התאמת שינויים גנטיים ספציפי DNA מתילציה עם ביטוי ותעתיק פעילות של astrocytic KCNJ10 (Kir4.1)

Summary

DNA מתילציה מסוגלת לשמור על רמות יציבות של ביטוי גנים וכן לאפשר שינויים דינמיים בביטוי גנים בתגובה למגוון גירויים. אנו מפרטים טכניקות המאפשרות לחקור שינויים ספציפיים לגנים במתילציה של DNA ואת ההשפעה של שינויים אלה על ביטוי גנים.

Abstract

מתילציה של DNA משמשת לוויסות ביטוי גנים באמצעות התקשרות קוולנטית של קבוצת מתיל למיקום C5 של ציטוזין בדינוקלאוטיד ציטוזין-גואנין. בעוד שמתילציה של DNA מספקת שינויים ארוכי טווח ויציבים בביטוי גנים, דפוסים ורמות של מתילציה של DNA נתונים גם הם לשינוי על סמך מגוון אותות וגירויים. ככזה, מתילציה של DNA מתפקדת כמווסת חזק ודינמי של ביטוי גנים. חקר הנוירואפיגנטיקה חשף מגוון מצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים הקשורים לשינויים גלובליים וספציפיים לגנים במתילציה של DNA. באופן ספציפי, מתאמים בולטים בין שינויים בביטוי גנים ומתילציה של DNA קיימים בהפרעות נוירו-פסיכיאטריות ונוירודגנרטיביות, במהלך פלסטיות סינפטית ובעקבות פגיעה במערכת העצבים המרכזית. עם זאת, ככל שתחום הנוירואפיגנטיקה ממשיך להרחיב את הבנתו את תפקיד מתילציה של DNA בפיזיולוגיה של מערכת העצבים המרכזית, תיחום קשרים סיבתיים ביחס לשינויים בביטוי גנים ומתילציה של DNA הם חיוניים. יתר על כן, בכל הנוגע לתחום הרחב יותר של מדעי המוח, נוכחותם של הבדלים נרחבים באזור וספציפי לתא דורשת טכניקות המתייחסות לשונות זו בעת חקר הטרנסקריפטום, הפרוטאום והאפיגנום. כאן אנו מתארים מיון FACS של אסטרוציטים בקליפת המוח המאפשר בדיקה עוקבת של שעתוק RNA ומתילציה של DNA. יתר על כן, אנו מפרטים טכניקה לבחינת מתילציה של DNA, ניתוח התכה ברזולוציה גבוהה רגיש למתילציה (MS-HRMA) וכן בדיקת מקדם לוציפראז. באמצעות שימוש בטכניקות משולבות אלה ניתן לא רק לחקור שינויים מתאמים בין מתילציה של DNA לביטוי גנים, אלא גם להעריך ישירות אם שינויים במצב המתילציה של ה-DNA של אזור גן נתון מספיקים כדי להשפיע על פעילות השעתוק.

Introduction

אפיגנטיקה היא חקר שינויים כימיים שיכולים להשפיע על פעילות השעתוק של הגנום. בעיקרו של דבר, ללא שינוי ברצף ה-DNA, שינויים אפיגנטיים כגון מתילציה של DNA, אצטילציה של היסטון ומתילציה של היסטון מספיקים כדי לשנות באופן הפיך את דפוסי ביטוי הגנים ¹. מתילציה של DNA, מווסת חזק של ביטוי גנים, היא השינוי האפיגנטי המאופיין ביותר. מתילציה של DNA היא התקשרות קוולנטית של קבוצות מתיל במיקום C5 של ציטוזין, בדרך כלל הציטוזין של ציטוזין-גואנין דינוקלאוטיד, הידוע גם כאתר CpG. אזורים המכילים צפיפות גבוהה של אתרי CpG ידועים כאיי CpG (CGI). CGIs קשורים לעתים קרובות לאתרי התחלת שעתוק (TSS) ולמקדמי גנים ^1-3. לפיכך, בעוד ששינויים במתילציה של DNA ב-CGIs אינם תמיד במקביל לשינויים בביטוי או בתפקוד התאים, שינויים במתילציה של DNA ב-CGIs יכולים להפעיל ויסות רב עוצמה על פעילות השעתוק ².

מבחינה היסטורית, מתילציה של DNA נצפתה כחיונית באמבריוגנזה, הטבעה והתפתחות, עם שינויים קטנים ברמות המתילציה של ה-DNA המתרחשים בתאים פוסט-מיטוטיים (למעט שינויים בגנים הקשורים לסרטן) ^4,5. עם זאת, תחום הנוירו-אפיגנטיקה הדגיש תפקיד לא התפתחותי חשוב למתילציה של DNA. באופן ספציפי, אפיגנטיקה קוגניטיבית הגדירה מחדש מתילציה של DNA כמנגנון פלסטי ביותר אינטגרלי בתיווך הן הפעלה שעתוק והן דיכוי של גנים החיוניים לתהליך הלמידה והזיכרון ⁶. מלבד אפיגנטיקה קוגניטיבית, מחקרים המודלים פגיעה איסכמית וכאב נוירופתי מאפיינים מתילציה של DNA כמנגנון גמיש המגיב במהירות למגוון עלבונות במערכת העצבים המרכזית ^7-9. בנוגע לאסטרוציטים, מספר קווי ראיות מצביעים על כך שמתילציה של DNA ממלאת תפקיד חשוב באסטרוגליוגנזה. Fan et al., מצאו כי KO מותנה של DNMT1 בתאי אב עצביים (NPCs) הביא להתפתחות מוקדמת של אסטרוציטים התואמים למצב גלובלי של היפומתילציה ¹⁰. בנוסף, פריסיק ואחרים, הגיעו למסקנה שרמות דיפרנציאליות של מתילציה של DNA של מקדם GLT-1 תיווכו רמות דיפרנציאליות של ביטוי של טרנספורטר הגלוטמט בקליפת המוח ובמוח הקטן, תוך הדגשת תפקיד במתילציה של DNA בביסוס דפוסים ספציפיים לאזור המוח של ביטוי גנים אסטרוציטיים ¹¹. בסך הכל, מחקרים רבים מדגישים את האופי הדינמי והגמיש של מתילציה של DNA במערכת העצבים המרכזית שכן הסביבה, תרופות ופציעה הוכחו כולם כמשנים מתילציה של DNA ולעתים קרובות, ביטוי גנים ^4,9. יחד, מחקרים נוירו-אפיגנטיים אלה מצביעים על מתילציה של DNA כמטרה טיפולית אפשרית עם פוטנציאל להפחית מגוון פתולוגיות של מערכת העצבים המרכזית.

ככל שתחום האפיגנטיקה מרחיב את הבנתו את תפקידה של מתילציה של DNA בהתפתחות נוירולוגית ומחלות, האתגר של העברת מתילציה של DNA לעבר מטרה טיפולית הוא ביצוע לא רק מחקרים מתאמים, אלא גם מחקרים סיבתיים המגדירים מטרות ואתרים ספציפיים של גנים. בנוסף, סקירת שינויים במתילציה של DNA ספציפית לאזור המוח וסוג התא נותרה אתגר מתמשך וראוי לזמן ייחודי לתחום הנוירו-אפיגנטיקה. פרוטוקול זה משתמש במגוון טכניקות כולל מיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS) של אסטרוציטים, ניתוח נמס ברזולוציה גבוהה רגיש למתילציה (MS-HRM), ובדיקת מתילציה של לוציפראז כדי לחקור את מצב המתילציה של ה-DNA של KCNJ10, גן המקודד ל-Kir4.1. Kir4.1 היא תעלת אשלגן ספציפית לגליה המדגימה הן את אזור המוח והן את דפוסי הביטוי הספציפיים לתאים במערכת העצבים המרכזית ^12-16. ביטוי Kir4.1 גדל במעבר מאזורי מערכת העצבים המרכזית הרוסטרלית לאזורי מערכת העצבים המרכזית הזנבית, כאשר הביטוי הגבוה ביותר מתרחש בחוט השדרה ¹⁵. למרות שהתעלה מתבטאת בתאי אפנדימל, אוליגודנדרוציטים ותאי המבשר שלהם, Kir4.1 מתבטא בעיקר באסטרוציטים ונחשב חיוני לשמירה על רמות הומאוסטטיות של אשלגן וכן לתמיכה בספיגת גלוטמט על ידי הגדרת פוטנציאל קרום המנוחה האסטרוציטית בהיפרפולריזציה -80mV ^12,16-19. חשוב לציין, הביטוי של Kir4.1 אינו סטטי הן במהלך ההתפתחות והן לאחר צורות מרובות של פגיעה במערכת העצבים המרכזית ^20-25. ביקשנו לבחון את הוויסות האפיגנטי של ערוץ זה, במיוחד באסטרוציטים במהלך ההתפתחות. הטכניקות בהן נעשה שימוש מציעות ניתוחי אתר CpG ספציפיים וממוקדים לגנים המספקים ראיות סיבתיות לתפקיד של מתילציה של DNA בוויסות ביטוי הגנים KCNJ10. ניתן ליישם טכניקות אלה על גנים אחרים.

Protocol

כל בעלי החיים טופלו בהתאם למכונים הלאומי לבריאות הנחיות. ועדת הטיפול בבעלי חיים והשימוש באוניברסיטת אלבמה בבירמינגהם אישרה שימוש בבעלי חיים.

1. קבלת רנ"א ודנ"א ממועשרת astrocytic אוכלוסייה באמצעות Cell הופעל פלורסנט מיון (FACS) של האסטרוציטים מרקמות המוח כולו

1. בעלי חיים שקט ורגוע עם CO ₂ דקות 1 ולאחר מכן במהירות לערוף. לנתח הקורטקס כמתואר באל אלבוקרקי et, ^26.; אין צורך להסיר את קרומי המוח.
   הערה: חולדות מהונדסות מבטא eGFP תחת S100β (סמן astrocyte) אמרגן נוצרו על ידי Itakura et al ²⁷ ומנוצלות למיון FACS של האסטרוציטים..
2. הכן homogenate המוח כולו באמצעות ערכת ניתוק פפאין בתנאים שאינם סטרילי על פי הפרוטוקול של היצרן. חום להפעיל פפאין על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים במשך 10 דקות. הערה:פתרון פפאין מסופק על ידי יצרן ומכיל L-ציסטאין וEDTA (ראה טבלה של חומרים).
   1. לחתוך או DREMEL חור בחלק העליון של צינור חרוטי 50 מיליליטר כדי לאפשר צינורות ביצוע 95% O _2: 5% CO ₂ להיות מוזנים לתוך צינור חרוטי סגור (איור 1 א). הנח הקורטקס גזור בצלחת תרבות 10mm המכיל תקשורת דיסוציאציה (ממ בתוספת גלוקוז 20mm ופניצילין / סטרפטומיצין (500 U / ml) וequilibrated לO 95% _2: 5% CO ₂₎ ולהשתמש בסכין גילוח נקי לברר ברקמה לתוך 1 x 1 מ"מ ² חתיכות.
3. רקמת העברה באמצעות 10 מיליליטר pipetman הידני לצינור חרוטי 50 מיליליטר מכיל פתרון פפאין. לאפשר לרקמות להתיישב לתחתית פיפטה העברה לפני הפריקה כדי למזער את הכמות של תקשורת ניתוק בוצעה על. שמור פתרון פפאין equilibrated עד 95% O _2: 5% CO ₂ באמצעות חילוף גזי משטח למשך הדגירה. האם לא soluti פפאין בועהעל. דגירה רקמה למשך 20 דקות ב -37 ° C אמבט מים.
4. הדגירה הבאה בפתרון פפאין, רקמת triturate 10 פעמים עם פיפטה 10 מיליליטר העברה במהירות איטית. השעיה תא מעונן צנטריפוגה XG ב 1000 במשך 5 דקות ב RT.
   1. לאזן פתרון DNase / אלבומין מעכב (המסופק על ידי יצרן) באמצעות חילוף גזי משטח מחדש להשעות תאי טבליות ב 3 מיליליטר של פתרון / מעכב אלבומין DNase. הכן שיפוע צפיפות רציפה מסחרי בהתאם להוראות יצרן.
5. ספין שיפוע צפיפות רציף XG ב 1000 במשך 6 דקות. בודד תאים ניתק מהחלק התחתון של צינור על ידי מציצת גלולה תחתונה בעזרת פיפטה.
6. להשעות מחדש תאים ניתק ב2-3 מיליליטר של DPBS עם 0.02% אלבומין בסרום שור ו1 מ"ג / מיליליטר DNase או HEPES העדיף שנאגרו תקשורת והתרבות. עובר דרך 40 מיקרומטר סינון לפני FACS (איור 2 א). שמור את התאים על קרח עד מיון.
   1. בצע FACS ^28.
   2. תאים גלולה ב 1.5 מיליליטר צינורות צנטריפוגה XG ב 2000 במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס.
      הערה: יכולים להיות מנוצלים האסטרוציטים pelleted מייד או נשמרו ב-80 ° C עד מיצוי DNA.
7. לחלץ RNA ו- DNA בשיטת בידוד מועדף ^{29 30.} להעריך RNA וריכוז ה- DNA ואיכות באמצעות ספקטרופוטומטר וbioanalyzer ^31.
   הערה: לנצל רק RNA באיכות גבוהה וDNA בשלבים הבאים, 260/280 = 2.0-2.2 ו1.8-1.9, בהתאמה. ניתוח bioanalyzer הוא חיוני כדי להעריך לשפלת RNA או פיצול ה- DNA. RNA או DNA יכול להיות מנוצל באופן מיידי או מאוחסן ב-80 ° C או -20 ° C, בהתאמה ללימודים שלאחר מכן.

2. הערכת מצב DNA מתילציה של גן באמצעות מתילציה רגישה רזולוציה גבוהה ממיסים ניתוח (MS-HRMA)

1. הזן את רצף גן של עניין לתוכנת מיפוי מתילציה המקוון העדיפה לזהות כל איי CPG בגןעניין ^32.
   1. פריימרים עיצוב נגד bisulfite המירו רצף ה- DNA ³³ ולהגביר באמצעות DNA פולימרז המועדף על פי הפרוטוקול של היצרן. ודא גודל מוצר מוגבר על ידי פועל 1% ג'ל DNA agarose ב 100 V 45 דקות. פריימרים חנות בריכוז מניות של 20 מיקרומטר ב-20 ° C.
2. ביסולפיט להמיר 500-1,000 ng של DNA של כל דגימת DNA והמפוגל סטנדרטים החל 0-100% מאותו המין של בעלי החיים ^34. דגימות Elute לספק ריכוז של 20 ng / μl. ודא ריכוז של ה- DNA המרה bisulfite באמצעות ספקטרופוטומטר ^31.
3. 20 תגובות μl התקנה להגברת MS-HRM באמצעות DNA פולימרז מועדף ופריימרים בריכוז 5 מיקרומטר לפי טבלת 1 ו -2. הפעילו את כל הדגימות, לרבות תקני ה- DNA ומפוגלים FACS, בשלושה עותקים.
4. בהתאם לתוכנת ניתוח, שנקבע לפני ואחרי להתחיל ולהפסיק פרמטריםסביב המעברים של עקום להמיס. התחלה שנקבע מראש להמיס ופרמטרי תחנה מראש להמיס כל כך ההבדל בין השניים הוא 0.2-0.5 מעלות צלזיוס. הגדר תחילת פוסט-להמיס ופוסט-להמיס להפסיק באופן דומה. לחלץ נתונים הבדל טמפרטורת שיא עבור כל דגימה.
5. שימוש בתקני אחוזים מפוגלים (y-ערך) והבדלים ביניהם המקבילים ממוצע טמפרטורת שיא (x-ערך) ליצור משוואת רגרסיה ליניארית (איור 3 א-B, שולחן 3-4). השתמש במשוואת רגרסיה ליניארית זה להעריך מצב מתילציה של דגימות ידועות ^35.

3. הערכת פעילות יזם מפוגל-Hyper באמצעות השימוש בAssay בלוציפראז

1. לזהות איי CPG של גן המטרה (שלב 2.1). PCR להגביר אזורים של עניין ³⁶ וכפיל במעלה הזרם של גן הכתב בלוציפראז luc2 Firefly לייצר פלסמידים CPG-אי-luc2 ^37.
2. Linearize 30 מיקרוגרם של פלסמיד CPG-אי-luc2 באמצעות הגבלהעיכול אנזים ^38. ודאו אתרים להגבלה לעכל ולהימנע מקיצוצים כפולים באמצעות תוכנה חותך מועדף ^38. חום להשבית אנזימים בטמפרטורה מתאימה ומשך הבא עיכול על פי הפרוטוקול של היצרן. הפסד מינימאלי של DNA מתרחש במהלך שלב linearization.
3. פלסמידים Methylate לינארית באמצעות O methylase CPG (M.Sssl) / N על 30 מעלות צלזיוס או להשאיר פרוטוקול היצרן הבא שלא טופל למעט ההתאמות הבאות.
4. בצע 50 תגובות μl.
5. השתמש 5 יחידות של methylase CPG לmethylate 700 ננוגרם של פלסמיד לינארית.
6. הפעל תגובות O / N ל13-19 שעות.
7. בעקבות תגובת methylase CPG, לבצע ניקוי DNA באמצעות סטנדרטי, מסחרי קרום סיליקה ג'ל זמין לנקות ערכה על פי הפרוטוקול של היצרן. הפסדים משמעותיים של ה- DNA להתרחש בעקבות תגובת methylase CPG, 30-60% הפסד.
8. ודא מתילציה של פלסמידים באמצעות הגבלת HPA השני לעכל.
9. קח 1 מיקרוגרם של ה- DNA מפוגל או שאינו מפוגל והגבלה לעכל עם HPA השני עבור שעה 1 על 37 מעלות צלזיוס. השתמש 5-10 יחידות של HPA השני עבור כל ה- DNA מיקרוגרם. בעקבות עיכול HPA השני, לבצע ניקוי DNA באמצעות ערכה לנקות מועדפת, קרום סיליקה ג'ל זמין מסחרי. להפעיל את שני פלסמידים מפוגלים ואינם מפוגלים CPG על 1% ג'ל DNA agarose במאגר טה או TBE ב 100 V 45 דקות להדמיה (איור 4).
10. פלסמידים נושא שני מפוגלים ו- מפוגלים שאינו לעיכול כפול עם אנזימי הגבלה מתאימים לשחרר באורך מלא לוק 2 (וקטור) ואי CPG (להוסיף) שברי ^38. בצע O הכפול העיכול / N בטמפרטורה מתאימה ואנזימי חום להשבית הבא עיכול על פי הפרוטוקול של היצרן. הפסד מינימאלי של ריכוז ה- DNA מתרחש במהלך הגבלה כפולה לעכל.
11. הפעל פלסמידים כפולים מתעכלים על 1% ג'ל agarose DNA ב 100 V עבור שעה 1 כדי לאפשר הפרדה oוקטור f והכנס (איור 4C). זהירות. לובש מגן מגן פנים UV, למקם ג'ל DNA באור שחור שולחן לדמיין להקות. בהתבסס על גודל, הוספה מפוגל ואינו מפוגל בלו ווקטור שאינו מפוגל באמצעות להב כירורגים נקי.
12. DNA תמצית ג'ל באמצעות פנול רווי, pH 6.6. בקצרה, שוקל ג'ל DNA המכיל וקטור או להוסיף. שימוש בפנול 100 μl ל0.1 גרם של ג'ל DNA. Homogenize ג'ל DNA בפנול באמצעות homogenizer dounce הזכוכית.
13. להוסיף כלורופורם (באמצעות 1/5 של פנול נפח) ולנער דגימות במשך 20 שניות. דגירה דגימות ב RT במשך 2-3 דקות. צנטריפוגה במשך 15 דקות במהירות מקסימלית (16.1 x 1,000 XG) על 4 מעלות צלזיוס.
14. הסר תמיסה מימית ולהוסיף 0.1X נפח של נתרן אצטט 3 M ו2.5x נפח של אתנול. דגירה דגימות עבור שעה 1 ב -80 ° C. לאחר דגירה, להסיר אתנול מחדש להשעות DNA ב -30 μl של חיץ מועדף. אובדן משמעותי של ה- DNA מתרחש בידוד של מוסיף ווקטורים הבאים, הנה 30-50%ss.
15. מפוגל-אי מחדש לקשור מוסיף מפוגל ואינו מפוגלים לוקטור באמצעות האנזים T4 DNA ^38. להשתמש ביחס של 1: 4 של וקטור להכניס לתגובות קשירה. תגובת התקנה בהתאם להוראות יצרן. השתמש בהיקף כולל של 50 μl לתגובות דגירה O / N ב -20 ° C או על קרח עם מכסה מעל דלי קרח.
16. בעקבות קשירה, לבצע ניקוי DNA באמצעות ערכה לנקות מועדפת, קרום סיליקה ג'ל זמין מסחרי. אובדן משמעותי של ה- DNA להתרחש בעקבות תגובת קשירה, אובדן 30-50% משוער של ה- DNA. ודא מחדש קשירה ידי הפעלה על 1% ג'ל DNA agarose ב 100 V 45 דקות ולהעריך ריכוז של פלסמידים-ligated מחדש (איור 4D).
17. Transfect פלסמידים מפוגלים או שאינו מפוגלים לתאי D54 באמצעות מגיב transfection מסחרי על פי הפרוטוקול של היצרן. תאי זרע D54 לצלחת 12 גם ב0.14 x 10 ⁶ תאים / טוב.
18. , Wi תאי transfect הבא 24 שעותריכוזים שווים ה של שני (1) פלסמיד-methyated אינו CPG-luc2 + Renilla או וקטור לוציפראז שליטה אחר או (2) פלסמיד מפוגל CPG-luc2 + Renilla או וקטור לוציפראז שליטה אחר.
19. לאפשר לתאי transfect למשך 24 שעות לפני ביצוע assay בלוציפראז הכפול. בצע assay לפי הוראות יצרן. לבצע קריאות באמצעות luminometer. קראו היטב כל בשלושה עותקים.
20. חישוב יחס בין פעילות לוציפראז גחלילית לRenilla או פעילות לוציפראז שליטה אחרת. לנרמל Firefly מפוגל: פעילות לוציפראז שליטה לFirefly-מפוגל עישון: פעילות לוציפראז שליטה על ידי חלוקת פעילות לוציפראז מפוגל על ידי פעילות בלוציפראז אינה מפוגל

Results

אוכלוסייה מועשרת של האסטרוציטים נרכשה באמצעות מיון FACS של בעלי חיים מהונדסים eGFP-S100β ^27. בשל ירידה באיכות של תאים ומולקולות מולקולריות מבודדות מבעלי חיים מבוגרים יותר לאחר הלידה היום 50 (P50), בעלי חיים בגילים P0-P40 הם אופטימליים לניסויים כאלה. רקמת קליפת המוח שימשה לניסויים אלה. קליפת מוח משניים עד שישה בעלי חיים היו נקווה יחד. FACS בוצע במתקן UAB המקיף cytometry הזרימה Core. מיון בוצע על קיטון דיקינסון FACSAria השני. עירור eGFP הושג באמצעות לייזר 488 ננומטר; לא ה...

Discussion

פרוטוקול זה מתאר בידוד של אוכלוסייה מועשרת של אסטרוציטים באמצעות FACS וכן מגוון טכניקות המאפשרות מחקרים מתאמים וסיבתיות בין מתילציה של DNA לביטוי גנים. טכניקות אלה, המשמשות בבידוד או בשילוב, שימושיות במיוחד עבור מעבדות שעובדות עם רקמות בעלות הטרוגניות תאית גבוהה או מעוניינות במצב מתילציה של DNA של גן או אזור גן מסוים לעומת שינויים גלובליים במתילציה של DNA. אתגר ייחודי יחסית בחקר האפיגנום של מערכת העצבים המרכזית הוא מגוון אוכלוסיות התאים. מכיוון שגנים מעניינים עשויים להתבטא בדרגות שונות עם דפוסים ייחודיים מבחינה זמנית ומר...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
מערכת דיסוציאציה פפאין	Worthington Biochemical Corporation	LK003150
AllPrep DNA/RNA Mini Kit	Qiagen	80204
Methyl Primer	Applied Biosystems	תוכנה מקוונת	ללוקליזציה של איי CpG
ערכת מתילציה של DNA EZ	Zymo Research	D5001
תקן כיול מעורבב מראש של חולדות	EpiGenDx	80-8060R-Premix
CpG מתילאז (M.SSSL)	Zymo Research	E2010
QIAquick מיצוי ג'ל	QIagen	28704	משמש למיצוי ג'ל וניקוי DNA
אנזימי הגבלה חותך	NEB ניו אינגלנד BioLabs
חותך NEB	ניו אינגלנד BioLabs	מאמת באינטרנט	אתרי עיכול הגבלה
מערכת בדיקת מדווח לוציפראז כפול	Promega	E1910
וקטור Luc2, pGL4.10	Promega	E6651
וקטור רנילה, pGL4.74	Promega	E2241
TD-20/20 Luminometer	Turner Designs
Lipofectamine LTX ו-Plus Reagent	Life Technologies	A12621
פנול, pH רווי 6.6/6.9	Fisher Scientific	BP 17501-100
Nanodrop 2000/2000c ספקטרופטומטר	ThermoScientific
MeltDoctor Master Mix	Life Technologies	4415440
תוכנה להתכה ברזולוציה גבוהה (HRM) v2.0	Life Technologies	4397808
AB SDS software v2.3	Life Technologies	online
AB High Resolution Melting מדריך תחילת העבודה	Life Technologies	באינטרנט
AB 7900HT טכנולוגיות			מהירות בזמן אמת לחיי