הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

פגיעה כלי מכאנית בעוברי דג הזברה

7.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/52460

⸱

17 בפברואר 2015

 , 
1Cardiovascular Research Institute, University of California

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מתאר שיטה ליצירת פגיעה מכנית בכלי דם בעוברי דג זברה. מודל פציעה זה מספק פלטפורמה לחקר המוסטזיס, דלקת הקשורה לפציעה וריפוי פצעים באורגניזם המתאים באופן אידיאלי למיקרוסקופיה בזמן אמת.

תקציר

עוברי דג הזברה (Danio rerio) הוכיחו את עצמם כמודל רב עוצמה לחקר מגוון תהליכי התפתחות ומחלות. התפתחות חיצונית ושקיפות אופטית הופכים את העוברים הללו למתאימים במיוחד למיקרוסקופיה, וקווים טרנסגניים רבים המתייגים סוגי תאים ספציפיים עם חלבונים פלואורסצנטיים זמינים, מה שהופך את עובר דג הזברה למערכת אידיאלית להמחשת האינטראקציה בין סוגי תאים כלי דם, המטופואטיים ואחרים במהלך פציעה ותיקון in vivo. גנטיקה קדימה ואחורה בדגי הזברה מפותחת היטב, ומניפולציה פרמקולוגית אפשרית. אנו מתארים מודל פגיעה מכנית בכלי הדם באמצעות טכניקות מיקרומניפולציה המנצלות כמה מהתכונות הללו כדי לחקור תגובות לפגיעה בכלי הדם כולל המוסטזיס ותיקון כלי דם. באמצעות שילוב של וידאו ומיקרוסקופ זמן-lapse, אנו מדגימים כי שיטה זו של פגיעה בכלי הדם מביאה לתגובות מדידות וניתנות לשחזור במהלך המוסטזיס ותיקון פצעים. שיטה זו מספקת מערכת לחקר פגיעה ותיקון כלי דם בפירוט במודל של בעל חיים שלם.

מבוא

דג הזברה שימש באופן נרחב לחקר מגוון נושאים בביולוגיה של כלי הדם, כולל התפתחות כלי דם, אנגיוגנזה והתפתחות המטופויאטית ופתולוגיה1-3. עוברים מפתחים מחזור דם תפקודי כמו גם לויקוציטים ומרכיבים אחרים של מערכת החיסון המולדת עד יום אחד לאחר ההפריה (dpf) 1,4,5. שימור התגובה הדלקתית והלויקוציטים לפציעה הפך את עובר דג הזברה למודל אינפורמטיבי לתהליכים דלקתיים מגוונים כמו זיהום שחפת, דלקת מעיים והתחדשות רקמות6-9. עוברי דג הזברה שימשו לחקר דלקת הקשורה לפציעה, במיוחד בהקשר של פציעת אפיתל ותגובת הנויטרופילים10,11. פגיעה בעובר גורמת לתגובה תאית שמורה מאוד מהתאים באתר הפגיעה ותאי החיסון המולדים המגויסים להגיב לפגיעה ולווסת את רזולוציה11,12. מודלים אחרים של פגיעות השתמשו בפולסי לייזר ממוקדים כדי למקם מרחבית פגיעה בסוגי תאים ספציפיים כולל נוירונים, תאי שריר וקרדיומיוציטים13-15.

עוברי דג הזברה שימשו כמודל לחקר המוסטזיס ופקקת בתנאים של מניפולציה פרמקולוגית וגנטית, תוך שימוש בהיווצרות פקקת מכנית ולייזר16-19. נראה כי מרכיבי מפל הקרישה השתמרו היטב וטרנסגניקה אפשרה מחקרים מפורטים של שקיעת טרומבוציטים ופיברין באתר הקרישה17,20,21. הנוהל המוצג במאמר זה משלים את השיטות הללו על ידי מתן מערכת לחקר פגיעה בכלי דם מכניים וכתוצאה מכך פריצת כלי דם, היווצרות פקקת ופתרון כלי דם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: נהלי שימוש בדג זברה אושרו על ידי הטיפול בבעלי חיים המוסדי של קליפורניה בסן פרנסיסקו וועדת שימוש.

1. הכנת כלים

  1. הכנס סיכת פרטים קטנה לבעל סיכה ומהדק את הסיכה.
  2. בעזרת מלקחיים טיפ נאה, לכופף בזהירות את קצה הפין כדי ליצור וו קל.
  3. למניפולציה וייצוב של העובר במהלך פציעה, תכופף את הקצה של מד 28 ½ מחט אינץ 'רכובה על מזרק אינסולין באמצעות צבת מחט-האף.

2. הכנת עוברי דג הזברה לפגיעה

  1. הגדרת זוגות רבייה דג הזברה ולאסוף ביצים במי ביצה (60ug / מלחי אקווריום מ"ל) כפי שהוצג קודם 22.
  2. להוסיף 0.003% N-Phenylthiourea (PTU) למים ביצה כאשר הם עובר כ -8 שעות לאחר הפריה (hpf) כדי למנוע melanization.
  3. עובר dechorionate שתי פוסט יום הפריה (DPF) לפני הניסוי באמצעות מלקחיים טיפ נאה.
    הערה: ניתן נפצע עוברים בכל עת לאחר שהמחזור מתחיל. הנתונים המוצגים כאן הוא עבור 2 DPF עוברים, אך הטכניקה יושמה בהצלחה בעוברים עד 5 DPF.
  4. להרדים את העוברים עם 0.02% חומצה שנאגרו 3-aminobenzoic (Tricaine) כ 10 דקות לפני מניפולציות.

3. כלי מכניים פגיעה של עוברים

  1. העבר את העוברים בהרדמה לשקופית דיכאון בסטראו לנתח באמצעות pipet העברה.
  2. בצד החלק הקצר של מחט המזרק כדי לתפעל את העובר עם היד הדומיננטית, למקם את העובר בצד שלה עם משטח הגחון מול מן המחט.
  3. מקם את הפינים הפרטים הקטנים עם הקצה מחודד ישירות על משטח הגחון של הדגים האחוריים לפתיחה ואברי המין. מקם את הפינים פרטים הקטנים בזווית קלה, כך שהקצה המעוגל הוא מסוגל לחדור מבעד periderm ישירות לוריד הזנב (איור 1 </ Strong>).
  4. שימוש במחט המזרק כדי לתפעל את העובר, לנקב את וריד הזנב עם סיכת הפרטים הקטנה על ידי הקשה על העובר לסיכה להתחבר הסיכה לתוך הווריד מעט.
  5. שימוש במחט המזרק, למשוך את העובר מפיני הפרטים הקטנים כדי ליצור קרע קטן בכלי.
    הערה: פגיעה מוצלחת תגרום לדימום מיידי מהווריד.

4. ניתוח של עצירת דימום

  1. בחר עוברים רק עם בעליל תאי דם להליך זה.
  2. הכן להתחיל את הטיימר בהקדם סיכת הפרטים הקטן היא משכה מהספינה.
  3. להפעיל את הטיימר בהקדם איבוד דם יכול להיות דמיין מהפצע. כאשר איבוד דם מהפצע מפסיק, לעצור את שעון העצר ולהקליט זמן כולל שזמן דימום. אם הקרישה היא עכבות, להקליט את הזמן כאשר יש כבר לא נראה תאי דם במחזור.

5. ניתוח של ריפוי פצעים

  1. העברת קופהבעלי חיים לא-פגיעה על מנות הדמיה זכוכית תחתונה למיקרוסקופיה.
  2. הסר את רוב המים הביצה.
  3. מכסה את העוברים ב.3-1.2% התכה נמוכה המומסים agarose במי ביצה, מחוממים לבין 42 ו -45 מעלות צלזיוס ותוספת של 0.02% Tricaine.
  4. עוברי עמדה על צדם באמצעות מלקחיים.
  5. לאחר agarose מתקרר, למלא את הצלחת עם Tricaine 0.02% במי ביצה.
  6. לרכוש תמונות באמצעות brightfield, epifluorescence, או confocal.
  7. הסר עובר מן agarose באמצעות מלקחיים ולהעביר חזרה למי ביצה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

פגיעת כלי מכאנית בוצעה על 2 DPF עוברים (איור 2 א - ג). תוצאות פציעה בתגובת קרישה מהירה ואמינה, כפי שנמדדו על ידי זמן הפסקת דימום (איור 2 ד). כדי לקבוע אם או לא הבדלים בתגובת הקרישה ניתן היו למדוד, הירודין נוגד הקרישה היה מנוהל לעוברים על ידי הזרקה לתוך Duct של קיביה מייד לפני פציעתם (5-10 NL של יחידה 1 לμl הירודין מומס במים) (ל הפגנה של זריקות לDuct של קיביה, ראה מאמר יופיטר קודם 23) 24. הממשל של הירודין לפני פציעה גרם ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

דג הזברה שימשה בהצלחה כמודל לסוגים שונים של פצעים כולל פציעת לייזר 13-15, פקקת מושרה לייזר 16, ופצע 10 אפיתל. אנו מדווחים על שיטה של פציעה מכאנית שהיא פשוט לביצוע ומייצר פציעה מבוקרת במודל in vivo כי הוא נוח מאוד למיקרוסקופיה בזמן אמת. תוצאות פציעה בתגובה לעצרת דם מהירה וניתן למדידה ותכנית תיקון פצע שחזור שניתן לנטר באמצעות מיקרוסקופ וידאו וtimelapse.

האנטומיה שלהם פשוטה ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

המחברים רוצים להודות לד"ר סטיבן וילסון וליסה וילסבאכר על הדיונים המועילים. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי NIH HL054737.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Minutia PinsFine Science Tools26002-10קוטר קצה 0.0125 מ"מ, קוטר מוט 0.1 מ"מ
מחזיק סיכותFine ScienceTools 26016-12
Dumont #5 מלקחיים עם קצה עדיןכלים מדעיים עדינים11254-20
זכוכית שקע שקופיתאקולוגית מימיתM30
נמוכה נמס אגרוזלונזה 50081מחומם מראש ל-42 º C
N-Phenylthiourea (PTU)Sigma AldrichP7629
3-aminobenzoic acid (Tricaine)Sigma AldrichE10521
HirudinSigma AldrichH7016
כלי הדמיה תחתוניםמזכוכית MattekP35G-1.5-14-C
מיקרוסקופ ניתוחאולימפוסSZH10
מיקרוסקופ פלואורסצנטימלחיAxio Observer
אוקיינוס
עם מחט 28.5 גרםבקטון דיקינסון 
אקווריום Zeiss מזרק אינסולין מיידי329461

מקורות

  1. Gore, A. V., Monzo, K., Cha, Y. R., Pan, W., Weinstein, B. Vascular development in the zebrafish. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (5), a006684(2012).
  2. Boatman, S., et al. Assaying hematopoiesis using zebrafish. Blood Cells Mol Dis. 51 (4), 271-276 (2013).
  3. Ellett, F., Lieschke, G. J. Zebrafish as a model for vertebrate hematopoiesis. Curr Opin Pharmacol. 10 (5), 563-570 (2010).
  4. Liu, J., Stainier, D. Y. Zebrafish in the study of early cardiac development. Circ Res. 110 (6), 870-874 (2012).
  5. Traver, D., et al. The zebrafish as a model organism to study development of the immune system. Adv Immunol. 81, 253-330 (2003).
  6. Lieschke, G. J., Trede, N. S. Fish immunology. Curr Biol. 19 (16), R678-R682 (2009).
  7. Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Curr Opin Microbiol. 11 (3), 277-283 (2008).
  8. Oehlers, S. H., et al. A chemical enterocolitis model in zebrafish larvae that is dependent on microbiota and responsive to pharmacological agents. Dev Dyn. 240 (1), 288-298 (2011).
  9. Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends Genet. 29 (11), 611-620 (2013).
  10. LeBert, D. C., Huttenlocher, A. Inflammation and wound repair. Semin Immunol. , (2014).
  11. Henry, K. M., Loynes, C. A., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. Zebrafish as a model for the study of neutrophil biology. J Leukoc Biol. 94 (4), 633-642 (2013).
  12. Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459 (7249), 996-999 (2009).
  13. Rosenberg, A. F., Wolman, M. A., Franzini-Armstrong, C., Granato, M. In vivo nerve-macrophage interactions following peripheral nerve injury. J Neurosci. 32 (11), 3898-3909 (2012).
  14. Otten, C., Abdelilah-Seyfried, S. Laser-inflicted injury of zebrafish embryonic skeletal muscle. J Vis Exp. (71), e4351(2013).
  15. Matrone, G., et al. Laser-targeted ablation of the zebrafish embryonic ventricle: a novel model of cardiac injury and repair. Int J Cardiol. 168 (4), 3913-3919 (2013).
  16. Jagadeeswaran, P., Carrillo, M., Radhakrishnan, U. P., Rajpurohit, S. K., Kim, S. Laser-induced thrombosis in zebrafish. Methods Cell Biol. 101, 197-203 (2011).
  17. Vo, A. H., Swaroop, A., Liu, Y., Norris, Z. G., Shavit, J. A. Loss of fibrinogen in zebrafish results in symptoms consistent with human hypofibrinogenemia. PLoS One. 8 (9), e74682(2013).
  18. Liu, Y., et al. Targeted mutagenesis of zebrafish antithrombin III triggers disseminated intravascular coagulation and thrombosis, revealing insight into function. Blood. , (2014).
  19. Jagadeeswaran, P., Liu, Y. C. A hemophilia model in zebrafish: analysis of hemostasis. Blood Cells Mol Dis. 23 (1), 52-57 (1997).
  20. Jagadeeswaran, P., Gregory, M., Day, K., Cykowski, M., Thattaliyath, B. Zebrafish: a genetic model for hemostasis and thrombosis. J Thromb Haemost. 3 (1), 46-53 (2005).
  21. Lin, H. F., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106 (12), 3803-3810 (2005).
  22. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
  23. Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. J Vis Exp. (61), (2012).
  24. Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P. Analysis of blood coagulation in the zebrafish. Blood Cells Mol Dis. 25 (3-4), 3-4 (1999).
  25. Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132 (23), 5199-5209 (2005).
  26. Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat Immunol. 4 (12), 1238-1246 (2003).
  27. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev Biol. 248 (2), 307-318 (2002).
  28. Renshaw, S. A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  29. Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Dev Biol. 7, 48(2007).
  30. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).
  31. Gray, C., et al. Simultaneous intravital imaging of macrophage and neutrophil behaviour during inflammation using a novel transgenic zebrafish. Thromb Haemost. 105 (5), 811-819 (2011).
  32. Bellido-Martin, L., Chen, V., Jasuja, R., Furie, B., Furie, B. C. Imaging fibrin formation and platelet and endothelial cell activation in vivo. Thromb Haemost. 105 (5), 776-782 (2011).
  33. Bielczyk-Maczynska, E., et al. A loss of function screen of identified genome-wide association study Loci reveals new genes controlling hematopoiesis. PLoS Genet. 10 (7), e1004450(2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Time Lapse
פגיעה כלי מכאנית בעוברי דג הזברה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.