מאמר שיטה

חוקר מולקולה בודדת הדבקה על ידי הכוח האטומי ספקטרוסקופיה

DOI:

10.3791/52456

⸱

27 בפברואר 2015

 ,  ,  , 
1Physik-Department E22a, Technische Universität München, 2IMETUM, Technische Universität München

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מוצג פרוטוקול לחיבור מגוון גדול של מולקולות בודדות באופן קוולנטי לקצה AFM. ניתנים נהלים ודוגמאות לקביעת כוח ההדבקה והאנרגיה החופשית של מולקולות אלה על תומכים מוצקים וממשקים ביולוגיים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ספקטרוסקופיה כוח האטומית היא כלי אידיאלי ללמוד מולקולות על משטחים וממשקים. פרוטוקול ניסוי לזוג במגוון גדול של מולקולות בודדות קוולנטית על קצה AFM מוצג. באותו הזמן בקצה AFM הוא פסיבציה כדי למנוע אינטראקציות נוקבות בין הקצה ואת המצע, שהוא תנאי הכרחי ללימודי מולקולות בודדות מחוברת לקצה AFM. ניתוח כדי לקבוע את כוח ההידבקות, אורך ההידבקות, ואנרגיה החופשית של מולקולות אלה על משטחים מוצקים וביו-ממשקי זמן קצר הציגו והפניות חיצוניות לקריאה נוספת מסופקות. מולקולות דוגמא הן polytyrosine פולי (חומצת אמינו), פולימר השתל מלק g -PS והאפיפיור פוספוליפידים (1-palmitoyl-2-oleoyl- sn -glycero-3-phosphoethanolamine). מולקולות אלה desorbed ממשטחים שונים כמו CH 3 -SAMs, יהלומי מימן הסתיים ונתמך bilayers שומנים בתנאי ממס שונים. לבסוף,יתרונות של ניסויי מולקולת כוח ספקטרוסקופיות יחידים נדונים לרבות אמצעים כדי להחליט אם באמת מולקולה בודדת נחקרה בניסוי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במהלך 30 השנים האחרונות, במיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) התברר להיות טכניקת הדמיה רבת ערך כדי ללמוד 1,2 וסינתטי 3 חומרים ופני שטח ביולוגיים שכן הוא מספק רזולוציה מרחבית מולקולרית בכל שלושת הממדים ויכול להיות מופעל בממס שונים סביבות. בנוסף, כוח מולקולת ספקטרוסקופיה AFM-הורי (SMFS) מאפשרת למדוד כוחות הנעים בין pN לμN משטר ונתנה תובנות חסרות תקדים לדוגמא לחלבון מתקפלות 4,5, פיזיקת פולימר 6-8, ואינטראקציה מולקולה-משטח אחד 9 - 12 רציונל מאחורי .the לומד מולקולות בודדות ולא הרכב של מולקולות הוא להימנע מממוצע השפעות אשר לעתים קרובות להסוות אירועים נדירים או מדינות מולקולריות מוסתרות. יתר על כן, מספר רב של פרמטרים מולקולריים כגון אורך הגובה, אורך Kuhn, אנרגיה חופשית ההידבקות, וכו 'יכול להיותהושג. זה מפורט בדוגמאות שלהלן. בניסוי AFM-SMFS טיפוסי, מולקולת הבדיקה היא מצמידים את קצה חד מאוד באמצעות מולקולה מקשר. טיפ עצמו נמצא בסוף שלוחה bendable. אם הקצה הוא הביא במגע עם פני השטח מולקולת הבדיקה תהיה אינטראקציה עם פני השטח זה. על ידי התבוננות הסטייה של שלוחה על הכחשה של הקצה, הכוח, ולכן האנרגיה החופשית, כדי לנתק את המולקולה מפני השטח ניתן לקבוע. כדי לקבל נתונים סטטיסטיים משמעותיים, מספר רב של מה שנקראו עקומות כוח למרחקים שיירכש. יתר על כן, יש ניסויי מולקולה בודדת אמיתיים (כלומר, שימוש ובעונה אחת מולקולת בדיקה על משך הניסוי כולו) מולקולת הבדיקה צריכה להיות בשילוב קוולנטית לקצה AFM. כאן, פרוטוקול ניסוי לfunctionalization שלוחה עם מולקולה בודדת באמצעות קשר קוולנטי מוצג. המולקולה בודדת או יכולה להיות בשילוב באמצעות אמינו או thioקבוצת l לקצה AFM. התהליך הצמידה יכול להתבצע במגוון רחב של ממסים (אורגניים ומימיים) כדי להסביר את תכונות solvation של הפולימרים המשמשים.

בחלקו הראשון, פרוטוקול כללי לצרף קוולנטית מולקולה בודדת ("מולקולת בדיקה") באמצעות מולקולת מקשר לקצה AFM מתואר. לשם כך, NHS- האורגני או maleimide-הכימיה משמשת 13. יחד עם הפרוטוקול לשלוש מולקולות דוגמא, תהליכי רכישת נתונים וניתוח נתונים מתוארים ואזכור לקריאה נוספת מסופק. מולקולות הדוגמא הן: טירוזין הפולימר (ליניארי), פולימר השתל מלק g -PS והאפיפיור השומנים. זה כולל שינויים קלים של הפרוטוקול, למשל לצרף קוולנטית cysteines. בנוסף, סעיף מוקדש להכנת משטחים שונים כגון משטח יהלום, 3 monolayer התאספו -self CH וbilayers שומנים. יש לי ממשקים אלה proven להיות אזכור טוב ודוגמאות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: ראה איור 2 לסקירה כללית של זרימת ההליך הכוללת את ההכנה, את צעדי רכישת נתונים וניתוח נתונים.

1. הגדרה מגיב

הערה: כל הכימיקלים חייבים להיות מטופל בזהירות, ובכך חלוק מעבדה, יש להשתמש בכפפות ומשקפי מגן. כל הפעולות יש לבצע במנדף מעבדה. בפרט, יש ללבוש כפפות מיוחדות במקרה של שימוש בכלורופורם.

  1. להשתמש בכימיקלים עם תכולת מים נמוכה כגון כלורופורם יבש במהירות ובחנות יבשה אך לא יותר משבוע. אחסן את שני הכימיקלים ב -20 ° C ותחת גז חנקן או ארגון כי (triethoxysilan (3-aminopropyl)) APTES (ראה טבלה 1) וPEG (polyethylenglycol) הם hygroscopic וPEG כפוף לחמצון באוויר.
  2. כדי להימנע מחשיפה תכופה של המניה לחמצן ולחות באטמוספרה, להכין aliquots הקטן יותר, באופן אידיאלי בתוך מערכת תא כפפות עם atmosphe חנקןמחדש.

2. התקנת ציוד

הערה: כדי למנוע זיהום צולב אפשרי, להשתמש בכולים רעננים ונקיים לכל שלב.

  1. כלי זכוכית נקיים ופינצטה בתמיסת סבון למשך 30 דקות באמבטיה קולית ב 60 ° C.
  2. יש לשטוף וציוד sonicate משלב 2.1 פעמיים ביסודיות עם מים ultrapure.
  3. ציוד חום מצעד 2.1 בפתרון RCA (מים ultrapure, מי חמצן ואמוניה (5: 1: 1)) 75 ° C בתנור במשך 45 דקות ולאחר מכן לשטוף אותם עם מים ultrapure.
  4. לבסוף, לייבש את כלי הזכוכית ופינצטה תחת זרם של חנקן יבש או בתנור (100 מעלות צלזיוס, 3 שעות).

3. עצה Functionalization

הערה: פינצטה השימוש, כלי שיט, וכו 'עשויים מפלדת אל-חלד, PTFE, זכוכית או כל חומר אחר שהוא יציב מבחינה כימית בפתרונות אורגניים אם רלוונטי. אלא אם צוין אחרת, לבצע את כל השלבים בRט הסכום של פתרון דגירה דרוש תלוי במספר שבבי שלוחה. ודא שהזיזים שקועים בפתרונות המתאימים בכל הזמן.

הערה: השתמש במכסת מנוע, כדי למנוע שאיפה של אדים אורגניים.

  1. כינונה של OH-קבוצות על פני השטח שלוחה ("הפעלה") (כ 0.5 שעות):
    1. להשתמש בפינצטה כדי למקם את השבבים טריים שלוחה (חומר: SiN, קבוע קפיץ: 10-100 pN / ננומטר) בשקופית זכוכית נקייה ולשים אותם בתא פלזמה (100 W).
    2. לפנות קאמרי (~ 0.1 mbar).
    3. תא מבול עם גז חמצן ולפנות שוב.
    4. הפעל את תהליך הפלזמה (כוח: 20%, משך: 15 דקות, לחץ תהליך: 0.25 mbar).
  2. אמינו-silanization של זיזים (כ 1 שעה):
    1. הכן את 2.5 מיליליטר של תמיסת APTES (ראה טבלה 1) בצלחת פטרי מזכוכית - לעשות באופן אידיאלי זה בתהליך הפלזמה.
    2. Immediately לאחר תהליך הפלזמה, לטבול כל שלוחה 1 שניות באצטון ולמקם אותם מייד לאחר מכן בפתרון APTES.
    3. דגירה במשך 15 דקות ב RT.
    4. לשטוף בזהירות את שבבי שלוחה פעמיים באצטון מיליליטר 10 ופעם אחת ב 10 מיליליטר כלורופורם.
    5. אופציונליים סופי צעד: שבבי שלוחה מקום משלב קודם בשקופית זכוכית נקייה ואופים אותם במשך 30 דקות ב 70 מעלות צלזיוס. שים לב שיש גם אסטרטגיות חלופיות להפעלת משטח, לדוגמא, טיפול UV 12.
  3. PEGylation (כ 2 שעות):
    הערה: לבצע צעדי 3.3.1-3.3.4 במהלך אמינו-silanization. NHS וקבוצות maleimide כפופים להידרוליזה בסביבות מימיות וPEG עצמו כפוף לחמצון באוויר. לכן תזמון (בבמיוחד בין המדרגות) הוא פרמטר קריטי. עיין 13 למידע נוסף.
    1. הכן את פתרון כלורופורם (ראה טבלה 1).
    2. כדי למנוע התעבות, PEG החם אבקות עד RT לפני פתיחת aliquot ומשקל את הכמות המתאימה.
    3. לצימוד של פולימרים או שומנים עם קבוצות אמינו, בנפרד לפתור NHS-PEG-NHS (6 KDA) ותיל-PEG-NHS (5 KDA) בפתרון כלורופורם על ידי vortexing עד שהם פתרו לחלוטין. עיין בטבלת 1 לריכוזים.
      1. לחלופין. לצימוד של פולימרים עם קבוצות תיאול בנפרד לפתור Mal-NHS- PEG ומהתיל-PEG-NHS בפתרון כלורופורם.
    4. מערבבים את הפתרונות כנדרש כדי להתאים את יחס בין מספר מסוים NHS- או maleimide- והמולקולות מתיל-הופסק PEG (בדרך כלל 1: 500). שים לב שהיחס האידיאלי צריך להיות נחוש איטרטיבי בסדרה של מחזורי הכנה-ניסוי.
    5. דגירה שבבי שלוחה בפתרון PEG עבור שעה 1 באווירה רוויה כלורופורם על מנת למנוע אידוי של כלורופורם.
  4. לחקור נטיית מולקולה(Hr> 1):
    הערה: ב3.4.1-3.4.3 הבאים, שלוש דוגמאות לצימוד קוולנטיים של מולקולות בדיקה שונות ועד לקצה AFM מתוארות. לכל מולקולה הפרוטוקול צריך להיות מותאם. עוד יצוין, כי בדוגמא 1 ו -3 NHS-כימיה משמש ואילו בדוגמא 2 -PS g מלק פולימר תיאול פונקציונליות הוא מצמידים את PEG באמצעות maleimide-כימיה. לפרטים ראו 14.
    1. לפולי (חומצת אמינו) פולי-D-טירוזין (40-100 KDA)
      1. ממיסים את מולקולת הבדיקה polytyrosine מצומדות ב 1 M NaOH. התאם את הריכוז ל1 מ"ג / מיליליטר.
      2. להחליף NaOH לחיץ borate נתרן (pH 8.1) באמצעות עמודות desalting הספין (7 kDa MWCO) מייד לפני functionalization
      3. יש לשטוף את הזיזים ראשון עם 5 מיליליטר של כלורופורם, ולאחר מכן עם 5 מיליליטר של אתנול וסופו של דבר עם 5 מיליליטר של חיץ borate.
      4. דגירה שבבי שלוחה עבור שעה 1 בפתרון חיץ borate polytyrosine ולאחר מכן לשטוף עם חיץ borateומים ultrapure. אחסן במי ultrapure עד המדידה.
    2. עבור פולימרים עם עמוד שדרה ליניארי (polyisoprene, 119 KDA) יש רשתות בצד מורכבים (קלקר, 88 KDA) 14
      1. ממיסים את מלק g -PS בכלורופורם יבש. התאם את הריכוז של פתרון נטיה ל4 מ"ג / מיליליטר.
      2. יש לשטוף את הזיזים עם 5 מיליליטר של כלורופורם דגירה במשך שעה לפחות 1 בפתרון הצמידה.
      3. יש לשטוף שוב ב 5 מיליליטר של כלורופורם ולאחסן בכלורופורם בסביבה רווי כלורופורם (כדי למנוע אידוי כלורופורם) עד המדידה.
    3. לאפיפיור השומנים
      1. לפזר אפיפיור בכלורופורם יבש. התאם את הריכוז עד 20 מ"מ.
      2. יש לשטוף את הזיזים עם 5 מיליליטר של אתנול ו 5 מיליליטר של מים ultrapure לפני הדגירה של הזיזים עבור שעה 1 בפתרון השומנים.
      3. לאחר דגירה, לשטוף זיזים עם 5 מיליליטר של כלורופורם, 5 מיליליטר של ethanol ו -5 מיליליטר של מים חמים, ultrapure (לפי סדר זה) כדי להסיר מולקולות בדיקה מאוגד ולהיפטר משאריות כלורופורם. השתמש בעצות פונקציונליות באופן מיידי. לחלופין, לאחסן אותם בכלורופורם עד צורך.

figure-protocol-1
איור 1. (א) סכמטי המציג את תהליך functionalization קצה באמצעות הדוגמא של הכימיה NHS. קשר כימי (B) מועסק לצרף מולקולת בדיקה לקצה באמצעות קבוצת אמינו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

הכנת 4. Surface

  1. monolayer התאסף עצמי (SAM)
    הערה: כמשטח לדוגמא הראשונה, monolayer עצמי התאספו נבחר. עיין בספרות 15
  2. שקופיות זכוכית נקיות עם תמיסת סבון ולאחר מכן פעמיים במי ultrapure באמבטיה קולית במשך 30 דקות כל אחד. ואז, כצעד ניקוי נוסף, מניח אותם בפתרון RCA (ראה שלב 2.3) בשעה 75 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
  3. מעיל השקופיות עם 10 ניקל כרום ננומטר ו -100 ננומטר זהב בcoater ואקום. לאחר מכן לאחסן במקרר והנקי שוב בפתרון RCA ישירות לפני השלב הבא.
  4. דגירה השקופיות של השלב הקודם בפתרון 2 1-dodecanthiol / אתנול מ"מ לשעה 12. קבוצות תיאול להיקשר למשטח הזהב וmonolayer עצמי הידרופובי מרכיב. יש לשטוף את השקופיות עם אתנול ומים ultrapure ולאחר מכן יבש על ידי זרם של גז חנקן. לאשר את הידרופוביות של פני השטח מוכנים עם מדידות זווית מגע סטטי במד זוית עם מצלמת CCD 10.
  • יהלומים הופסקו מימן
    הערה: כמשטח לדוגמא השנייה, יהלומים הופסקו מימן נבחר. הכנת השטח בוצעה כפי שתואר קודם לכן 16.
  • bilayer שומנים נתמך
    הערה: בדוגמא האחרונה, bilayer שומנים משטח נתמך (SLB) שימש כמשטח. כדי להשיג משטח כזה, פתרון (0.1 מ"ג / מיליליטר) של שלפוחית ​​הגדולה unilamellar (LUVs) בהיקף של POPC פוספוליפידים נוצרו על ידי שיטת שחול. אז 50 μl של פתרון LUV הועלה על גיליון טרי ביקע נציץ (= סמ"ר 1) וטופחו במשך 30 דקות. לבסוף הפתרון נשטף עם 20 מיליליטר של מים ultrapure. ראה 17,18 לתיאור מפורט של הכנת SLBs.

    • 5. Data Acquisition

    הערה: לניסויים, להשתמש AFM, אשר מספק את היכולת למדוד בנוזלים. נהלי רכישת נתונים וניתוח נתונים חלים ללא קשר למודל AFM בשימוש. יתר על כן, בכמה ניסויים זה יתרון שיש לי האפשרות לשלוט temperaturדואר בתוך נוזל התא. סטיית שלוחה זוהתה באמצעות שיטת סטיית קרן לייזר 19. קבועי האביב נקבעו בשיטת הרעש התרמית 20.

    1. הכנס את שלוחה פונקציונליות לבעל שלוחה AFM אשר מתאים למדידה בנוזלים.
    2. שים את פני השטח (הכנה ראה לעיל) שנדגמו לAFM ולכסות אותו עם נוזל. שני, שלוחה ושטח צריכה עכשיו להיות שקועים בנוזל עם קצה שלוחה מצביע לעבר פני השטח. שים לב כי במקרים רבים טיפת הנוזל היא מספיק. בכל מקרה אידוי של הנוזל יש להימנע, למשל, על ידי שימוש בתא נוזל סגור.
    3. במידת צורך, להתאים את הטמפרטורה רצויה בבקר.
    4. תן למערכת לאזן במשך לפחות חצי שעה.
    5. להקליט ספקטרום רעש תרמי של שלוחה עם שלוחה רחוקה מפני השטח כדי לשלול כל משטח דעיכת תופעות. שימו לב שבדרך כלל 10 או יותר ספקטרום צריך להיות שהצטבר לקבל יחס אות לרעש מספיק.
    6. מתקרב למשטח. שים לב כי על מנת לחסוך בfunctionalization גיאומטריה קצה וקצה תהליך הגישה צריכה להתבצע בזהירות. זה יכול להיות מושלם על ידי, למשל, מתקרב במצב מגע לסירוגין.
    7. לקבוע את הרגישות ההפוכה האופטית המנוף (InvOLS) נמדדה בננומטר / וולט. לעשות זאת על ידי לחיצה על קצה שלוחה כנגד משטח קשה.
      1. לקבוע את InvOLS על ידי מדידת שיפוע מרחק הנסיעה piezo לעומת השינוי במתח photodiode. להתאים קו לחלק של עקומת כוח-המרחק שבו קצה שלוחה הוא במגע עם המשטח. בניסויים הכוללים משטח רך כמו bilayers שומנים בדם, לבצע את הצעד הזה באזורים שאינם מכוסים בbilayer שומנים ("כתמי פגם").
    8. לקבוע את קבוע הקפיץ (PN / ננומטר) על ידי התאמת מתנד הרמוני לספקטרום הרעש התרמי. שימושאוטומטי פונקצית תוכנה לקביעת קבוע קפיץ; אחרת להתייעץ ספרות 20.
    9. להתחיל את הניסוי.
      1. עקומות כוח-מרחק רב שיא בכל תנאי ניסוי. בדרך כלל, להשתמש בערכים הבאים עבור הפרמטרים הניסיוניים: קצב דגימה של kHz 5, מהירות קצה של מיקרומטר 1 / sec, לחזור בו ממרחק של 1 מיקרומטר.
        הערה: לפעמים, תלוי בדינמיקה של הניסוי למד, ייתכן שיהיה צורך להמתין זמן מסוים עם הקצה במגע עם פני השטח ('להתעכב זמן ").
        הערה: ניסוי פרמטרים ספציפיים יכולים לסטות באופן משמעותי מהערכים שניתנו לעיל.
      2. במהלך מדידות טווח ארוכות, אפס עמדת הלייזר על photodiode מעת לעת על ידי למקם מחדש את photodiode.
      3. אופציונאלי: אחרי כל עקומת כוח, מיקום מחדש של AFM-הקצה לעמדת xy אחר.
      4. בסופו של הניסוי, לקבוע את הרגישות והאביב constant שוב כדי לבדוק עקביות ויציבותה של המערכת.
        הערה: השוואת קבוע הקפיץ ורגישות לפני ואחרי הניסוי היא גם אמצעי להבטיח כי התכונות של המערכת ואת המאפיינים של הקצה נותר ללא שינוי במהלך הניסוי. אם ההבדל של קבועי האביב הוא לא גדול מדי (<= 15%), הם יכולים להיות בממוצע, מאז חוסר הוודאות הפנימית של קביעת קבוע קפיץ הוא גם סביב 15%. להבדלים גדולים יותר, כדאי הראשון למצוא ולחסל את הגורם לשינוי קבוע קפיץ לכאורה לפני שתמשיך בניסויים נוספים.

    6. נתונים הכנה

    הערה: בשלבי הכנת נתונים זה סעיף כללי המתבצעים בדרך כלל עצמאית של הסוג המסוים של ניסוי להמיר יחידות לניוטון וננומטר, כמו גם לתקן את הנתונים שתוארו. ניתוחי נתונים הספציפיים הניסוי הם briefly מתואר להלן בסעיף הדוגמא המייצג בהתאמה.

    1. בדרך כלל, לבצע את כל ההכנה וניתוח של הנתונים על השלבים באופן אוטומטי על ידי אלגוריתם בית-כתוב, למשל, מבוסס על תוכנת איגור Pro 6.
    2. להמיר את אות גלם הסטייה (Defl) [V] לתוקף על ידי הכפלתו עם InvOLS [nm / V] והאביב [NN / nm] קבוע.
    3. לקזז את הכוח באופן כזה שהכח על שלוחה במרחק מספיק מהשטח (שלוחה פרקה) הופך 0 NN.
    4. לחשב את מיקום קצה בפועל (הפרדה המכונות גם כאשר נמדדו ביחס למשטח) * z, אשר לוקח את הכיפוף של שלוחה בחשבון:
      figure-protocol-2
    5. קיזוז * z באופן כזה שz * = 0 המתאים למצב z של פני השטח.
      הערה: הנה, F הוא הכוח הפועל על עיקול הקצה ומכאןזה שלוחה (שנקבע בשלב 6.2.), z היא עמדת z-החיישן שנמדדה (הניתנת ישירות על ידי המכשיר) וk מייצג את קבוע הקפיץ (שנקבע בשלב 5.8).

    figure-protocol-3
    איור זרימת תרשים 2. תהליך המראה את הכנת המדגם, רכישת נתונים וניתוח נתונים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    תוצאות

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    בחלק הבא, התוצאות עבור מעל מתוארות מולקולות דוגמא, כלומר polytyrosine פולי פולימרים (חומצת אמינו), פולימר השתל מלק g -PS והאפיפיור פוספוליפידים, מוצגים. ראשית לכל דוגמא, להתנסות פרטים ספציפיים לרכישת נתונים והכנת הנתונים מסופקים. לאחר מכן, תוצאות המופת לניסויים שבם מולקולות אלה desorbed ממשטחים שונים (CH 3 -SAMs, bilayers יהלומים ושומני מימן הסתיים) מוצגות. נחישותו של כוח ההידבקות, אורך ההידבקות והאנרגיה החופשית הם הציגו.

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    דיון

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    במהלך העשורים האחרונים, ניסויי מולקולה בודדים סיפקו תובנות חסרות תקדים לתוך מנגנונים מולקולריים והתבררו להיות גישה לא יסולא בפז בתחום מדעי חיים ומעבר. כדי להשיג נתונים סטטיסטיים טובים ומשמעותיים מניסויי SMFS, באופן אידיאלי ובעונה אחת המולקולה משמשת מעל כל מהלך הניסוי. בניגוד לניסויים בהרכבים של מולקולות, ניסויי SMFS מסוגלים לזהות אירועים נדירים ומדינות מולקולריות מוסתרות. יתרון נוסף של ניסויי מולקולה בודדים הוא שהם יכולים להיות מודל באמצעות סימולציות דינמיקה מולקולריות ...

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    גילויים

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

    תודות

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    המחברים מודים ל-DFG (Hu 997/2-2) על התמיכה הכספית. FS מכיר בקרן הנס-זיידל (HSS). SKr נתמך על ידי Elitenetzwerk Bayern במסגרת תוכנית הדוקטורט Material Science of Complex Interfaces. SKi מודה ל-SFB 863 על התמיכה הכספית.

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    חומרים

    רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
    שםחברהמספר קטלוגהערות
    <חזק>חומרים
    תרכיז נוזלי אלקליין של Hellmanex III (תמיסת דטרגנטים)Hellma
    RCA (מים טהורים במיוחד, מי חמצן (35%), אמוניה (32%); 5:1:1(v/v/v)))מגיב סיגמא
    וקטבונד / APTES (3-אמינופרופיל)triethoxysilaneVectorlabs
    אצטון יבש (< 50 ppm H< sub>2O)סיגמא
    כלורופורם יבש (> 99.9%)סיגמא
    טריאתילאמיןסיגמא
    מים טהורים במיוחדביוכרום, גרמניה
    די-נתרן טטרבוראט (>  99.5%)ביוכרום, גרמניה
    חומצה בוריתביוכרום, גרמניה
    חד פונקציונלי &אלפא;-מתוקסי-ואומגה;-NHS PEG, 5 kDa, " מתיל-PEG-NHS"Rapp, גרמניה
    Heterobifunctional α,ω-bis-NHS PEG, 6  kDa, " NHS-PEG-NHS"Rapp, גרמניה
    Heterobifunctional α-maleimidohexanoic- ω-NHS PEG, 5 kDa, " Mal-PEG-NHS"ראפ, גרמניה
    מולקולת בדיקה (פולימר, שומנים, etc.)<
    כמות מספקת של כלי התגבשות זכוכית עם פיה (10  מ"ל), צלחות פטרי מזכוכית (500 ומיקרו; l) ומכסי זכוכיתVWR International GmbH, Germany
     
     
     
     
     
     
    [header]
    תנור מעבדה דגם UF30Memmert, גרמניה
    סוניקטור מבוקר טמפרטורהVWR International GmbH, גרמניה
    מערכת פלזמה "Femto", 100 WDiener, גרמניה
    מזרק זכוכית נפרד אחד לכל ממס אורגניVWR International GmbH, גרמניה
    מערבולת מיקסרVWR International GmbH, גרמניה
    צינורות מיקרוצנטריפוגה (0.5 מ"ל או 1.5 מ"ל)אפנדורף
    : 10-100 ומיקרו; l, 50-200 ומיקרו; l ו-100-1,000  ומיקרו; lEppendorf
    AFM עם תא נוזל מבוקר טמפרטורה (למשל MFP-3D עם BioHeater)Asylulm Research, סנטה ברברה
    Soft SiN ctellevers cantilevers, עשוי בדרך כלל מסיליקון ניטריד (SiN) (קבוע קפיץ פחות מ-100 pN/nm, למשל MLCT)Bruker AXS, סנטה ברברה
    td colspan="4"><חזק>ציודפיפטות

    מקורות

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Scheuring, S., Sapra, K., Müller, D. Probing Single Membrane Proteins by Atomic Force Microscopy. Handbook of Single-Molecule Biophysics. , 449-485 (2009).
    2. Kodera, N., Yamamoto, D., Ishikawa, R., Ando, T. Video imaging of walking myosin V by high-speed atomic force microscopy. Nature. 468 (7320), 72-76 (2010).
    3. Magonov, S. N. Atomic Force Microscopy in Analysis of Polymers. Encyclopedia of Analytical Chemistry. , (2006).
    4. Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. Sequence-dependent mechanics of single DNA molecules. Nature Structural Biology. 6 (4), 346-349 (1999).
    5. Li, H., Linke, W. a, et al. Reverse engineering of the giant muscle protein titin. Nature. 418 (6901), 998-1002 (2002).
    6. Bustamante, C., Smith, S. B., Liphardt, J., Smith, D. Single-molecule studies of DNA mechanics. Current opinion in structural biology. 10 (3), 279-285 (2000).
    7. Zhang, W., Zhang, X. Single molecule mechanochemistry of macromolecules. Progress in Polymer Science. 28 (8), 1271-1295 (2003).
    8. Hugel, T., Rief, M., Seitz, M., Gaub, H., Netz, R. Highly Stretched Single Polymers: Atomic-Force-Microscope Experiments Versus Ab-Initio Theory. Physical Review Letters. 94 (4), 048301(2005).
    9. Stetter, F. W. S., Cwiklik, L., Jungwirth, P., Hugel, T. Single Lipid Extraction - The Anchoring Strength of Cholesterol in Liquid Ordered and Liquid Disordered Phases. Biophysical journal. 107 (5), (2014).
    10. Pirzer, T., Hugel, T. Adsorption mechanism of polypeptides and their location at hydrophobic interfaces. Chemphyschem. 10 (16), 2795-2799 (2009).
    11. Butt, H. -J., Cappella, B., Kappl, M. Force measurements with the atomic force microscope: Technique, interpretation and applications. Surface Science Reports. 59 (1-6), 1-152 (2005).
    12. Nash, M. A., Gaub, H. E. Single-Molecule Adhesion of a Copolymer to Gold. ACS NANO. 6 (12), 10735-10742 (2012).
    13. Hermanson, G. Bioconjugate Techniques. , Academic Press. New York. (1996).
    14. Kienle, S., et al. Effect of molecular architecture on single polymer adhesion. Langmuir the ACS journal of surfaces and colloids. 30 (15), 4351-4357 (2014).
    15. Folkers, J. P., Laibinis, P. E., Whitesides, G. M. Self-assembled monolayers of alkanethiols on gold: comparisons of monolayers containing mixtures of short- and long-chain constituents with methyl and hydroxymethyl terminal groups. Langmuir. 8 (5), 1330-1341 (1995).
    16. Dankerl, M., et al. Diamond Transistor Array for Extracellular Recording From Electrogenic Cells. Advanced Functional Materials. 19 (18), 2915-2923 (2009).
    17. Leonenko, Z. V., Carnini, A., Cramb, D. T. Supported planar bilayer formation by vesicle fusion: the interaction of phospholipid vesicles with surfaces and the effect of gramicidin on bilayer properties using atomic force microscopy. Biochimica et biophysica acta. 1509 (1-2), 131-147 (2000).
    18. Stetter, F. W. S., Hugel, T. The Nanomechanical Properties of Lipid Membranes are Significantly Influenced by the Presence of Ethanol. Biophysical Journal. 104 (5), 1049-1055 (2013).
    19. Putman, C. A. J., De Grooth, B. G., Hulst, N. F., Greve, J. A detailed analysis of the optical beam deflection technique for use in atomic force microscopy. Journal of Applied Physics. 72 (1), 6-12 (1992).
    20. Hutter, J. L., Bechhoefer, J. Calibration of atomic-force microscope tips. Review of Scientific Instruments. 64 (7), 1868(1993).
    21. Krysiak, S., Liese, S., Netz, R. R., Hugel, T. Peptide desorption kinetics from single molecule force spectroscopy studies. Journal of the American Chemical Society. 136 (2), 688-697 (2014).
    22. Li, I. T. S., Walker, G. C. Interfacial free energy governs single polystyrene chain collapse in water and aqueous solutions. Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6530-6540 (2010).
    23. Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Theory, analysis, and interpretation of single-molecule force spectroscopy experiments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15755-15760 (2008).
    24. Stetter, F. W. S., Cwiklik, L., Jungwirth, P., Hugel, T. Single Lipid Extraction: The Anchoring Strength of Cholesterol in Liquid-Ordered and Liquid-Disordered Phases. Biophysical Journal. 107 (5), 1167-1175 (2014).
    25. Horinek, D., et al. Peptide adsorption on a hydrophobic surface results from an interplay of solvation, surface, and intrapeptide forces. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (8), 2842-2847 (2008).
    26. Ebner, A., et al. Functionalization of probe tips and supports for single-molecule recognition force microscopy. Topics in current chemistry. 285 (April), 29-76 (2008).
    27. Geisler, M., Balzer, B. N., Hugel, T. Polymer Adhesion at the Solid-Liquid Interface Probed by a Single-Molecule Force Sensor. Small. 5 (24), 2864-2869 (2009).
    28. Morfill, J., et al. Affinity-matured recombinant antibody fragments analyzed by single-molecule force spectroscopy. Biophysical journal. 93 (10), 3583-3590 (2007).

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    הדפסות חוזרות והרשאות

    בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

    בקש הרשאה

    תגיות

    AFM

    מאמרים קשורים