Method Article

Barcoding הגנטי עם חלבונים ניאון עבור יישומי Multiplexed

DOI:

10.3791/52452

⸱

April 14th, 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, San Diego State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאז גילוי גן החלבון הפלואורסצנטי הירוק, חלבונים פלואורסצנטיים השפיעו על הביולוגיה המולקולרית של התא. פרוטוקול זה מתאר כיצד ביטוי של חלבונים פלואורסצנטיים מובחנים באמצעות הנדסה גנטית משמש לברקוד תאים בודדים. ההליך מאפשר מעקב אחר אוכלוסיות שונות בתערובת תאים, שהיא אידיאלית עבור יישומים מרובים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חלבונים פלואורסצנטיים, צבעים פלואורסצנטיים ופלואורופורים באופן כללי חוללו מהפכה בתחום הביולוגיה המולקולרית של התא. בפרט, גילוי חלבונים פלואורסצנטיים והגנים שלהם איפשר הנדסה של היתוך חלבונים ללוקליזציה, ניתוח הפעלת שעתוק ותרגום של חלבונים מעניינים, או מעקב כללי אחר תאים בודדים ואוכלוסיות תאים. השימוש בגנים של חלבון פלואורסצנטי בשילוב עם טכנולוגיה רטרו-ויראלית איפשר עוד יותר ביטוי של חלבונים אלה בתאי יונקים בצורה יציבה ואמינה. מוצג כאן כיצד ניתן להשתמש בגנים אלה כדי לתת לתאים בתוך אוכלוסיית תאים את החתימה הביולוגית שלהם. מכיוון שהחתימה הביולוגית מושגת בטכנולוגיה רטרו-ויראלית, התאים מקודדים 'ללא הגבלת זמן'. ככאלה, ניתן לעקוב אחריהם בנפרד בתוך תערובת של תאים מקודדים ולהשתמש בהם ביישומים ביולוגיים מורכבים יותר. המעקב אחר אוכלוסיות נפרדות בתערובת של תאים הוא אידיאלי עבור יישומים מרובים כגון גילוי תרופות כנגד מספר רב של מטרות או פרופיל הפעלה של מקדמים שונים. הפרוטוקול מתאר כיצד לפתח ולהגביר באלגנטיות תאי יונקים ברקודים עם סמנים פלואורסצנטיים גנטיים מובהקים, וכיצד להשתמש בכמה סמנים בבת אחת או בסמן אחד בעוצמות שונות. לבסוף, הפרוטוקול מתאר כיצד ניתן לנצל את התאים בשילוב עם מבחנים מבוססי תאים כדי להגביר את כוח הניתוח באמצעות ריבוב.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טכנולוגיות כגון ספקטרוסקופיה הקרינה, מיקרוסקופ פלואורסצנטי וcytometry זרימה, כל להסתמך על הקרינה, רכוש ניצל נרחב ביישומים ביוכימיים, ביו-רפואיים, וכימיים. הקרינה, בין אם פנימי או באמצעות תיוג, נוצל לניתוח דפוסי חלבון ביטוי ופרופילים, גורל תא, אינטראקציות חלבון ותפקודים ביולוגיים 1-9, ובאמצעות הקרינה / העברת אנרגיית תהודת פורסטר לצורך זיהוי של אינטראקציות biomolecule ושינויי קונפורמציה 10-13. מאז את בידודו של חלבון Aequorea ויקטוריה הירוק הניאון (GFP) 14, הגילוי של חלבוני ניאון טבעיים נוספים מצורבים אחרים, במיוחד אלמוגים, במידה רבה הגדיל את מספר חלבוני ניאון הקיים עם ספקטרום עירור / פליט....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת תאי יונקים, ייצור נגיפים ותמרה לBarcoding הגנטי

  1. צלחת 2.5 x 10 6 תאים חסיד בצלחת 10 סנטימטר (או confluency סביב 50-60%) יום אחד לפני transfection במדיום הנשר (DMEM) עם 10% עוברי עגל בסרום (FCS) שונה Dulbecco. לתא-קו אריזת שימוש ייצור retroviral של בחירה כגון הפניקס-GP (מתנה מסוג גארי נולאן, אוניברסיטת סטנפורד).
    הערה: קו תא אריזה ביציבות מבטאת חלבוני Gag ופול להיווצרות חלקיקי retroviral בטראנס. להפוך תאים בטוחים בריאים ודבקו בצלחת בשכבה, לפני transfection.
  2. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניאון Multiplexing גנטי המינימרקטים תאים לצורך היישומים ביולוגיים יושג רק פעם אחת אוכלוסיות משובטים בודדות כבר נוצרו. הריבוב הוא יעיל ביותר כאשר יש לי אוכלוסיות המינימרקטים מאפייני ניאון מובהקים ברורים עם חפיפה ספקטרלית מינימאלית. הדוגמא שמוצגת באיור 1 עם אוכלוסיות משובטים של תאי יונקים SupT1 ממחישה כי תאי המינימרקטים עם mCherry וחלבון cyano ניאון (CFP) ניתן לנתח בקלות בו זמנית מבלי לאבד את מאפייני הניאון האישיים שלהם. מטריצה ​​זו ובכך מדגימה פנל של תאי המינימרקטי.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הנה שני הליכים מבוססים היטב כבר בשילוב; הנדסה גנטית באמצעות טכנולוגיה וזיהוי של חלבוני ניאון ניצול זרימת cytometry retroviral. barcoding הגנטי ניאון המבוסס על חלבונים לייצור של שורות תאים ייחודיות מספק דרך חזקה ופשוטה ליישומים מרובבים. יצירת תאי המינימרקטים מהונדסים גנטי באמצעות טכנולוגית retroviral, הוא בהתחלה תהליך ממושך, אך מאפשר לאדם להשיג, הוקם פעם, מקור אמין ויציב של חומר תא. טבעה של טכנולוגיה זו מייצר באופן עקבי שורות תאים מהונדסות גנטי עם מאפייני ניאון יציבים שהפכו biosign.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש לי המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להודות לד"ר גארי נולאן מאוניברסיטת סטנפורד למתן קו תא אריזת הפניקס GP לייצור חלקיקי retroviral. אנו מודים לד"ר רוג'ר Tsien באוניברסיטת קליפורניה בסן דייגו למתן td עגבניות. כמו כן, אנו רוצים להודות למתקן סן דייגו סטייט cytometry הזרימה Core השירות והעזרה שלהם.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
מזרקי BD 10 מ"ל309604המשמשים לסינון הנגיף
0.45 ומיקרו; m מסנן פלויטטרפלואורואתילןPall Corporation4219המשמש לסינון הנגיף
DMEM (מדיום הנשר השונה של Dulbecco)קורנינג45000-304אמצעי גידול תאים לתאי HEK 293T
PEI (פוליאתילנימין)poly sciences23966-2ריכוז 2 מ"ג/מ"ל בשימוש
צנטריפוגה דלי תלייה (מקוררת)Eppendorf5805 000.017משמש עבור זיהום ספין
PBS (מלח פוספט)קורנינג21-040-CVמשמש לשטיפת תאים
פוליברנה (הקסדימית'רן ברומיד)סיגמא-אולדריץ'107689משמש להגברת יעילות הזיהום הנגיפי. בשימוש ב-5 ומיקרו; ריכוז גרם/מ"ל.
מכשיר FACSAriaBD Biosciencesהמשמש למיון אוכלוסיות תאים
FACSCantoBD Biosciencesהמשמש לניתוח תאים
Phoenix-GPמתנה מקו התאים של גארי נולאןהמשמש לייצור חלקיקים רטרו-ויראליים
סרום עגל עובריMediatechMT35015CVהמשמש לצמיחת תאים ומיון
תאי SupT1ATCCCRL-1942לימפובלסטים אנושיים מסוג T
תאי HEK 293TATCCCRL-11268תאי כליה עובריים אנושיים המכילים גם את SV40 אנטיגן T גדול
RPMI 1640Corning10-040-CVאמצעי גידול תאי לתאי SupT1
מכשיר

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression.Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  2. Misteli, T., Caceres, J. F., Spector, D. L. The dynamics of a pre-mRNA splicing factor in living cells. Nature. 387 (6632), 523-527....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescent ProteinsRetroviral TechnologyFlow CytometryFluorescent Activated Cell SortingGenetic BarcodingMultiplexed ApplicationsCell Based AssaysFluorescent MarkersClonal PopulationsViral Transduction

Related Articles