Method Article

Barcoding הגנטי עם חלבונים ניאון עבור יישומי Multiplexed

DOI:

10.3791/52452

⸱

April 14th, 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, San Diego State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאז גילוי גן החלבון הפלואורסצנטי הירוק, חלבונים פלואורסצנטיים השפיעו על הביולוגיה המולקולרית של התא. פרוטוקול זה מתאר כיצד ביטוי של חלבונים פלואורסצנטיים מובחנים באמצעות הנדסה גנטית משמש לברקוד תאים בודדים. ההליך מאפשר מעקב אחר אוכלוסיות שונות בתערובת תאים, שהיא אידיאלית עבור יישומים מרובים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חלבונים פלואורסצנטיים, צבעים פלואורסצנטיים ופלואורופורים באופן כללי חוללו מהפכה בתחום הביולוגיה המולקולרית של התא. בפרט, גילוי חלבונים פלואורסצנטיים והגנים שלהם איפשר הנדסה של היתוך חלבונים ללוקליזציה, ניתוח הפעלת שעתוק ותרגום של חלבונים מעניינים, או מעקב כללי אחר תאים בודדים ואוכלוסיות תאים. השימוש בגנים של חלבון פלואורסצנטי בשילוב עם טכנולוגיה רטרו-ויראלית איפשר עוד יותר ביטוי של חלבונים אלה בתאי יונקים בצורה יציבה ואמינה. מוצג כאן כיצד ניתן להשתמש בגנים אלה כדי לתת לתאים בתוך אוכלוסיית תאים את החתימה הביולוגית שלהם. מכיוון שהחתימה הביולוגית מושגת בטכנולוגיה רטרו-ויראלית, התאים מקודדים 'ללא הגבלת זמן'. ככאלה, ניתן לעקוב אחריהם בנפרד בתוך תערובת של תאים מקודדים ולהשתמש בהם ביישומים ביולוגיים מורכבים יותר. המעקב אחר אוכלוסיות נפרדות בתערובת של תאים הוא אידיאלי עבור יישומים מרובים כגון גילוי תרופות כנגד מספר רב של מטרות או פרופיל הפעלה של מקדמים שונים. הפרוטוקול מתאר כיצד לפתח ולהגביר באלגנטיות תאי יונקים ברקודים עם סמנים פלואורסצנטיים גנטיים מובהקים, וכיצד להשתמש בכמה סמנים בבת אחת או בסמן אחד בעוצמות שונות. לבסוף, הפרוטוקול מתאר כיצד ניתן לנצל את התאים בשילוב עם מבחנים מבוססי תאים כדי להגביר את כוח הניתוח באמצעות ריבוב.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טכנולוגיות כגון ספקטרוסקופיה הקרינה, מיקרוסקופ פלואורסצנטי וcytometry זרימה, כל להסתמך על הקרינה, רכוש ניצל נרחב ביישומים ביוכימיים, ביו-רפואיים, וכימיים. הקרינה, בין אם פנימי או באמצעות תיוג, נוצל לניתוח דפוסי חלבון ביטוי ופרופילים, גורל תא, אינטראקציות חלבון ותפקודים ביולוגיים 1-9, ובאמצעות הקרינה / העברת אנרגיית תהודת פורסטר לצורך זיהוי של אינטראקציות biomolecule ושינויי קונפורמציה 10-13. מאז את בידודו של חלבון Aequorea ויקטוריה הירוק הניאון (GFP) 14, הגילוי של חלבוני ניאון טבעיים נוספים מצורבים אחרים, במיוחד אלמוגים, במידה רבה הגדיל את מספר חלבוני ניאון הקיים עם ספקטרום עירור / פליטה להבחין. אלה, יחד עם ההקדמה של מוטציות בגנים שלהם 15-19, havהדואר הרחיב עוד יותר את האפשרויות, קבלת צבעים נכונים של חלבוני ניאון זמינים למדענים המנצלים מיקרוסקופיה, cytometry זרימה וטכנולוגיות מבוססי הקרינה אחרות למחקר שלהם.

במקביל, אם כי באופן עצמאי, הפיתוח של טכנולוגית retroviral אופן דרסטי הקל הביטוי היציב של מידע גנטי מחוץ לרחם בתאי יונקים 20-23. לכן אין זה מפתיע כי טכנולוגיה זו נעשתה שימוש כדי להעביר את הגנים של חלבוני ניאון למספר רחב של סוגי תאים ורקמות 24-28 או לייצור בעלי החיים מהונדסים 29-31. בעקבות הטבע של רטרווירוסים, המידע הגנטי של החלבון פלואורסצנטי מחוץ לרחם הוא הציג בתוך הגנום של התא 32 והתא הופך ניאון 'לever'. מאפיין זה מאפשר מעקב אחר גורל תא, או של תא בודד בתוך אוכלוסייה של תאים. התא עכשיו הניאון יש בכך אקיאדום biosignature משלו ויכול להיות מוגדר כהמבורקד. biosignature הייחודי שלה מזהה אותו מהתאים אחרים, וחשוב מכך, מבדיל אותו מהתאים גנטי מניפולציות להביע חלבוני ניאון שונים עם ספקטרום קליטה / פליטה להבחין. יישומים ביולוגיים כגון המעקב של גורמי תכנות מחדש לקראת pluripotency 33, הניתוח של גורמי subnuclear להבהרת לוקליזציה nucleolar 34, הבנייה של פלסמידים כתב ניאון ללימודי תעתיק 35 או התיוג הגנטי של תאי עצב לחקר ארכיטקטורת רשת עצבית 36 , הן רק ארבעה דוגמאות של רב שנצלו גני חלבון פלואורסצנטי שונים עבור אותו התקנה ניסיונית.

Cytometry זרימה כבר בשימוש נרחב לניתוח של תהליכים ביולוגיים ברמת התא הבודד, כגון ביטוי גנים, מחזור תא, אפופטוזיס, ואיתות באמצעות phosphorylation 37-43 .the ביטוי יציב של גני חלבון פלואורסצנטי בתאי יונקים שיפר עוד יותר את השירות של הזרימה cytometry לאינטראקציות תא ניתוח 38,44 ויגנד לקלוט 45. יכולות משופרות אפשרו זרימת cytometry להפוך למתודולוגיה שימוש נרחב לתפוקה גבוהה וגבוה תוכן הקרנת 46. למרות המספר כעת המורחב של fluorometers ורובוטיקה טכנולוגיות שיכולים מערכות צלחת זוג קורא, הדמיה וcytometry זרימה, נראה שיש חוסר בתכנון ניסוי שיכול לנצל ולהתאים את יכולות טכנולוגיות משופרות אלה.

מתודולוגיות מבוססות תאים מהיר, אמינות, פשוטות וחזקה יש צורך באופן דרסטי עבור יישומים מרובבים שיחזקו את יכולת תפוקה גבוהה. הדבר נכון במיוחד בתחום של גילוי תרופות שבו מבחני מבוססי תאי הנדסה בפורמט ריבוב יכולים לשפר את הכח של הקרנת תפוקה גבוהה 39,47-50 . ריבוב, שכן היא מאפשרת ניתוחים בו זמנית במדגם אחד, משפר עוד יותר את יכולות תפוקה גבוהה 51-54. barcoding הגנטי ניאון לא רק מאפשר לריבוב אלגנטי, אלא גם, מהונדס פעם, עוקף את הצורך של פרוטוקולי זמן רב, מפחית את עלויות מלווים בנוגדנים, חרוזים וכתמים 39,52,55, ויכול להפחית את מספר המסכים הנדרש לגבוה יישומי תפוקה. יש לנו תארנו לאחרונה איך retroviral טכנולוגיה יכול לשפר את הריבוב דרך barcoding הגנטי ניאון עבור יישומים ביולוגיים, בהבעת assay שפותח בעבר כדי לעקוב אחר פעילות פרוטאז HIV-1 56,57 עם גרסאות קליניות נפוצות שונות 58. המתודולוגיה מוסברת באופן תיאורי יותר התמקדות על איך לבחור ולהגביר תאי המינימרקטים גנטי ניאון ואיך לייצר פנלים של אוכלוסיות משובטים להביע חלבוני ניאון שונים ו / או intensit הקרינה שונהies. פנלים של אוכלוסיות תאים להבחין בהתבסס על מאפייני הניאון שלהם לשפר את יכולות מרובבות, אשר ניתן לניצול נוסף בשילוב עם מבחני מבוססי תאים שהתמודדות עם שאלות ביולוגיות שונות. הפרוטוקול מתאר גם כיצד להנדס פנל של תאי המינימרקטים נושא אחד מבחני מבוססי תאים שפותחו בעבר במעבדה, כמו בדוגמה של 59. פרוטוקול זה ולכן לא נועד להראות את הטכנולוגיה מבוססת היטב retroviral / lentiviral להעברה גנטית, את הערך של חלבוני ניאון או היישומים של זרימת cytometry 60,48 אלא כדי להראות את כוח שיפור של שילוב שלושה עבור יישומים מרובבים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת תאי יונקים, ייצור נגיפים ותמרה לBarcoding הגנטי

  1. צלחת 2.5 x 10 6 תאים חסיד בצלחת 10 סנטימטר (או confluency סביב 50-60%) יום אחד לפני transfection במדיום הנשר (DMEM) עם 10% עוברי עגל בסרום (FCS) שונה Dulbecco. לתא-קו אריזת שימוש ייצור retroviral של בחירה כגון הפניקס-GP (מתנה מסוג גארי נולאן, אוניברסיטת סטנפורד).
    הערה: קו תא אריזה ביציבות מבטאת חלבוני Gag ופול להיווצרות חלקיקי retroviral בטראנס. להפוך תאים בטוחים בריאים ודבקו בצלחת בשכבה, לפני transfection.
  2. 24 שעות מאוחר יותר, להכין את תערובת transfection DNA.
    1. 125 μl של סרום ללא DMEM להוסיף וקטור 3 מיקרוגרם מעטפת וירוס לפוחי Stomatitis גליקופרוטאין (PCI-VSVG) ו -3 מיקרוגרם של וקטור העברה נושא את גן חלבון פלואורסצנטי של עניין. לערבב ולהוסיף 15 μl של polyethylimine (2 מ"ג / מיליליטר).
    2. דגירה תערובת בטמפרטורת חדר למשך 15 דקות ולהוסיף לתאים הנפתח חכם.
      הערה: Polyethylimine מתווסף לתערובת הומוגנית DNA כמגיב transfection ליצירת polyplexes. על מנת לקבל את החלקיקים נגיפיים ביצוע סמני חלבון ניאון שונים, לבצע כל transfection באופן עצמאי עם הסמן של בחירה. זכור כי וקטור העברת retroviral הוא סביב 7 קילו באורך ולא ניתן לארוז אם מעל 10 קילו-בייט.
  3. דגירה צלחות ב 37 מעלות צלזיוס. על מנת להגדיל את צלחות מקום ייצור נגיפיות על 30 מעלות צלזיוס או 32 ° C במקום.
    הערה: ניתן להחליף 24 תקשורת transfection הודעה hr עם 7 מיליליטר של תקשורת טריות, ואם כי זה עשוי לשפר את בריאות תא זה עלול להפחית עומס נגיפי בsupernatant.
  4. לאחר transfection 48 שעות לאסוף את החלקיקים המכיל supernatant ויראלי ומסנן עם מסנן 0.45 מיקרומטר polytetrafluoroethylene. השתמש supernatant ויראלי טרי שנאסף עבור התמרה. Otherwise לשמור supernatant בaliquots ב -80 ° C ולהימנע להקפיא להפשיר. זכור כי כייל נגיף יקטן כנראה עד 50% בכל מחזור ההקפאה-הפשרה.
  5. שורת תאי צלחת של בחירת 24 שעות לפני התמרה אם חסיד, או מייד לפני התמרה אם לא חסיד. זרעי 2.0 x 10 5-3.0 x 10 5 תאים חסיד (כאן הא 7.5.1 וHEK 293T) או 5.0 x 10 5 ל 1 x 10 6 תאים שאינם חסיד (כאן SupT1) לכל גם בצלחת 6-היטב.
    הערה: הקפד לכייל את מספר התאים שנזרע לפני התמרה, במיוחד לתאים חסיד, כך שתאים להשיג confluency של כ -60% בזמן של התמרה.
  6. הוסף 5 מיקרוגרם / מיליליטר polybrene (ברומיד hexadimethrene) לתאי זרע ולאחר מכן להוסיף supernatant ויראלי שנאסף בעבר להשיג סביב 20-40% זיהום (כאן 2 מיליליטר).
    הערה: משרד הפנים או אחוז מהזיהום הוא בעיקר שרירותית, כמו מיון יאפשר להגביר כל subpopulatיון של תאים. כמובן, שיעור גבוה יותר של זיהום מקל ומאיץ את התהליך של הגברה.
  7. Transduce תאים על ידי צנטריפוגה בהרוטור דלי תלייה ב 1500 XG במשך 120 דקות ב 32 מעלות צלזיוס. Resuspend תאים שאינם חסיד עם תקשורת טרי לפני הדגירה. לתאים חסיד, להחליף עם תקשורת 24 לאחר התמרה-hr טרי.
    הערה: מומלץ לאטום את הצלחות לפני צנטריפוגה עם parafilm כדי למנוע שפיכה מעל. כדי להגדיל את המגוון גנטי של תאי המינימרקטים, transduce תאים עם חלקיקים נגיפיים ביצוע חלבונים שונים ניאון (המתקבלים משלב 1.4). בעת בחירת סמני ניאון, לוודא שהם תואמים את המכשור ויש להם פרמטרים ניאון להבחין.

2. בחירה והגברה של תאי המינימרקטים גנטי

  1. לנתח תאי יונקים transduced על ידי הזרימה cytometry לפחות 72 שעות לאחר התמרה לכמת את שיעור אחוז של התמרה. השתמש בשורת תאים-transduced שאינו דומה כביקורת שלילית.
    הערה: ככל מיון ישמש לטהר אוכלוסיות בודדות המינימרקטים תא, שיעור אחוז גבוה של התמרה ראשונית, ואילו לא נחוץ, צריך להאיץ את התהליך של הגברה.
  2. לנצל את התא-סדרן של בחירה כדי לקבל את התאים המבטאים את החלבון של עניין.
    1. לשם כך, להבטיח את השערים מוגדרים כהלכה בערוצים הנכונים.
      1. לשם כך להשתמש באותו קו התא נאיבי כביקורת שלילית ולהגדיר את מתח פרמטר / ערוץ, כך שהאוכלוסייה השלילית היא מתחת לערך של 10 3 על כל ציר ניאון. לקבוע gating לקרינה חיובית כאירועים המופיעים מעל זה של הביקורת השלילית עבור כל ערוץ ניאון.
    2. להיות מודע לכך שכל מכשיר עשוי להשתנות והמתח הנכון לקביעת gating צריך להיות בהתאם, מה שהופך את בקרות חיוביות ושליליות הכרחיים בכל expהתקנת erimental.
      1. לגילוי הקרינה בהגדרת ניסוי זה להשתמש בערוץ FITC (מסנן 530/30-פס, ולפניו לעבור סינון ארוך 502) לeGFP, ערוץ PE (מסנן 585/42-פס, ולפניו מסנן 556 מסירה ארוכה) לtd עגבניות , וערוץ APC (מסנן 660/20 להקה לעבור) לE2 Crimson.
        הערה: לייזר 488 ננומטר מרגשת eGFP וtd עגבניות תוך E2 Crimson מתרגש על ידי לייזר 633 ננומטר.
  3. צינורות חרוטי מיין ל -15 מיליליטר עם 1 מיליליטר של 100% FCS.
    הערה: התהליך של מיון אוכלוסיות תאי ניאון אינו חובה כאחד ישירות יכול להמשיך עם הסוג של שיבוטים בודדים (ראה להלן). מיון אוכלוסיות חזק המבוססות על הקרינה נבחרה מבטיח אוכלוסיית גיבוי לבחירה עתידית של שיבוטים בודדים. זכור כי תאים בודדים הם בזמנים קשים לגדול תוך אפשר להקפיא אוכלוסייה גדולה של תאים בקלות, ולאחר מכן הפשירה ומוגברת בשלב מאוחר יותר.
  4. Spבמורד האוכלוסיות הממוינים בצנטריפוגה הרוטור דלי תלוי ב524 גרם ב 32 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות עד גלולה תאים. להשעות מחדש ב 1 מיליליטר של תקשורת טריות, ומחדש צלחת תאים כך שconfluency התא הוא מתחת ל -60%, כדי לאפשר צמיחה והחלוקה לפחות יומיים.
    1. לדוגמא, תאים חסיד צלחת בסביבות 3 x 10 5 תאים ב 2 מיליליטר של תקשורת בכל טוב בצלחת 6-היטב ו- 2 x 10 6 תאים ב 2 מיליליטר של תקשורת בצלחת 6 סנטימטר. השתמש DMEM לתאים חסיד וRPMI לתאים שאינם חסיד (או כל מדיום שצוין, אם נדרש). הנח תאים מצופים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך כמה ימים כדי לאפשר להגברה.

3. לקבל משובטות אוכלוסיות של תאי המינימרקטים גנטי בעוצמות שונות

  1. להשיג אוכלוסיות משובטים מתאי transduced במקור (שלב 1.7) או מהאוכלוסייה הממוינת (שלב 2.3).
    הערה: פעולה זו תבטיח רמה שווה או דומה של ביטוי חלבון פלואורסצנטי בין כל התאים בתוך האוכלוסייה (אוכלוסייה הדוקה עם קורות חיים קטנים בעוצמת הקרינה ממוצעת של עד 40%).
    1. לשם כך, תאי מין יחידים ל96-גם צלחות עם יחידה בתצהיר תא אוטומטי (ACDU). קבע שערים למיון על פי אוכלוסיות של עניין. שערים להבטיח נקבעים יומן בקנה מידה אחד לפחות מלבד להשיג אוכלוסיות מובחנות בעת בחירת תאים בעוצמות ניאון שונות. להליך המוצג כאן, להשתמש באותו cytometry הזרימה ניסיוני שהוקם כאחד מתואר בשלב 2.2.
  2. להגביר שיבוטים בודדים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס לפחות 2 שבועות. בתהליך של הגברה לנתח את התאים תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח שאוכלוסיות גדלו נובעות מהתאים בודדים ולא מאחד או יותר.
    הערה: זכור כי סדרן יציבו תא אחד בכל טוב בממוצע, ובעוד כמה בארות לא יכולות להיות כל תא בכל, אולי לאחרים יש יותר מאחד.
    1. כדי להבטיח שpopulation נובע מתא אחד בלבד, להיות מאוד עדין עם הצלחת ולא להפריע לבארות על ידי pipetting. שים לב לצלחת, גם על ידי כן, מתחת למיקרוסקופ.
      הערה: בעוד תאים בודדים עשויים לעתים להיות קשים לזהות, ברגע שהם מתחילים החלוקה הם יהיו קלים לזיהוי.
    2. להיות מודע לכך שלעתים קרובות 'הגוש של התאים בשולי. זורק אותם הבארות שבו ניתן לצפות אוכלוסיות משובטים מרובות ולשמור על אלה שיש לי אוכלוסייה אחת חזק.
      הערה: מומלץ להעביר אותם לתוך צלחות גדולות יותר להגברה.
  3. מסך האוכלוסיות המשובטים המשוערות על ידי ניתוחם על ידי cytometry זרימה. להשוות אותם לביקורת שלילית ניצול אותה הזרימה cytometry התקנה ניסיונית.
    1. לנתח רק אחוז מהמדגם ולשמור את שאר כגיבוי. בחר האוכלוסיות ביותר המובהק נפרדות המבוססות על עוצמה ואטימות של האוכלוסייה ממוצעת. להגביר אותם לפי צורך או להקפיא מניות בהקפאת תקשורת עם גליצרול 20% ב -80 ° C לפרקי זמן קצרים או חנקן נוזלי למשך זמן ארוך יותר.
      הערה: זכור כי אוכלוסייה "אמיתית" משובט צריכה דפוס הקרינה חזק מאוד.

4. ודאו יכולות Multiplexing לתפוקה גבוהה הקרנה (HTS)

  1. לשלב כמה שיותר אוכלוסיות משובטים שונות בהתאם לצורך שיכול להיות מנוצל נוסף בפורמט מרובב. בחר שיבוטים עם קליטה / ספקטרום פליטה להבחין ו / או בעוצמות שונות. אם נעשה שימוש בפורמט צלחת 96-היטב, אשר מתאימה לHTS, זרע 50,000 תאים ב200 μl בכל טוב.
    הערה: זכור כי מספר התאים הוא אומדן בלבד ועשוי להשתנות בהתאם לסוג תא ובין אם מדובר בחסיד או לא.
  2. לנתח את המדגם באמצעות זרימת cytometry כדי להבטיח שכל אחד משורות תאים העצמאיים שהוקמו ניאון ניתן להבחין בין זה לזה. לפני הניתוח להכין שליליובקרות צבע אחד לפרמטרים שנקבעו וערכי פיצוי.
    הערה: הגדרת הפרמטרים להבחנה ברורה האוכלוסיות המעורבות תאפשר להם להיות מנוצלת נוספת בפורמט מרובב.

5. להתאים שורות תאים גנטי המינימרקטים ליישום הביולוגי של בחירה

  1. Transduce הוקמו קווי המינימרקטים גנטיים תא עם חלקיקים נגיפיים המכילים אלמנטי assay של בחירה, כפי שמתוארים כאן בStolp et al., 2013 59. זכור כי assay של בחירה צריך לכבוש ערוץ ניאון נוסף והבחנה ולכן הוא יועבר לשורת תאי המינימרקטים המתאימה.
    הערה: כל שורת תאי המינימרקטים יכולה לשאת assay שונה.
  2. תאי המינימרקטים מיון גנטי ניאון עבור אלה המכילים אלמנטי assay.
    יכולים להיות מהונדסים אלמנטי Assay מצמידים תג או חלבון פלואורסצנטי (כמו היתוך או באמצעות אתר כניסת הריבוזום פנימי) f: הערהאו איתור פשוט באמצעות מערבי סופג, cytometry זרימה או מיקרוסקופ. המערכת מנוצלת בפרוטוקול זה מסתמכת על ביטוי משטח epitope HA לבד, או עם ביטוי epitope דגל נוסף.
    1. להכתים את האוכלוסיות המשובטים מכילות assay עם נוגדני מצמידי HA וAPC-fluorescently. לאחר מכן לנתח את האוכלוסיות המשובטים עם אנטי-דגל ומכתים נוגדן FITC- מצומדות.
    2. כדי לעקוב אחר בחזרה assay, לנתח או "לפענח" האוכלוסיות בערוץ המתאים שבו ניתן להבחין שורות תאי המינימרקטים שונות גנטי. כאן, לפענח את טיבו של המצע על ידי ניתוח בערוץ PE לגילוי עגבניות td.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניאון Multiplexing גנטי המינימרקטים תאים לצורך היישומים ביולוגיים יושג רק פעם אחת אוכלוסיות משובטים בודדות כבר נוצרו. הריבוב הוא יעיל ביותר כאשר יש לי אוכלוסיות המינימרקטים מאפייני ניאון מובהקים ברורים עם חפיפה ספקטרלית מינימאלית. הדוגמא שמוצגת באיור 1 עם אוכלוסיות משובטים של תאי יונקים SupT1 ממחישה כי תאי המינימרקטים עם mCherry וחלבון cyano ניאון (CFP) ניתן לנתח בקלות בו זמנית מבלי לאבד את מאפייני הניאון האישיים שלהם. מטריצה ​​זו ובכך מדגימה פנל של תאי המינימרקטי...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הנה שני הליכים מבוססים היטב כבר בשילוב; הנדסה גנטית באמצעות טכנולוגיה וזיהוי של חלבוני ניאון ניצול זרימת cytometry retroviral. barcoding הגנטי ניאון המבוסס על חלבונים לייצור של שורות תאים ייחודיות מספק דרך חזקה ופשוטה ליישומים מרובבים. יצירת תאי המינימרקטים מהונדסים גנטי באמצעות טכנולוגית retroviral, הוא בהתחלה תהליך ממושך, אך מאפשר לאדם להשיג, הוקם פעם, מקור אמין ויציב של חומר תא. טבעה של טכנולוגיה זו מייצר באופן עקבי שורות תאים מהונדסות גנטי עם מאפייני ניאון יציבים שהפכו biosign...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש לי המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להודות לד"ר גארי נולאן מאוניברסיטת סטנפורד למתן קו תא אריזת הפניקס GP לייצור חלקיקי retroviral. אנו מודים לד"ר רוג'ר Tsien באוניברסיטת קליפורניה בסן דייגו למתן td עגבניות. כמו כן, אנו רוצים להודות למתקן סן דייגו סטייט cytometry הזרימה Core השירות והעזרה שלהם.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
מזרקי BD 10 מ"ל309604המשמשים לסינון הנגיף
0.45 ומיקרו; m מסנן פלויטטרפלואורואתילןPall Corporation4219המשמש לסינון הנגיף
DMEM (מדיום הנשר השונה של Dulbecco)קורנינג45000-304אמצעי גידול תאים לתאי HEK 293T
PEI (פוליאתילנימין)poly sciences23966-2ריכוז 2 מ"ג/מ"ל בשימוש
צנטריפוגה דלי תלייה (מקוררת)Eppendorf5805 000.017משמש עבור זיהום ספין
PBS (מלח פוספט)קורנינג21-040-CVמשמש לשטיפת תאים
פוליברנה (הקסדימית'רן ברומיד)סיגמא-אולדריץ'107689משמש להגברת יעילות הזיהום הנגיפי. בשימוש ב-5 ומיקרו; ריכוז גרם/מ"ל.
מכשיר FACSAriaBD Biosciencesהמשמש למיון אוכלוסיות תאים
FACSCantoBD Biosciencesהמשמש לניתוח תאים
Phoenix-GPמתנה מקו התאים של גארי נולאןהמשמש לייצור חלקיקים רטרו-ויראליים
סרום עגל עובריMediatechMT35015CVהמשמש לצמיחת תאים ומיון
תאי SupT1ATCCCRL-1942לימפובלסטים אנושיים מסוג T
תאי HEK 293TATCCCRL-11268תאי כליה עובריים אנושיים המכילים גם את SV40 אנטיגן T גדול
RPMI 1640Corning10-040-CVאמצעי גידול תאי לתאי SupT1
מכשיר

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression.Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  2. Misteli, T., Caceres, J. F., Spector, D. L. The dynamics of a pre-mRNA splicing factor in living cells. Nature. 387 (6632), 523-527 (1997).
  3. Godwin, A. R., Stadler, H. S., Nakamura, K., Capecchi, M. R. Detection of targeted GFP-Hox gene fusions during mouse embryogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (22), 13042-13047 (1998).
  4. Irish, J. M., et al. Single cell profiling of potentiated phospho-protein networks in cancer cells. Cell. 118 (2), 217-228 (2004).
  5. Natarajan, L., Jackson, B. M., Szyleyko, E., Eisenmann, D. M. Identification of evolutionarily conserved promoter elements and amino acids required for function of the C. elegans beta-catenin homolog BAR-1. Dev Biol. 272 (2), 536-557 (2004).
  6. Tumbar, T., et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin.Science. 303 (5656), 359-363 (2004).
  7. Valencia-Burton, M., et al. Spatiotemporal patterns and transcription kinetics of induced RNA in single bacterial cells.Proc. Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16399-16404 (2009).
  8. Mahmoud, L., et al. Green fluorescent protein reporter system with transcriptional sequence heterogeneity for monitoring the interferon response.J Virol. 85 (18), 9268-9275 (2011).
  9. Saunders, M. J., et al. Fluorogen activating proteins in flow cytometry for the study of surface molecules and receptors.Methods. 57 (3), 308-317 (2012).
  10. Wang, Y. L., Taylor, D. L. Probing the dynamic equilibrium of actin polymerization by fluorescence energy transfer. Cell. 27 (3 Pt 2), 429-436 (1981).
  11. He, L., et al. Flow cytometric measurement of fluorescence (Forster) resonance energy transfer from cyan fluorescent protein to yellow fluorescent protein using single-laser excitation at 458 nm. Cytometry A. 53 (1), 39-54 (2003).
  12. Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300 (5616), 82-86 (2003).
  13. Clayton, A. H., et al. Ligand-induced dimer-tetramer transition during the activation of the cell surface epidermal growth factor receptor-A multidimensional microscopy analysis. J Biol Chem. 280 (34), 30392-30399 (2005).
  14. Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G., Cormier, M. J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein.Gene. 111 (2), 229-233 (1992).
  15. Heim, R., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y. Improved green fluorescence. Nature. 373 (6516), 663-664 (1995).
  16. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).
  17. Ai, H. W., Shaner, N. C., Cheng, Z., Tsien, R. Y., Campbell, R. E. Exploration of new chromophore structures leads to the identification of improved blue fluorescent proteins.Biochemistry. 46 (20), 5904-5910 (2007).
  18. Mishin, A. S., et al. The first mutant of the Aequorea victoria green fluorescent protein that forms a red chromophore. Biochemistry. 47 (16), 4666-4673 (2008).
  19. Tsien, R. Y. Constructing and exploiting the fluorescent protein paintbox (Nobel Lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 48 (31), 5612-5626 (2009).
  20. Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
  21. Klages, N., Zufferey, R., Trono, D. A stable system for the high-titer production of multiply attenuated lentiviral vectors. Mol Ther. 2 (2), 170-176 (2000).
  22. Lai, Z., Brady, R. O. Gene transfer into the central nervous system in vivo using a recombinanat lentivirus vector. J Neurosci Res. 67 (3), 363-371 (2002).
  23. Wolkowicz, R., Nolan, G. P., Curran, M. A. Lentiviral vectors for the delivery of DNA into mammalian cells. Methods Mol Biol. 246, 391-411 (2004).
  24. Grignani, F., et al. High-efficiency gene transfer and selection of human hematopoietic progenitor cells with a hybrid EBV/retroviral vector expressing the green fluorescence protein. Cancer Res. 58 (1), 14-19 (1998).
  25. Ramezani, A., Hawley, T. S., Hawley, R. G. Lentiviral vectors for enhanced gene expression in human hematopoietic cells. Mol Ther. 2 (5), 458-469 (2000).
  26. Roddie, P. H., Paterson, T., Turner, M. L. Gene transfer to primary acute myeloid leukaemia blasts and myeloid leukaemia cell lines. Cytokines Cell Mol Ther. 6 (3), 127-134 (2000).
  27. Zhang, X. Y., et al. Lentiviral vectors for sustained transgene expression in human bone marrow-derived stromal cells. Mol Ther. 5 (5 Pt 1), 555-565 (2002).
  28. Rossi, G. R., Mautino, M. R., Morgan, R. A. High-efficiency lentiviral vector-mediated gene transfer into murine macrophages and activated splenic B lymphocytes. Hum Gene Ther. 14 (4), 385-391 (2003).
  29. Hamra, F. K., et al. Production of transgenic rats by lentiviral transduction of male germ-line stem cells.Proc. Natl Acad Sci U S A. 99 (23), 14931-14936 (2002).
  30. Chan, A. W., Chong, K. Y., Martinovich, C., Simerly, C., Schatten, G. Transgenic monkeys produced by retroviral gene transfer into mature oocytes. Science. 291 (5502), 309-3012 (2001).
  31. Linney, E., Hardison, N. L., Lonze, B. E., Lyons, S., DiNapoli, L. Transgene expression in zebrafish: A comparison of retroviral-vector and DNA-injection approaches. Dev Biol. 213 (1), 207-2016 (1999).
  32. Engelman, A., Mizuuchi, K., Craigie, R. HIV-1 DNA integration: mechanism of viral DNA cleavage and DNA strand transfer. Cell. 67 (6), 1211-1221 (1991).
  33. Tiemann, U., et al. Optimal reprogramming factor stoichiometry increases colony numbers and affects molecular characteristics of murine induced pluripotent stem cells. Cytometry A. 79 (6), 426-435 (2011).
  34. Leung, A. K., Lamond, A. I. In vivo analysis of NHPX reveals a novel nucleolar localization pathway involving a transient accumulation in splicing speckles. J Cell Biol. 157 (4), 615-629 (2002).
  35. Malone, C. L., et al. Fluorescent reporters for Staphylococcus aureus. J Microbiol Methods. 77 (3), 251-260 (2009).
  36. Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
  37. Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Intracellular phospho-protein staining techniques for flow cytometry: monitoring single cell signaling events. Cytometry A. 55 (2), 61-70 (2003).
  38. Violin, J. D., Zhang, J., Tsien, R. Y., Newton, A. C. A genetically encoded fluorescent reporter reveals oscillatory phosphorylation by protein kinase. C.J Cell Biol. 161 (5), 899-909 (2003).
  39. Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nat Methods. 3 (5), 361-368 (2006).
  40. Edwards, B. S., Ivnitski-Steele, I., Young, S. M., Salas, V. M., Sklar, L. A. High-throughput cytotoxicity screening by propidium iodide staining. Curr Protoc Cytomt. 9 (Unit 9 24), (2007).
  41. Schulz, K. R., Danna, E. A., Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Single-cell phospho-protein analysis by flow cytometry. Curr Protoc Immunol. 8 (Unit 8 17), (2007).
  42. Lu, R., Neff, N. F., Quake, S. R., Weissman, I. L. Tracking single hematopoietic stem cells in vivo using high-throughput sequencing in conjunction with viral genetic barcoding. Nat Biotechnol. 29 (10), 928-933 (2011).
  43. Grant, G. D., et al. Live-cell monitoring of periodic gene expression in synchronous human cells identifies Forkhead genes involved in cell cycle control. Mol Biol Cell. 23 (16), 3079-3093 (2012).
  44. Fiering, S. N., et al. Improved FACS-Gal: flow cytometric analysis and sorting of viable eukaryotic cells expressing reporter gene constructs. Cytometry. 12 (4), 291-301 (1991).
  45. Fay, S. P., Posner, R. G., Swann, W. N., Sklar, L. A. Real-time analysis of the assembly of ligand, receptor, and G protein by quantitative fluorescence flow cytometry. Biochemistry. 30 (20), 5066-5075 (1991).
  46. Edwards, B. S., Oprea, T., Prossnitz, E. R., Sklar, L. A. Flow cytometry for high-throughput, high-content screening. Curr Opin Chem Biol. 8 (4), 392-398 (2004).
  47. Durick, K., Negulescu, P. Cellular biosensors for drug discovery. Biosens Bioelectron. 16 (7-8), 587-592 (2001).
  48. Edwards, B. S., et al. High-throughput flow cytometry for drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 2 (5), 685-696 (2007).
  49. Sklar, L. A., Carter, M. B., Edwards, B. S. Flow cytometry for drug discovery, receptor pharmacology and high-throughput screening. Curr Opin Pharmacol. 7 (5), 527-534 (2007).
  50. Curpan, R. F., et al. High-throughput screen for the chemical inhibitors of antiapoptotic bcl-2 family proteins by multiplex flow cytometry. Assay Drug Dev Technol. 9 (5), 465-474 (2011).
  51. Bradford, J. A., Buller, G., Suter, M., Ignatius, M., Beechem, J. M. Fluorescence-intensity multiplexing: simultaneous seven-marker, two-color immunophenotyping using flow cytometry. Cytometry A. 61 (2), 142-152 (2004).
  52. Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Trejo, A., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding for multiplex flow cytometry. Curr Protoc Cytom. 6 (Unit 6 31), (2011).
  53. Surviladze, Z., Young, S. M., Sklar, L. A. High-throughput flow cytometry bead-based multiplex assay for identification of Rho GTPase inhibitors. Methods Mol Biol. 827, 253-270 (2012).
  54. Sukhdeo, K., et al. Multiplex flow cytometry barcoding and antibody arrays identify surface antigen profiles of primary and metastatic colon cancer cell lines. PLoS One. 8 (1), e53015(2013).
  55. Vignali, D. A. Multiplexed particle-based flow cytometric assays. J Immunol Methods. 342 (1-2), 243-255 (2000).
  56. Hilton, B. J., Wolkowicz, R. An assay to monitor HIV-1 protease activity for the identification of novel inhibitors in T-cells. PLoS One. 5 (6), e10940(2010).
  57. Rajakuberan, C., Hilton, B. J., Wolkowicz, R. Protocol for a mammalian cell-based assay for monitoring the HIV-1 protease activity. Methods Mol Biol. 903, 393-405 (2012).
  58. Smurthwaite, C. A., et al. Fluorescent genetic barcoding in mammalian cells for enhanced multiplexing capabilities in flow cytometry. Cytometry A. 85 (1), 105-113 (2014).
  59. Stolp, Z. D., et al. A Novel Two-Tag System for Monitoring Transport and Cleavage through the Classical Secretory Pathway - Adaptation to HIV Envelope Processing. PLoS One. 8 (6), e68835(2013).
  60. Schwartz, A., et al. Standardizing flow cytometry: a classification system of fluorescence standards used for flow cytometry. Cytometry. 33 (2), 106-114 (1998).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescent ProteinsRetroviral TechnologyFlow CytometryFluorescent Activated Cell SortingGenetic BarcodingMultiplexed ApplicationsCell Based AssaysFluorescent MarkersClonal PopulationsViral Transduction

Related Articles