מחוגי ניידות ותפקוד ציטוטוקסיות של retroviral מעתיקה וקטור transduced, שאינם חסיד Alloresponsive T לימפוציטים

Summary

אנו מתארים פרוטוקול לניטור ניידות רדיאלית של תאים חיסוניים שאינם נצמדים במבחנה באמצעות מנגנון סעפת/החלקה של שקיעת תאים. נדידת תאים עוקבת אחר חד-שכבות של תאי גידול או על חלבוני מטריצה חוץ-תאיים. בדיקה במיקרוסקופ אור ופלואורסצנטי מאפשרת התבוננות בניידות התא ובתפקוד הציטוטוקסי.

Abstract

אנו מדווחים הסתגלות רומן של assay נדידת תאי מחוגי חד שכבתי, שפורסם לראשונה למדוד את הגירת רדיאלי של תאים סרטניים חסיד על חלבוני מטריצת חוץ תאיים, למדידת תנועתיות של תאי מערכת חיסון שכותרתו fluorescently, אדם שאינו חסיד או מפעיל עכברי. טכניקה זו מעסיקה סעפת נירוסטה ולהחליק טפלון 10 היטב להפקיד focally תאי T שאינם חסיד לתוך הבארות מוכנות עם שני monolayers תאים סרטניים ומחוברות או חלבוני מטריקס. מיקרוסקופ פלואורסצנטי אור ו / או רב-ערוצית משמש כדי לעקוב אחר התנועה וההתנהגות של תאי מפעיל לאורך זמן. צבעי ניאון ו / או וקטורים ויראליים שהקוד לtransgenes ניאון משמש תווית באופן דיפרנציאלי סוגי התאים להדמיה. שיטה זו שונה מדומה מסוג במבחני חוץ גופית העוקבים אחר הגירה / פלישה אופקית או אנכית ניצול תאי שקופיות, אגר או transwell צלחות. Assay מאפשר הדמיה נתונים מפורטים לbדואר שנאסף עם סוגי תאים שונים נבדלים בסמני ניאון ספציפיים; אפילו תת-אוכלוסיות ספציפיות של תאים (כלומר, transduced / nontransduced) יכולות להיות במעקב. מגרשי הקרינה בעוצמה משטח נוצרים באמצעות ערוצי הקרינה ספציפיים שמתאימים לסוג התא הנודד. זה מאפשר להדמיה טובה יותר של ניידות תא החיסון שאינו חסיד בזמנים מסוימים. ניתן לאסוף ראיות של פונקציות תא מפעיל אחרות, כגון cytotoxicity או העברה של וקטורים ויראליים ממפעיל למקד תאים, כמו גם. לכן, השיטה מאפשרת לחוקרים לתעד מיקרוסקופיים אינטראקציות תא אל התא של דיפרנציאלי שכותרתו, שאינו חסיד עם תאים חסיד מסוגים שונים. מידע זה עשוי להיות רלוונטי במיוחד בהערכת סוגים ביולוגי מניפולציות או הופעלו תאים חיסוניים, שבו הוכחה ויזואלית של פונקציונליות רצויה עם תאי מטרה סרטנית לפני השימוש בם לטיפול בסרטן.

Introduction

Assay נדידת תאי מחוגי חד שכבתי פותח במקור כדי למדוד את תכונות infiltrative של תאים סרטניים חסיד ^1-4 בשקופיות מצופות במטריצה ​​תאית חלבונים (ECM) ^5-7 או עם רכיבי ECM בודדים, כגון פיברונקטין או laminin ^1,2. הטכניקה מעורבת זריעת השעיה תא בודדת של תאים סרטניים במרכז בארות באמצעות סעפת נירוסטה שקיעת תא (CSM). לאחר שקיעה, התאים הסרטניים היו לדבוק בתחתית הבאר והשינוי בקוטר של אוכלוסיית התא הראשונית לאורך הזמן שימש להקמת שיעור של תנועתיות אופקית. Assay נדידת תאי מחוגי חד שכבתי סיפק יתרון חזותי על פני שיטות קיימות אחרות שהעסיקו transwell צלחות לassay יכולות נדידה במבחנה של תאים; מבחני אלה אינם תורמים להדמיה ^8. וכן, זה גם סיפק כמות גדולה של חופש בבחירת timepointזה כאשר הגירה נבחנת, ללא הגבלה על מספר הנקודות זמן חוקר יכול לבחור תמונה לאחר שקיעה.

בגלל היכולת להעביר היא פונקציונלי חשובה לתאים שאינם חסיד, במיוחד בתחום של טיפול חיסוני או שבו הם יכולים לשמש ככלי רכב משלוח לוקטורים ויראליים, התאמנו השימוש בCSM להעריך את ההגירה של תאים שאינם חסיד סוגים על משטחי תאים סרטניים, בנוסף לחלבוני ECM. יתרון הנוסף של מיקרוסקופי לדמיין את הנדידה של תאים שאינם חסיד בmonolayers תאים סרטניים קיימא, על ECM המורכב מבודד מהגידול, או על רכיבי ECM פרט הופך assay זה צדדי. מבחני שמעסיקים בארות מצופים בחלבון תאי יחיד אינם משקפים במדויק את מצע רקמת ECM או גידול התאים היו להעביר דרך in vivo.

כאן, אנו משמשים alloreactive לימפוציטים ציטוטוקסיות T (alloCTL), רגיש לhistocomp הגדולחלבונים מורכבים atibility (MHC) באמצעות תגובות תאים הסרטניים מעורבים הלימפוציטים בכיוון אחד (MLTR) או תגובות מעורבות הלימפוציטים (הקה"ע) ^9, כסוג התא שלנו נציג שאינו חסיד. בדקנו תאים של שני מוצא האדם והעכברי. כאשר הגירה נמדדה על משטחי גידול, תאי הגידול המועסקים היו מטרות או רלוונטיות באופן חלקי, בו מוצגות חלק מאותם החלבונים MHC מצאו על אוכלוסיית התאים המשמשת לרגישות effectors, או מטרות רלוונטיות באופן מלא, עם סט מלא של מולקולות MHC ש effectors היה רגיש כלפי. בחלק מהניסויים, שנהגנו CellTracker הניאון האדום CMPTX או צבע התפשטות תאי eFluor 670 להבחין בין תאי מפעיל והיעד. כמו כן נעשה שימוש התמרה עם קידוד וקטורים ויראליים לחלבוני ניאון כדרך נוספת כדי להמחיש את התאים. עבור מבחני מסוימים, אנחנו transduced alloCTL עם וקטורי retroviral המשכפלים (RRV) קידוד לאמרלד גרין (EMD) חלבון פלואורסצנטי ^10,11; לothers, תאים סרטניים היו transduced עם וקטורי lentiviral הקידוד לmStrawberry.

AlloCTL היה זרע דרך ערוץ של הסעפת למרכז או monolayers גידול תא או ECM נקטף מן monolayers תאים סרטניים. אינטראקציות תא חסיד ולא חסיד היו דמיינו ידי אור ו / או על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי לאורך זמן. תאי הפרעה בשכבת התאים הסרטניים בצריכת חשמל נמוך, או גידול עם גרעינים מקוטעים בהספק גבוה היו אינדיקטורים של פגיעה בתא על ידי תמוגה ואפופטוזיס, בהתאמה. אנו דיגיטליים יצרנו מפות ניאון עוצמת המשטח מראים את הנדידה של תאי T fluorescing לא חסיד על תרבויות monolayer. אנחנו גם ציינו cytotoxicity הולידה לmonolayer תא גליומה חסיד לאחר היווצרות אשכול alloCTL לא חסיד שמעליו. כמו כן, התמרה אופקית של RRV-EMD מalloCTL לmonolayer גליומה נצפתה.

Protocol

1. החלק הכנה

1. הכנס שקופיות סעפת שקיעה סלולארי לשקיות עיקור וחותם עם קלטת החיטוי. להתמודד עם הצד מצופה טפלון של שקופית נייר בצד של הנרתיק כדי למנוע פיקדונות פלסטיק על הבארות.
2. שקיות החיטוי במשך 15 דקות ב 121 מעלות צלזיוס.
3. הסר שקופיות מכיס עיקור בתוך ארון בטיחות ביולוגי ומקום בצלחת פטרי סטרילית סטרילי 150 x 15 מ"מ. עד ארבע שקופיות יכולה להתאים לכל צלחת. מניחים צלחת פטרי 35 x 10 מ"מ בסמוך לשקופיות. להוסיף 2-3 מיליליטר של H ₂ O סטרילי כדי לספק לחלוח.
4. שקופיות טרום מעיל עם פולי-D ליזין ב 100 מיקרוגרם / מיליליטר באמצעות נפח מספיק כדי לכסות את כל היטב. לאחר שעה אחת בRT, לשאוב את הפתרון ולשטוף את פני השטח של באר פעמיים על ידי pipetting 1x PBS על פני השטח של הבארות.
5. לחלופין, להוסיף פיברונקטין או רכיבי ECM אחרים, כדי להבטיח עמידה בתאים סרטניים חזקות. להוסיף פיברונקטין בשעה 5 מיקרוגרם / מיליליטר בנפח מספיק that הבארות יהיו לא יבש בתוך פרק זמן קצר בRT.
   1. אחרי שעה 1, לשאוב את פתרון השאריות ולשטוף פעמיים על ידי pipetting מעלה ומטה עם 1x PBS.
6. שמור PBS על הבארות עד הגידול מוכן לציפוי. שימוש מחליק באותו היום.
7. קציר בקבוק ומחוברות מסוג התאים סרטניים חסיד הרצוי. ספירת תאי קיימא באמצעות הדרת צבע Trypan הכחולה על ידי מיקרוסקופ וresuspend אור ב 5 x 10 ⁶ תאים / מיליליטר בדוגמא בינונית לצמיחה נאותה נאגרה, בינוני של Dulbecco המינימלי החיוני (DMEM) עם 10% בסרום שור עוברי (FBS), L- גלוטמין ופירובט נתרן.
8. אם הדמיה ניאון של אוכלוסיית התאים חסיד היא רצויה, לתייג אוכלוסיית תאים חסיד עם פלורסנט לצבוע חיוני או צבע התפשטות תאים על ידי ביצוע הפרוטוקולים מסופקים על ידי היצרן.
9. בצורה חלקה פיפטה 10 μl של מדיום שלם לבאר כל טיפול השקופיות לוקחים כדי למנוע יצירת בועות בwells, כמו אלה יכולים למנוע דבקות של תאי גידול אחיד.
10. להוסיף 2.5-5.0 x 10 ⁴ תאים (5-10 μl של השעיה תא) למדיום בכל טוב (איור 1 א). התאם את המספר האופטימלי בהתאם לסוג התאים סרטני ואת מספר הימים של צמיחה הרצויה. תאי גידול גדולים יותר או תאים גדלו במהירות עשויים לדרוש פחות תאים בתחילה. להביא גם נפח של עד 40 μl על ידי הוספה בינונית ופיפטה מעלה ומטה כדי להבטיח חלוקה שווה של תאים.
11. אחרי הכל הבארות הם זורעים, לאפשר לתאים הסרטניים לדבוק בRT, ואז למקם את המכסה על צלחת פטרי 150 x 15 מ"מ ובזהירות להעביר את הצלחת לחממת humidified CO / 5% 37 ° C ₂ לפחות 24 שעות.
12. לשנות את מדיום התרבות יומי. זהירות פיפטה חלק של המדיום בילה מmonolayer ולהחליף עם מדיום מלא טרי.
    הערה: בגלל ההתאדות, יותר נפח תצטרך להוסיף יותר מהוצא. ולס יהיה מוכן לassay כאשר אפילו, conflהשכבה של תאי uent היא הווה. זה בדרך כלל 1-3 ימים לאחר זריעה ראשונית.
13. לשטוף בעדינות monolayer פעם עם PBS כמתואר בשלב 1.4 וגם המשך לשלב 2 אם monolayers הוא רצויים, או לשלב 1.13 להלן כדי לחלץ חלבוני ECM מהשכבה.
14. הפוך 0.5% Triton-X (v / v) פתרון בינוני מלא ולהוסיף 30 μl היטב כל אחד. בואו monolayer לעכל במכסת מנוע למשך 2 דקות, ולאחר מכן לשטוף פעמיים עם מדיום שלם על ידי pipetting כפי שתואר לעיל.
    הערה: שכבת ECM יכולה להיות גלויה על ידי מיקרוסקופ אור (איור 2). השתמש בשקופיות מייד, או לשמור במדיום מלא בCO ₂ באינקובטור humidified במשך 1-2 ימים. אל תאפשר בארות להתייבש.

2. שקיעה של תאי T שאינם חסיד על שקופיות

1. אם הדמיה ניאון של אוכלוסיית תאים שאינם חסיד היא רצויה, לתייג אוכלוסיות שאינן חסיד תא עם צבע פלואורסצנטי חיוני, כגון CFSE, Cell Tracker האדום CMPTX, או eFluor670 על ידי ביצוע הפרוטוקולים מסופקים על ידי יצרן השעה לפחות 1 מראש של assay. לחלופין, לתפעל תאים לבטא חלבוני ניאון המקודדים על ידי וקטורים ויראליים.
2. החיטוי סעפת שקיעת תא בכיס החיטוי כמתואר ב1.2 לעיל.
3. הסר את תא humidified המכיל שקופיות מצופים טפלון מן החממה והמקום בארון בטיחות ביולוגית.
4. לשטוף בארות עם 1x PBS על ידי pipetting מעלה ומטה, ולאחר מכן להוסיף 45 μl של מדיום שלם המכיל לפחות 10% בסרום.
5. הסר את הסעפת ממעטפת העיקור ולהחליק בזהירות בלמעלה מ הבארות עד 'הוו' בסוף הסעפת נוגע התחתון של השקופית (איור 1).
6. ודא שמדיום התרבות גלוי בכל אחד מהערוצים. אם אף נראה, תוריד את הסעפת ולהוסיף עוד מדיום למתאים היטב, ולאחר מכן להחליף ולבדוק שוב.
7. חזור על שלב 2.5 עבור כל channel של הסעפת, או לבארות רבות ככל רצוי.
8. ספירת תאים וגלול שאינם חסיד בלא פחות מ 1.0-2.0 x 10 ⁵ / μl. צייר את 1 μl של תאים ולאט לאט פיפטה אותם לערוץ (איור 1 ג). לעשות את זה עבור כל רצוי גם.
9. השאר את כל מנגנון התא טעון, כלומר, סעפת ושקופיות, בתוך מכסה המנוע ביו-20-30 דקות, כדי לאפשר את התאים בערוץ להתיישב.
10. הסר את הסעפת על ידי הנגיעה בשני הקצוות ובעדינות להרים אותו ישר מהשקופית כדי לא להפריע לתאים שנזרעו focally במרכז הבארות (1D איור).
11. בדוק היטב כל אחד כדי להבטיח שאינם חסיד התאים כבר זורעים בהצלחה במרכז גם להישאר בתוך ההיקף של ערוץ הסעפת. אינם חסיד התאים יהיו באופן אידיאלי מעט לדבוק monolayer או ECM וזה לזה, ולכן בעדינות נעו סביב השקופיות לא יגרמו Pelle התאt להתפזר. לא להדחף השקופיות.

3. מיקרוסקופ פלואורסצנטי

1. עם ציוד מתאים ניסיוני, לבצע ההדמיה לאחר שקיעה הוא אישר. באופן אידיאלי, להשתמש במיקרוסקופ המצויד בתא CO ₂ ולחות. תמונה בצריכת חשמל נמוך, כלומר, 4X או 10X, כדי לאפשר למספר רב של תמונות שיש לנקוט משטח גדול יותר, כך שהשלמות של הבאר ניתן לראות.
2. לרכוש תמונות דיגיטליות באמצעות תוכנה ללכידה תמונה. בצע brightfield ו / או הדמיה הקרינה רבת-ערוצית.
3. אם תרצה, להגדיר זמן לשגות להקליט תמונות בערוצים שונים על פני שטח נתון, או לשמור את שקופיות humidified וב/ 5% חממת 37 ° C CO ₂ וידניות להוציא לתמונה בנקודות הזמן הרצויה (איור 1E & F, מומלץ לנקודות זמן ארוכות יותר).

4. ניתוח ותצוגה

1. שימוש בתוכנת עריכת תמונות, למזג אור וflתמונות uorescent לסוגי תאי שכבה אחת כל כך מרובים וסמנים שניתן לראות באותה התמונה. גרור ושחרר את קבצי תמונה לכל צבע פרט לתכנית ו, כאשר תתבקשו לעשות זאת, בחר באפשרות "הוסף Layer 'כדי ליצור קובץ תמונה עם מספר שכבות.
   1. בהגדלה גבוהה יותר, לקחת, ליישר, ולתפור תמונות ברחבי גם באופן דיגיטלי. יישר קבצים ע"י הסתכלות באזורים שמורים בין שתי תמונות וכיסו תמונה אחת על גבי השני עד תמונה שלמה נוצרה.
2. להוסיף ברים מיקרון לתמונות במהלך רכישה באמצעות התוכנה ללכידה כדי לקבוע מרחק תאים בודדים היגרו.
3. כדי לקבוע את נדידת התאים בזמנים שונים, להפוך את מפות הקרינה בעוצמה משטח עם תוכנת תמונה, כלומר, ImageJ, לכמת צבירת תא T ניאון או משתרעים על פני זמן.
   1. כדי ליצור חלקות פני השטח, לקחת תמונה שכבתית שנוצרה בשלב 4.1 ומתחת לחלון השכבות,בטל את סימון כל השכבות מלבד אלה המקביל לערוץ הרצוי. לדוגמא, אם עלילת משטח רצויה לדמיין ביטוי EMD, רק השכבות "הירוקות" המתאימות למסנן המשמש לסמן זה צריכה להיות גלויות.
   2. לשטח את התמונה ולשמור אותו בפורמט קובץ המוכר (לדוגמא, png) ולטעון את התמונה לתכנית. על מנת ליצור את עלילת המשטח, לשנות את סוג התמונה ל8-bit, לשנות את הבהירות / ניגודיות לפי צורך כדי להפחית את הרקע, ובחר באפשרות 'לנתח מגרש / שטח'. התמונות באיור 5 נוצרו על ידי בדיקת 'הצל', 'צייר ציר "," אחת מצולע לקו', ותיבות סימון 'Smooth ".
   3. לחלופין, לקחת מדידות באמצעות הרדיוס או קוטר מהפקדת תא המוקד בזמן אפס ולהשוות לתאים בנקודה המרוחקת ביותר בזמנים שונים. הקוטר של בארות הטפלון הוא 6.0 מ"מ.

Results

וקטורים ויראליים קידוד לחלבוני ניאון יכולים לשמש בנוסף ל, או במקום, צבע ניאון. התמרה ויראלית צריכה להתבצע מראש של assay תנועתיות. שני סוגים חסיד ולא חסיד תא יכולים להיות דיפרנציאלי שכותרתו. הפרוטוקול עבור התמרה יהיה תלוי בסוג של וקטור המועסק. כאן, אנו transduced alloCTL באיורים 3, 5 ו -6 עם RRV-EMD לפחות יומיים מראש של assay באמצעות הפרוטוקול מתואר ^12. כמו כן השתמשנו וקטור lentiviral, CMV-התות-IRES-FLUC2, לtransduce תאים הסרטניים להביע ...

Discussion

תאי גידול בהשעית תא בודד היו pipetted לתוך הבארות של שקופיות-רעול פנים טפלון. התאים הורשו לדבוק ולאחר מכן יצרו monolayers בhumidified 5% CO _2, 37 ° C חממה (איור 1 א). monolayers הוקם או חלבוני ECM נגזר מmonolayer יכול להיות שנקטפו למבחנים אלה (איור 1). לימפוציטים מסוג T מפעיל שכותרתו עם צבעי ניאון חיוניים או transduced עם וקטורי קידוד עבור EMD היו זרע למרכז גם באמצעות CSM. היכולת של לימפוציטים מסוג T מפעיל שאינו חסיד להעביר על חלבוני mo...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
שקופיות מיקרוסקופ מסיכות טפלון	שיטות מדעיות יצירתיות	CSM002
סעפת שקיעת תאים	שיטות מדעיות יצירתיות	CSM001
פטרי 430597			קורנינג 150 מ"מ
, 35 מ"מ	קורנינג	430588
מי מלח חוצץ פוספט (PBS)	Mediatech	21-040
20 μ l פיפטמן	גילסון	F123600
200 μ l פיפטמן	גילסון	F123601
200 μ l קצות פיפטה	VWR	89003-060
מים מזוקקים, דה-יונים (סטריליים)	Mediatech	25-055
Trypsin	Mediatech	25-054-CL
Celltracker אדום CMPTX	Invitrogen	C34552
TrypLE Express (אופציונלי)	Gibco	12604
מדיה לתרבית תאי גידול (למשל DMEM)	Mediatech	10-013
AIM-V מדיה ללא סרום	Invitrogen	12055-083
סרום בקר עוברי	אומגה מדעי	FB-02
מיקרוסקופ
		אבחון	מתקדמים
פולי-D-ליזין	Millipore	A-003-E
פיברונקטין	BD	354008
31/2 x 51/4 שקיות חיטוי	Crosstex	SCXS2
Trypan Blue	Mediatech	25-900-CI
התפשטות תאים eFluor 670	eBioscience	65-0840-85
ImageJ	NIH