כדאיות במהלך המיצוי. מכיוון שתאי חיסון החודרים לגידולים נמצאים בדרך כלל כנוסעים ולא כתושבי קבע באופן כללי, קל יותר לשחרר אותם ממטריצת הרקמות.

ניתוק רקמת הגידול תוך שמירה על שלמות התא הוא מאתגר מבחינה טכנית ובוצע באופן מסורתי באמצעות שילוב של שלבים מכניים ואנזימטיים להכנת תרחיפי תאיםבודדים 4-8. גישה זו כרוכה בתקופות דגירה ארוכות וקשורה לירידה משמעותית בכדאיות התא כמו גם לאובדן קולטנים על פני התא על ידי מחשוף אנזימטי. מחקרים ציטומטריים זרימה באיכות גבוהה המאפיינים TIL במיקרו-סביבת הגידול, כמו גם טיהורים נקיים של תת-אוכלוסיות CD45+ על ידי ציטומטריית זרימה או חרוזים מצופים נוגדנים קשים יותר להשגה מרקמת גידול מעוכלת אנזימים. בנוסף, הסופרנטנט (SN) מההומוגנט של הגידול שנוצר אינו ניתן לניתוח נוסף כולל כימות של חלבונים מופרשים (ציטוקינים, כימוקינים, אימונוגלובולינים או אנטיגנים של גידול) או טיפול ניסיוני בתאים נורמליים, בגלל הפוטנציאל לפירוק חלבונים בעיכול האנזימטי.

בחיפושינו אחר שיטה להכנת הומוגנטים של תאים בודדים מרקמות שד [כולל רקמות שד גידוליות, רקמות שד שאינן סמוכות (NANT) ונורמליות (מהקטנת חלב)] ללא עיכול אנזימטי, בדקנו מגוון טכניקות הומוגניזציה מכניות. הומוגנטים שהוכנו באמצעות דיסוציאטור מכני הגדילו את כדאיות התאים (פי 2) ואת התאוששות התאים הכוללת (פי 2) תוך שמירה על ביטוי קולטני פני השטח. העיכול האנזימטי של החומר הבלתי מסיס שנותר לא הצליח לשחזר תאי CD45+ נוספים, מה שמרמז על כך שכולם שוחררו בהומוגנאט הראשוני. לפיכך, גישה מהירה ופשוטה זו מאפשרת הערכה איכותית וכמותית של תת-אוכלוסיות CD45+ הקיימות ברקמות אנושיות נורמליות וממאירות שונות. יתרון נוסף של גישה זו הוא שניתן לאסוף ולאחסן את ה-SN מההומוגנאט הראשוני (SN של רקמה ראשונית) להמשך ניתוח או ניסויים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: כל הדגימות נרכשו באמצעות פרוטוקול שאושר על ידי ועדת האתיקה הרפואית של מכון ז'ול בורדה בכתב הסכמה מהדעת שהתקבלה מכל מטופל.

1. הכנת homogenate רקמות

  1. לנתח רקמות resected (רקמה ממארת ונורמלית שעברה כריתה מחדר הניתוח) נמצא במעבדה הפתולוגית על ידי צוות מיומן לאיסוף מיידי. גידול, Nant (נלקח המרחק הרחוק ביותר מהגידול ככל האפשר) ושברי רקמה נורמלים מעובדים בתוך 1 באופן שגרתי - 3 שעות של כריתה כירורגית במעבדה BSL2 באמצעות נהלי בטיחות ביולוגיים סטנדרטיים לרקמות אנושיות. תרשים זרימה של הפרוטוקול באיור 1.
  2. לשקול את כל שברי הרקמה (רגיל, Nant וגידול) ולמדוד את האורך, רוחב, וגובה (גובה x אורך x רוחב). זהו צעד חשוב לנורמליזציה הבאה של תת-אוכלוסיות של תאים, RNA שחולץ, וכו '
    NOTE: מגוון רחב של גודל מדגם הוא בין 100 ל -10,000 מ"מ 3 ללא שומן במידת האפשר.
  3. חותם בר הגידול בשקופית זכוכית לצביעת H & E כדי לוודא שהרקמה היא למעשה חלק של הגידול.
    1. לעשות זאת על ידי לחיצה על שקופית מיקרוסקופ זכוכית על בר הגידול והפעלת לחץ עדין עם האצבעות שלך לכמה שניות.
    2. תקן את השקופיות עם isopropanol למשך 2 דקות ואחריו צעד כביסה במים. Counterstain הרקמה למשך 30 שניות עם hematoxylin של מאיר.
    3. לשטוף את השקופית בשש אמבטיות של מים. כתם בPhloxine B 2% למשך 15 שניות.
    4. לשטוף באמבטיה של מים אחד ואחריו ארבע אמבטיות של isopropanol ולסיים עם אמבטיה אחת של מים.
    5. דגירה בisopropanol דקות 1 וניקוז. ברור בשתי אמבטיות של קסילן.
    6. הר עם הרכבה בינונית מבוסס קסילן. לבחון ל- תאי גידול (איור 2).
      הערה: בעיקר, תאים סרטניים לדבוק שקופית המוטבעות - סטרומה, הלימפה או מודעהipose תאים רק לעתים נדירות נותרו, ולהשאיר רווחים בין התאים הסרטניים (איור 2).
  4. מניחים את בר הרקמה בצלחת תרבות קטנה המכילה 1 מיליליטר של הגדרה כימית, המדיום הסלולרי hematopoietic סרום ללא (להלן כבינוני) בטמפרטורת חדר לקוביות אותו לחתיכות קטנות (~ 1 - 2 מ"מ 2) באמצעות סטרילי אזמל.
  5. העבר את הכל (שברי רקמה + בינוני) לצינור C Dissociator מכאני.
  6. יש לשטוף את צלחת פטרי ואזמל עם 2 מיליליטר של מדיום בעזרת פיפטה פסטר ולהוסיף את זה לצינור C (נפח בינוני לניתוק = 3 מיליליטר).
  7. השתמש בA.01 המכנית תכנית Dissociator לצינורות C (התכנית העדינה ביותר) לhomogenize ברי הרקמה לתוך השעיה תא בודדת. מניחים את צינור C במנגנון ולהפעיל את התכנית פעמיים ברציפות (מחזור אחד = 25 שניות).
    הערה: הליך הומוגניזציה זה כבר נקבע ואושר לרקמת שד אנושית, קיבה אחרתאו או רקמת סוגים ייתכן שיצטרכו להשתמש בתכנית אחרת וצריכים להיבדק ראשון.
  8. הסר את צינור C מהמנגנון ולמזוג homogenate ישירות לתוך מסננת תא 40 מיקרומטר יושבת על צינור 50 מיליליטר. שימוש באותה פיפטה פסטר כמו בשלב 1.6, להעביר כל נוזל שנותר בצינור ג 'למסננת התא.
  9. העבר את הנוזל המסונן לתוך צינור 15 מיליליטר באמצעות קצה micropipette 1 מיליליטר. באופן זמני לשמור את מסננת התא ושפופרת 50 מיליליטר שלה.
  10. יש לשטוף את צינור C עם 3 מיליליטר נוסף של מדיום ולהעביר את זה, שוב באמצעות אותו פיפטה פסטר כמו בשלב 1.6, למסננת התא עדיין יושבת על צינור 50 מיליליטר. לסחוט סכום מקסימאלי של הנוזל שיורית לכודים ברקמות unhomogenized לתוך צינור 50 מיליליטר בעדינות על ידי הזזתו סביב המסננת עם טפטפת נקי פסטר או טיפ 1 מיליליטר שנזרק משם בהמשך, כדי למנוע זיהום eluate.
  11. מניחים את מסננת התא במהופך על tהוא צינור מקורי C ולשטוף עם 3 מיליליטר של מדיום, כך שרקמת unhomogenized הטיפות בחזרה לתוך צינור C.
  12. -Homogenize מחדש כמו בשלב 1.7 לשני מחזורים של תכנית A.01.
  13. יוצקים homogenate השני זה דרך מסננת התא יושבת על צינור 50 מיליליטר, לשטוף את צינור C שוב עם 3 בינוני מיליליטר (כמו בשלב 1.10) ולהעביר עם פיפטה פסטר למסננת התא יושבת על צינור 50 מיליליטר שוב לוחץ מרבי כמות הנוזל מרקמת חיבור שיורית לכודה במסננת התא.
  14. בשלב זה, בהיקף של ~ 2.5 מיליליטר הוא בצינור 15 מ"ל ו~ 9 מיליליטר בשפופרת 50 מיליליטר.

2. הפרדה של רקמות ותאי Supernatant

  1. צנטריפוגה homogenates ב -15 מיליליטר ו -50 מיליליטר צינורות במשך 15 דקות ב 600 XG בטמפרטורת חדר.
  2. למזוג SN מצינור 15 מיליליטר לתוך צינור נקי ובאופן זמני לאחסן על 4 מעלות צלזיוס. supernatant זה = גידול ראשוני, Nant או ti הרגילssue SN (נפח סופי של 2.5 מיליליטר) יובהר בהמשך וaliquoted לפני האחסון ב -80 ° C עבור ניתוחים בעתיד (ראה להלן).
  3. בטל supernatant מצינור 50 מיליליטר.
  4. בעדינות resuspend שני כדורי התא בנפח סופי של 1 מיליליטר בינוני. בקצרה, ראשון לשבור בעדינות התא גלולה בשני הצינורות (על ידי הקשה על הצינור על משטח קשה). Resuspend תא גלולה הרופפת במ"ל 50 עם 500 μl של מדיום ולהעביר השעיה תא זה לצינור 15 מיליליטר לresuspend גלולה השני. חזור על שלב זה פעם אחת עם 500 μl השני של מדיום להתאוששות המרבית של תאים.
  5. העברת 10 μl של ההשעיה תא צינור קטן, לערבב עם 10 μl של trypan כחול (דילול של 1: 1) ולספור את מספר תאי קיימא באמצעות hemocytometer.
    הערה: בשלב זה כל חלק של ההשעיה התא יכול גם להיות מנותח על ידי הזרימה cytometry כדי להעריך גודל תא, גרעיניות ואם ארצה במספר מוגבל של סמנים תת-אוכלוסייה ליותר PreCהערכת ISE של חלוקת התא היחסית בhomogenate לפני ניתוח או ניסויים נרחבים. כל הניתוחים על ידי זרימת cytometry לשלב תיוג CD45 לנורמליזציה של תת-אוכלוסיות.
  6. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר. התאים מן הגידול, Nant, או רקמה נורמלית מוכנים לטיהור או ניתוח נוסף עכשיו. צעדים נוספים אלה הם הטובים ביותר כאשר היא מבוצעת באותו היום כניתוח.
    הערה: לניתוח תזרים cytometric אך לא תא מיון תאי דם האדומים שיורית יש lysed לאחר תיוג נוגדנים על ידי הוספת 0.4 מיליליטר של חיץ תמוגה תא דם האדום לתא גלולה, מייד vortexing 1 שניות ודוגרים על מינימום של 10 דקות בחדר טמפרטורה (מוגן מפני אור) לפני הניתוח.

3. הבהרה של Supernatant רקמות

  1. צנטריפוגה הצינורות 1.5 מיליליטר עם SN הרקמה ב 15,000 XG במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
  2. להסיר בזהירות tהוא supernatant בלי לגעת או להפריע גלולה. מעביר צינור נקי (או צינורות) תלוי במספר ובהיקף של aliquots הרצוי.
  3. אחסן את supernatant ב -80 ° C לשימוש עתידי.

4. דם חולה

  1. לאסוף דגימת דם מכל מטופל כביקורת על ידי venipuncture לתוך צינורות heparinized היום לפני הניתוח. צנטריפוגה הדם ב 400 XG במשך 10 דקות ב 20 מעלות צלזיוס עם הבלם מלהשיג את הפלזמה ומעיל באפי.
  2. הסר את הפלזמה ולהבהיר את זה על ידי צנטריפוגה ב10,000 XG במשך 15 דקות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. Aliquot ופלזמה חנות ב -80 ° C לשימוש עתידי. לדלל את המעיל באפי במדיום
  3. הפרד את תאי mononuclear באמצעות צנטריפוגה שיפוע ficoll-hypaque סטנדרטית לפני ניתוח מיידי, בידוד תת-אוכלוסייה, DNA / RNA / הפקת חלבון או הקפאה.

5. cytometry הזרימה

  1. תאי תווית על פי ייצורההוראות של r ב 4 ° C, מוגן מפני אור. תאי דם אדום בLyse השעיות תא מברי רקמה לאחר תיוג נוגדנים על ידי הוספת 0.4 מיליליטר של חיץ תמוגה תא לתא גלולה.
  2. מערבולת מייד ל1 שניות ודגירת מינימום של 10 דקות בטמפרטורת חדר, מוגן מפני אור. להעביר את התאים שכותרתו בcytometer זרימה לרכישת נתונים ללא שטיפה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עיכול אנזימתי של שברי רקמות עם שני פתרונות זמינים מסחרי ניתוק רקמה או תערובות מעבדה שונות של collagenase, DNase ו / או מעכבי hyaluronidase, לדבוק במגוון רחב של קולטנים על פני השטח של תאים. המחקרים שלנו, התמקדו בתחילה בתאי CD4 + T חדירת גידולים בשד, הוצגו במהירות עם בעיה טכנית עיקרי בשל מחשוף של הקולטנים CD4 משטח תוך שימוש בפרוטוקולים סטנדרטי עיכול אנזימטי 4-8. בדקנו מגוון רחב של אנזימי collagenase עם או בלי DNase ומעכבי hyaluronidase, מציאת collagenase שI ו- ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מתאר שיטה מותאמת להכנה המהירה של homogenates רקמת שד הנורמלית וממאירים ללא עיכול אנזימטי למיון לאחר תא, חילוץ, הקפאה ו / או ניתוח פנוטיפי של CD45 + תת-אוכלוסיות. המטרה של הגישה הניסויית הזה היא לייצר תמונות של TIL המשקף באופן הדוק את מדינתם in vivo ולהשוות אותם לרקמות נורמליות עם מניפולציה מינימאלית של הרקמות טריות מחדר הניתוח. נכון להיום, במעבדה שלנו השתמשה בפרוטוקול זה כדי לנתח> 250 רקמות טריות לפנה"ס (גידול וNant),> 35 רקמות שד נורמליות מה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי לא קיים ניגוד עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי fromthe קרן בלגית למחקר מדעי (FNRS), Les Amis de l'Institut Bordet, FNRS הפעולה Télévie, התכנית למלחמה בסרטן בבלגיה, Fonds לאמבו-Marteaux, Fonds JC Heuson וFonds Barsy.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
GentleMacs DissociatorMiltenyi Biotec130-093-235BD Medimachine שווה ערך במקצת
צנטריפוגה 5810 REppendorfאו צנטריפוגה שולחנית סטנדרטית אחרת
צנטריפוגה 5417 REppendorfאו מיקרוצנטריפוגה סטנדרטית אחרת
Esco Class II A2 Biosafety CabinetESCO גלובליאו אחר BSL2 סטנדרטי מכסה המנוע
מיקרוסקופ הפוךNikon eclipse TS100או מיקרוסקופ אחר התואם להמציטומטר
Bü rker chamberMarienfield 640210או המציטומטר סטנדרטי אחר
Navios Flow Cytometerבקמן קולטראו ציטומטר זרימה אחר (מומלץ 8-10 צבעים)
GentleMacs C-TubeMiltenyi Biotec130-096-344BD Medimachine משתמש
בצלחת תרבית תאיםSarstedt72,710או כלי פלסטיק אחרים שאינם פירוגניים
אזמל חד פעמיSwann-Morton0510או מסננת תאי BD סטרילית לשימוש חד פעמי
סטנדרטי 40 ומיקרו; mBecton Dickinson734-0002או כלי פלסטיק אחרים שאינם פירוגניים
BD Falcon Tube 50 מ"לBecton Dickinson352070או כל פלסטיק אחר שאינו פירוגני
BD Falcon Tube 15 מ"לBecton Dickinson352097או כל פלסטיק אחר שאינו פירוגני
BD FACS Tube 5 מ"לBecton Dickinson352008או כל פלסטיק אחר שאינו פירוגני
פסטר סטרילי פיפטה 5 מ"לVWR612-1685או כלי פלסטיק אחרים שאינם פירוגניים
צינור מיקרופוגה 1.5 מ"לEppendorf7805-00או כלי פלסטיק אחרים שאינם פירוגניים
X-Vivo 20LonzaBE04-448Qללא סרום בינוני מומלץ
פוספט חוצץ מלחLonzaBE17-516Fסטנדרטי פיזיולוגי PBS
טריפן כחולVWR17942Eאו כתם חיוני אחר
VersaLyseBeckman CoulterA09777לניסויי ציטומטריית זרימה
כדאיות ניתנת לתיקון Dye eFluor 780eBioscience65-0865-14לניסויי ציטומטריית זרימה
anti-CD3 FITCBD Biosciences345763לניסויי ציטומטריית זרימה
anti-CD3 Vio BlueMiltenyi Biotec130-094-363לניסויי זרימה ציטומטריה
anti-CD4 PEBD Biosciences345769לניסויים בזרימה ציטומטריה
anti-CD4APC Miltenyi Biotec130-091-232לניסויים בזרימה ציטומטריית
אנטי-CD8 ECDבקמן קולטר737659לניסויים בזרימה ציטומטרית
anti-CD8 PerCPBD Biosciences345774לניסויים בזרימה ציטומטרית
anti-CD19 APC-Vio770Miltenyi Biotec130-096-643לניסויי זרימה ציטומטריה
anti-CD45 VioGreenMiltenyi Biotec130-096-906לניסויי זרימה ציטומטריה
של Filcon

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chen, D. S., Mellman, I. Oncology meets immunology: the cancer-immunity cycle. Immunity. 39 (1), 1-10 (2013).
  2. Boudreau, A., van't Veer, J. L., Bissell, M. J. An 'elite hacker': breast tumors exploit the normal microenvironment program to instruct their progression and biological diversity. Cell Adh Migr. 6 (3), 236-248 (2012).
  3. Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nat Immunol. 14 (10), 1014-1022 (2013).
  4. Quezada, S. A., et al. Limited tumor infiltration by activated T effector cells restricts the therapeutic activity of regulatory T cell depletion against established melanoma. J Exp Med. 205 (9), 2125-2138 (2008).
  5. Grange, C., et al. Phenotypic characterization and functional analysis of human tumor immune infiltration after mechanical and enzymatic disaggregation. J Immunol Methods. 372 (1-2), 119-126 (2011).
  6. McCauley, H. A., Guasch, G. Serial orthotopic transplantation of epithelial tumors in single-cell suspension. Methods Mol Biol. 1035, 231-245 (2013).
  7. Gros, A., et al. Myeloid cells obtained from the blood but not from the tumor can suppress T-cell proliferation in patients with melanoma. Clin Cancer Res. 18 (19), 5212-5223 (2012).
  8. Zirakzadeh, A. A., Marits, P., Sherif, A., Winqvist, O. Multiplex B cell characterization in blood, lymph nodes, and tumors from patients with malignancies. J Immunol. 190 (11), 5847-5855 (2013).
  9. Gu-Trantien, C., et al. CD4(+) follicular helper T cell infiltration predicts breast cancer survival. J Clin Invest. 123 (7), 2873-2892 (2013).
  10. Buisseret, L., et al. Lymphocytes Infiltrating Breast Cancer : Density, Composition And Organization. Annals of Oncology. 25 (1), 17(2014).
  11. Garaud, S., et al. Characterization of B Cells Infiltrating Human Breast Cancer. Annals of Oncology. 25 (1), 18(2014).
  12. Gu-Trantien, C., et al. Cxcl13-Producing Follicular Helper T Cells In Human Breast Cancer. Annals of Oncology. 25 (1), 17(2014).
  13. Yee, C. The use of endogenous T cells for adoptive transfer. Immunol Rev. 257 (1), 250-263 (2014).
  14. Butler, M. O., et al. Ex vivo expansion of human CD8+ T cells using autologous CD4+ T cell help. PLoS One. 7 (1), 30229(2012).
  15. Ye, Q., et al. Engineered artificial antigen presenting cells facilitate direct and efficient expansion of tumor infiltrating lymphocytes. J Transl Med. 9, 131(2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Tissue HomogenizationMechanical DissociationLymphocyte IsolationFlow CytometryCell ViabilityCD45 Positive CellsTissue SupernatantCytokine AnalysisBreast TissueCell Recovery

מאמרים קשורים