הערכה מקיפה של תאי מין כימי רעילות שימוש נמטודות<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

סיכום

אנו מתארים את השלבים המפורטים של בדיקה כימית בעלת תפוקה גבוהה בנמטודה Caenorhabditis elegans המשמשת להערכת רעילות קו הנבט. בבדיקה זו, הפרעה בתפקוד קו הנבט בעקבות חשיפה לכימיקלים מנוטרת באמצעות מדווח פלואורסצנטי ספציפי לעוברים אנופלואידים.

תקציר

זיהוי רעיל הרבייה של אלפי כימיקלים הנמצאים בסביבה שלנו היה אחד האתגרים המפתים ביותר בתחום בריאות והסביבה. זה נובע בחלקו המיעוט של מערכות מודל ש( 1) יכול במדויק לשחזר תכונות מפתחות של תהליכי רבייה ו( 2) לעשות זאת בצורה בינונית עד תפוקה גבוהה, ללא הצורך במספר גבוה של בעלי חיים בעלי חוליות.

אנו מתארים כאן assay בג נמטודות elegans המאפשר זיהוי המהיר של רעלים בתאי מין על ידי ניטור האינדוקציה של עוברי aneuploid. על ידי עשיית שימוש של קו כתב GFP, טעויות בהפרדת כרומוזום הנובעת מהפרעה בתאי מין הם דמיינו בקלות ולכמת על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי האוטומטי. כך ההקרנה של מערכת מסוימת של תרכובות לרעילותו יכולה להתבצע בפורמט צלחת 96 384 היטב בעניין של ימים. ניתוח משני של h החיובישלה ניתן לבצע כדי לקבוע אם מומי כרומוזום מקורו מהפרעת meiotic או מטעויות הפרדה כרומוזום עוברית מוקדמות. בסך הכל, assay זה מייצג אסטרטגיה הראשונה לעבור מהר להערכה המהירה של בעיות בתפקוד תאי מין בעקבות חשיפה כימית.

מבוא

ישנם כ 87,000 כימיקלים רשומים למסחר בארצות הברית, אך רק מספר קטן של אלה נבדקו להשפעות בריאותיות פוטנציאליות ^1. מבין אלה שנבדקו, רק חלק כבר העריך להשפעות פוריות נובעות בחלקו הקושי בקביעת שינוי באירועי הרבייה המוקדמים ביונקים, במיוחד בפיתוח תאי נבט נשי ובידול. ואכן, אירועי meiotic הראשונים יתקיימו במהלך המוקדמים של התפתחות עוברית ביונקי נקבת השלבים ולכן קשים לגישה וללאסוף במספרים מתאימים למטרות הקרנה.

Germline מספקת קישור החיוני בין דורות, והפונקציה המתאימה תלויה בביצוע המדויק של התכנית המורכבת של חטיבת הסלולר וכרומוזומליות מכונה מיוזה. אי סדיר של תהליך meiotic עלול לגרום לירידה בפוריות והייצור שלתאי מין ועוברים עם מספר לא תקין של כרומוזומים, מצב המכונים aneuploidy. טעויות הפרדה כרומוזום במיוזה רלוונטיות מאוד לבריאות אדם. חריגות כרומוזום נפוצות, בתדירות של 1 ל 150 לידות חיות, 21 טריזומיה, 18 ו -13, כמו גם טעויות כרומוזום X ו- Y להיות הסוגים הנפוצים ביותר ^2,3. יתר על כן, מומים מולדים, כוללים אלה של מקורות כרומוזומליות, הם הגורם המוביל למוות תינוק בארה"ב ⁴ הרעיון שהשפעות סביבתיות יכולות להשפיע על הפרדה והתנהגות כרומוזומלית הוא לא חדש ^5, אבל עדיין הבין היטב. לכן זה חיוני כדי לחקור מי מהכימיקלים מוחדרים הסביבה שלנו מפריעים לפוריות אדם, התפתחות מוקדמת ופוריות כוללת.

לאור המגבלות של המודלים של יונקים אלה, פיתחנו assay מסך תפוקה גבוהה כדי לבדוק רעילות רבייה בתולעת העגולה C. elegans. יש לנו התגייס כמה תכונות חשובות המוצעות על ידי מערכת מודל גנטית זה נפוץ כגון גודלה הקטן, בעלות נמוכה, מחזור רבייה קצר, שיעור גבוה של תאי נבט וקלות מניפולציה ^6. ניתן לגדל תולעים ב96-גם צלחות או בתרבויות נוזל בנפח גבוהות ובגלל השקיפות שלהם ניתן הדמיה ישירות על צלחות לגילוי של כתבי ניאון. Assay המתואר להלן מנצל מאפיינים אלה ומנצל את מתח תולעת המכיל את כתב ניאון GFP Pxol-1 :: לזהות הפרעה ואינדוקציה של aneuploidy העוברי בתאי מין.

השימוש במתח הכתב הזה מבוסס על ההתרחשות בדרך כלל נדירה של זכרים באוכלוסיית תולעת בעיקר מינית. גברים אלה (<0.2%) נובעים באופן טבעי משגיאה בהפרדה של כרומוזום X ^7. עם זאת, כהפרעה בתאי מין בתדירות גבוהה גורם לשגיאות בהפרדה של autosomesושל heterochromosomes, והוא מתואם גם עם שכיחות גבוהה של פנוטיפ גברים (missegregation X) כמו גם קטלנית עוברי (missegregation אוטוזום). כדי לזהות בקלות האינדוקציה של גברים תוך עקיפת הבעיה של הקטלניות עובריים, אמרגן זכר ספציפי (xol-1) משמש לנהוג ביטוי של ה- GFP בעוברים מוקדמים הכילו עדיין בתוך הרחם של התולעת. ככזה, את המראה של עוברים להביע GFP משמש כמדד לנוכחות של עוברי aneuploid. שיטה זו שימשה בעבר לזיהוי גנים מעורבים בתחזוקה בתאי מין ^ו8,9 מיוזה. מותאם להקרנה כימית, זן זה הוא מועסק במדיום למסך תפוקה גבוהה. חשוב לציין, את המתח בנאמנות מדווח aneugenicity של כימיקלים ולכן הוא רלוונטי לנקודתי קצה רבייה של יונקים ^10. Assay שתואר כאן יהיה שימושי במיוחד לtoxicologists בהגדרות תרופות ותעשייה כימית מחפשכדי להעריך במהירות את הרעילות של כימיקלים לנקודתי קצה רבייה. יתר על כן, assay זה מיישר באופן מלא עם סדרי העדיפויות הממשלתיות המודגשים ברעילות בדו"ח המאה ה ^{-21 11.}

פרוטוקול

1. הכנה של חיידקים האכלה

הערה: סעיף זה מתאר את ההכנה של חיידקי האכלה (OP50 זן E. coli).

1. לבודד מושבה אחת של E. OP50 זן coli ממרק lysogeny (LB) צלחת אגר וסביבה נקיה מחיידקים לחסן לתוך 300 מיליליטר של מרק LB autoclaved.
2. לאפשר לתרבות מחוסנת לגדול לילה שייקרה ב 200 סל"ד ו -37 מעלות צלזיוס, עד שהגיעה לרוויה.
3. העבר את OP50 לתוך 6 צינורות סטרילי,-שקלו מראש 50 מיליליטר חרוטי. גלולה החיידקים על ידי צנטריפוגה 5 דקות ב6,000 סל"ד (XG 5000).
4. בטל supernatant ולשטוף את החיידקים עם 50 מיליליטר של M9 סטרילי. חזור פעמיים.
5. לאחר לשטוף את השני להסיר M9 שנותר, להבטיח שלא M9 נשאר בצינור.
6. לקבוע את המשקל של גלולה ידי שקילת הצינור המכיל את גלולה החיידקים ולהפחית את המשקל של צינור חרוטי 50 מיליליטר.
7. Resuspend i גלולהn M9 בריכוז של 100 מ"ג / מיליליטר.
8. אחסן את פתרון OP50 ב 4 מעלות צלזיוס עד שהוא משמש לתרבות התולעת.

2. הכנת בינונית צלחות (NGM) פטרי נמטודות צמיחה

הערה: סעיף זה מתאר את הכנת צלחות פטרי NGM, המהוות את הצלחות שבו ג תולעי elegans נשמרים באופן שיגרתי במעבדה.

1. החיטוי הבינוני אגר NGM.
2. באמצעות נהלי סטרילי, לוותר 17 מיליליטר של תמיסה אגר NGM לתוך 6 סנטימטר צלחות פטרי באמצעות משאבת peristaltic.
   הערה: סכום קבוע של אגר בצלחות מפחית את הצורך במיקוד מחדש של מיקרוסקופ בעת מעבר מצלחת אחד למשנהו.
3. השאר את הצלחות בטמפרטורת חדר למשך 2-3 ימים לפני השימוש כדי לתת אגר לחזק ולאפשר עודף הלחות להתאדות.
4. זרע צלחות NGM באמצעות טכניקה סטרילית. החל 1-2 טיפות של נוזל תרבות OP50 ולהפיץ באמצעות מוט זכוכית. הקפד לאכדי להפיץ את דשא חיידקים כל הדרך עד לקצוות של הצלחות.
5. לאפשר לדשא OP50 לגדול במשך 1-2 ימים בטמפרטורת חדר לפני השימוש בצלחות לגדול תולעים.

3. הכנת אוכלוסיית תולעת סינכרוני

הערה: מחזור החיים של ג elegans מורכב מהשלב העוברי, ארבעה שלבי זחל (L1-L4) ובבגרות. סעיף זה מתאר את ההכנה של אוכלוסייה בגיל-סינכרוני של תולעים. כל החומרים הבאים במגע עם C.elegans לאחר טיפול אקונומיקה חייבים להיות סטרילי.

1. יום 1 - הכנת אוכלוסיית תולעת ההרה להולדת
   1. להשתמש בצלחות NGM שברוב אוכלוסיית התולעת מורכבת מזחלי L1 מורעבים.
   2. לאסוף את זחלי L1 עם תולעת מעוקרת לאסוף ולהעבירם ל6 צלחות NGM סנטימטר טריות זרע עם OP50. דגירה של כ -65 שעות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס עד שרוב התולעים הם מבוגרים הרה להולדת. ללהימנע מצפיפות יתר צלחת ולאפשר לגדול התולעים ללא מדלדל את החיידקים, לא להעביר אשכולות יותר מאחד או שניים של זחלי L1 לכל צלחת NGM טרי.
2. יום 4 - הקמת המסונכרנת L1 זחלי אוכלוסייה
   1. לאסוף את התולעים הרה להולדת מצלחות NGM על ידי שטיפתם עם 1-2 מיליליטר של M9 ולהעביר אותם לצינור 15 מיליליטר חרוטי.
   2. בואו תולעים הרה להולדת משקעים התחתון של צינור חרוטי 15 מיליליטר במשך כ 5-10 דקות. הסר את supernatant מבלי להפריע גלולה התולעת.
   3. העבר את כדור תולעת 2-4 צינורות microcentrifuge ולהוסיף 1 מיליליטר של אקונומיקה / פתרון NaOH. דגירה של 2-3 דקות ב RT. מעקב אחר ההתקדמות של התגובה תחת סטראו כדי לאשר את כל התולעים מתים. לא להלבין יותר מ 5 דקות כעוברים יכולים למות.
   4. לאסוף את התולעים על ידי צנטריפוגה 1 דקות ב3,000 סל"ד (900 XG). הסר את supernatant ולהוסיף 1 מיליליטר של M9 סטרילי ללנטרל את התגובה.
   5. לשטוף את התולעים פעמיים על ידי צנטריפוגה 1 דקות ב3,000 סל"ד (900 XG).
   6. הסר את supernatant ולהוסיף M9 לעד 100-200 μl.
   7. בעזרת פיפטה פסטר זכוכית להוסיף טיפה של התולעת / M9 לערבב כדי לנקות צלחות NGM ומדגיר אותן לפחות 24 שעות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס, כדי לאפשר את העוברים ללבקוע.
      הערה: ללא מזון הצמיחה של הזחלים תיעצר בשלב L1.
3. יום 5 - הקמת המסונכרנת L4 זחלי אוכלוסייה
   1. לאסוף את זחלי L1 מצלחות NGM ברורות על ידי שטיפת הצלחות עם 1-2 מיליליטר של M9 ולהעביר אותם לצינור 15 מיליליטר חרוטי.
   2. בואו משקעי תולעים בוגרות המתים לחלק התחתון של צינור חרוטי 15 מיליליטר במשך כ 5 דקות.
   3. אסוף את supernatant, שבו תולעי L1 הם, בצינור 15 מיליליטר חרוטי חדש, ולזרז את התולעים על ידי centrifuging 2 דקות ב2,600 סל"ד (1,000 XG).
   4. הסר את supernatant leaving כ -500 μl.
   5. קבע את הריכוז של תולעים פתרון M9 על ידי ספירת המספר של תולעים 10 טיפות μl באמצעות סטראו. לספור לפחות 5 טיפות.
   6. התאם את הריכוז של התולעים 20-25 תולעים / μl ולהוסיף 50 μl של התולעת / תערובת M9 לצלחות NGM זרע עם OP50.
   7. דגירה של 65 שעות ב 15 ° C (לדגירה דרך סוף השבוע) כדי לאפשר לאוכלוסייה המסונכרנת L1 לגדול עד שהם מגיעים לשלב L4.

4. חשיפה של תולעים לכימיקלים ב96-פלטות היטב

הערה: סעיף זה מתאר את השימוש בPxol1 :: כתב תעתיק GFP מכיל ג זן elegans למסך לאינדוקציה של aneuploidy.

1. לאסוף את זחלי L4 מצלחות NGM ברורות על ידי שטיפת הצלחות עם 1-2 מיליליטר של M9 ולהעביר אותם לצינור 15 מיליליטר חרוטי.
2. בואו משקעי תולעי L4 לתחתיתצינור חרוטי 15 מיליליטר במשך כ 5-10 דקות. הסר את supernatant מבלי להפריע גלולה התולעת.
3. להוסיף 3-5 מיליליטר של M9 ולקבוע את הריכוז של תולעים פתרון M9 על ידי ספירת המספר של תולעים 10 טיפות μl באמצעות סטראו. לספור לפחות 5 טיפות עבור כל דגימה.
4. Resuspend התולעים בריכוז של 1000 / מיליליטר תולעים בM9.
5. לדלל את חיידקי OP50 מסעיף 1 פי 10 עם M9. ודא חיידקי resuspended להגיע לטמפרטורת חדר, כי טמפרטורה נמוכה משפיעה על התפתחות תולעת.
6. בעזרת פיפטה רבה, להוסיף ראשון של התולעת / תערובת M9 (משלב 4.4) 100 μl ולאחר מכן להוסיף 400 μl של חיידקי OP50 המדולל (משלב 4.5) היטב בכל סיבוב עמוק 2 מיליליטר צלחת 96-היטב תחתונה. בסוף, כל אחד גם תהיה לי ב 500 μl 100 תולעים.
7. הוסף 0.5 μl של שתי כימי בדיקה או בקרה הנאותה לבארות הרצויות, כדי להשיג concentr סופי הציעation של 100 מיקרומטר, ריכוז נפוץ במסכים כימיים בג elegans ^12. לחשוף אתנול או בקרות ממס DMSO בריכוז סופי של 0.1%.
   הערה: אנו ממליצים על השימוש בnocodazole (100 מיקרומטר) כביקורת חיובית.
8. חותם את הצלחת באמצעות סרט דבק. הקפד לאטום את הצלחת גם על מנת למנוע זיהום צולב בין בארות.
9. לעטוף את הצלחת עם נייר אלומיניום.
10. העבר את הצלחת שלייקרה (170-180 סל"ד) של הטמפרטורה המתאימה לכל האורך המתאים של זמן (24 או 65 שעות). הטמפרטורה של החדר משפיעה על הצמיחה של התולעים; לשמור על הטמפרטורה סביב 20 מעלות צלזיוס.

רכישת 5. תמונה של תולעים הרה להולדת בצלחת 384 גם

הערה: סעיף זה מתאר את השימוש במיקרוסקופ תוכן גבוה לתמונת Pxol1 נחשף :: תולעי GFP, כדי להמחיש את הביטוי של ה- GFP בעוברים ברחם של הרמפרודיטים מבוגרים. לכל צלחת 384 גם להיות מוקרנת, להשתמש תולעים מצלחות 4 x 96 היטב.

1. לאחר חשיפה לכימיקלים שבייקרו, בואו שאר צלחת 96-היטב במשך 10-15 דקות, כדי לאפשר התולעים בוגרות למשקעים בתחתית הצלחת.
2. בעזרת פיפטה רבה, להסיר 350 μl של M9, להיות זהירים מאוד שלא להפריע את התולעים בתחתית הצלחת.
3. לשטוף את התולעים עם 1 מיליליטר של M9 וחזרו על שלב 5.1.
4. בעזרת פיפטה רבה, להסיר 1 מיליליטר של M9, להיות ואבוי נזהר לא להפריע את התולעים בתחתית הצלחת.
5. בעזרת פיפטה רבה, resuspend התולעים בM9 שנותר ולאסוף של התולעת / התערובת M9 100 μl מ96-גם הצלחות ולטעון אותו לתוך הבארות של קירות שחורים / צלחת 384 גם תחתונה ברורה. חזור על התהליך באמצעות תולעים מצלחות 4 x 96-היטב, עד שכל הבארות של הצלחת 384 גם הוטענו.
   הערה: חשוב לכל הבארות יש את אותו נפח כדי להגדיליעילות ומהירות של פוקוס אוטומטי במהלך תהליך רכישת תמונה. כל טוב צריך להכיל בין 80 ל -100 תולעים.
6. הוסף 1 μl של levamisole (100 מיקרומטר) זה טוב ולתת את תולעי דגירה של כ 30 דקות.
   הערה: levamisole פועל כאגוניסט קולטן האצטילכולין ומשתק את התולעים.
7. העבר את הצלחת למיקרוסקופ תוכן הגבוה widefield מסוגל לספק הדמיה אוטומטית.
8. לרכישת תמונה, השתמש בתוכנת רכישת תמונה וניתוח תוכן גבוהה פי ההנחיות של היצרן. בחר את מטרת 4X לרכוש תמונה 1 בכל טוב.
9. לפני שתתחיל ברכישת התמונה, להתאים את הפרמטרים ההדמיה GFP עד 45 אלפיות השניים של חשיפה ורזולוציה של תמונה ל -2160 x 2,160.
10. לאסוף נתונים כמו מספר התולעים החיוביים GFP מחולקים במספר הכולל של תולעים בבאר, המדד האחרון להיות עקבי יחסית בין בארות.

תוצאות

חשיפה של זן הכתב :: GFP Pxol-1 לחומרים כימיים כגון רעל microtubule Nocodazole (איור 1) מובילה לאינדוקציה של שיעור גבוה של עוברים להביע GFP ברחם של הרמפרודיטים מבוגרים חשופים בהשוואה לשליטת DMSO. עוברי GFP החיובי בהירים באופן משמעותי מקרינת הרקע החלשה נצפתה עובר אחרות, כמו גם הקרינה האוטומטית נצפתה במעיים של בעלי החיים. תולעים נחשפו הם צילמו ישירות על צלחות 384 גם ומספר התולעים המכיל עובר אחד לפחות GFP חיובי נספר עבור כל טוב ומנורמל במספר הכולל של תולעים ש...

דיון

השיטה המתוארת כאן מהווה אסטרטגיה בקנה מידה הגדולה הראשונה לזיהוי רעלים בתאי מין. זה דורש שימוש במהונדס GFP Pxol-1 זן המכיל :: GFP שנאמנות מדווח האינדוקציה של aneuploidy בעוברים מוקדמים המשמש כמדד לתפקוד לקוי של תאי מין. השיטה כרוכה בסנכרון זהיר של ג אוכלוסיית elegans תולעת וחשיפה לכימיקלים בתולעי 96-גם פורמט ואחריו הדמיה של התולעים החיוביים GFP על ידי מיקרוסקופ גבוה תוכן אוטומטי.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
60 מ"מ מאוורר וקצה חד צלחות פטרי	Tritech	T3315
Agar	Apex	20-274
Axygen 96 בארות תחתון עגול שקוף 2 מ"ל פוליפרופילן צלחת באר עמוקה	קורנינג	P-DW-20-C-S
Bactopeptone	Apex	20-261
Bacto-tryptone	Fisher Scientific	BP1421-2
אקונומיקה	קלורוקס
סידן כלורי (CaCl2)	VWR	AA12316-A1
כולסטרול	פישר ICN10138225
DMSO	VWR	IC19018680
E. coli (OP50)	מרכז		גנטיקה של Caenorhabditishttp://www.cbs.umn.edu/cgc
אתנול 200 הוכחה	VWR	EM-4455S
גריינר CELLSTAR 384 צלחות באר	סיגמא-אולדריץ'	M1937-32EA
ImageXpress מיקרו XLS מערכת	התקנים
לבאמיסול הידרוכלוריד	פלוקה	31742
מגנזיום גופרתי נטול מים (MgSO4)VWR		97061-438
MetaXpress רכישת תמונות בתוכן גבוה & תוכנת ניתוח			מולקולריים
אשלגן פוספט מונו-בסיסי (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P5655
סרטי זהורית לתרביות ביולוגיות	VWR	60941-086
נתרן כלורי (NaCl)	Sigma-Aldrich	S5886
נתרן הידרוקסיד (NaOH)	Fisher Scientific	S318
נתרן פוספט דו-בסיסי (Na2HPO4)	VWR	BDH0316
סטריאומיקרוסקופ	Nikon	SMZ 745	למיקרוסקופ זה יש צורת הגדלה כוללת של פי 3.35 עד פי 300. כל מיקרוסקופ עם מאפיינים דומים יעבוד.
TY2441 C. elegans, Pxol-1::GFP מדווח זן	Caenorhabditis Genetics Center		http://www.cbs.umn.edu/cgc
תמצית שמרים	Becton Dickinson	212750