דור של אגרגטים תא Murine לב קוצב לב בהתבסס על ES-Cell-תכנות בשילוב עם Myh6-יזם-בחירה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר כיצד לייצר רקמת קטרי פונקציונלית סינוס מתאי גזע עכבריים pluripotent (PSC). T-Box3 ביטוי יתר (TBX3) בתוספת מבחר אנטיביוטי אמרגן שרירן-כבד-שרשרת לב (Myh6) מוביל לאגרגטים תא קוצב לב טהורים מאוד. אלה "הנוצרים על-sinoatrial-גופים" ("iSABs") מכילים מעל 80 תאי קוצב%, להראות גדלו מאוד שיעורי מכות והם מסוגלים לצעוד שריר לב vivo לשעבר.

תקציר

טיפול ב" תסמונת סינוס החולה "מבוסס על קוצבי לב מלאכותיים. אלה נושאים סכנות כגון כשל סוללה וזיהומים. יתר על כן, הם חסרים את היענות הורמון וההליך הכולל הוא עלות עתיר. "קוצבי לב ביולוגיים" שנוצרו מPSCs עשוי להיות אלטרנטיבה, עדיין התוכן האופייני לתאי קוצב לב בגופים Embryoid (EBS) הוא נמוך ביותר. הפרוטוקול המתואר משלב "תכנות קדימה" של PSCs העכברי באמצעות TBX3 inducer צומת סינוס עם בחירת אנטיביוטיקה מבוססת Myh6-אמרגן. זה מניב אגרגטים cardiomyocyte עקביים של תאי קוצב לב מבחינה פיזיולוגית תפקודיים> 80%. אלה "הנוצרים על-sinoatrial-גופים" ("iSABs") באופן ספונטני הידבקות בתדרים עדיין unreached (400-500 פעימות לדקה) המתאימים לתאי קטרי מבודדים מלב עכבר והם מסוגלים לצעוד שריר לב vivo לשעבר עכברי. באמצעות הפרוטוקול המתואר סינוס הטהור ביותריכולים להיות שנוצרו תאים בודדים קטרי שלדוגמה ניתן להשתמש במבחנת בדיקות סמים. יתר על כן, iSABs שנוצר על פי פרוטוקול זה עלול להפוך לצעד מכריע לקראת הנדסת רקמות לב.

מבוא

"תסמונת סינוס החולה" הטווח מסכמת מחלות מרובות שהובילו להידרדרות מערכת קוצב לב. היא כוללת ברדיקרדיה פתולוגי, סימפטומטי סינוס, בלוק sinoatrial, מעצר סינוס, כמו גם את תסמונת טכיקרדיה-ברדיקרדיה. וכך, "תסמונת סינוס חולה" מלווה לעתים קרובות במחל לב כלליות כגון מחלת לב איסכמית, cardiomyopathies או דלקת שריר לב. נכון לעכשיו, גישות טיפוליות המבוססות על השתלת קוצבי לב של חשמל. עם זאת, זה הולך ביחד עם מספר הסיכונים, כגון זיהומים וכשל סוללה. בסך הכל, השכיחות של סיבוכים היא עדיין גבוהה מאוד בחולים שהושתלו קוצב לב מלאכותי. יתר על כן, בניגוד לקוצב לב אנדוגני, התקנים אלה אינם מגיבים לגירוי הורמונלי.

חלופה עתידית עשויה להסתמך על הזמינות של "קוצבי לב ביולוגיים" שיכול לשמש PSCsכמקור סלולארי מתאים ושיהיה גם יקר מאוד במבחנת בדיקות סמים. עם זאת, בעיה עיקרי טמון בהופעה נדירה מאוד של תאי קטרי סינוס בתוך גופי embryoid (EBS) - זה בדרך כלל אינו עולה על 0.5% ~ ^1.

בעבר, ניתן היה לראות כי "תכנות קדימה" לקראת תת cardiomyocyte ספציפי ניתן לביצוע באמצעות ביטוי יתר של גורמים שונים בתחילת שעתוק לב וכלי דם כגון גורם המזודרם ספציפי, אחורי 1 (MesP1) ושעתוק NK2 הקשורים, לוקוס 5 (Nkx2.5) ^{2, 3.} לגודל ותפקוד של צומת sinoatrial (SAN) רגילים, Tbx3 גורם שעתוק T-התיבה הוא חיוני, אשר הוכח כדי ליזום את תכנית גן קוצב לב ולשלוט בידול של ⁴ SAN. אמנם זה משופר המראה של תאי קוצב פונקציונליים, התוכן עדיין לא עלה על ~ 40% בקרב אוכלוסיית תא cardiomyocytic כולו.

לכן, צעד בחירת אנטיביוטיקה מבוסס Myh6-אמרגן נוסף ⁵ הוצג על ידינו. זה סופו של דבר מוביל לאגרגטים עד כה לא נצפו cardiomyocyte ("גופים הנגרמים סין-פרוזדורים;" iSABs ") אשר התערוכה גדלו מאוד תדרי מכות (> 400 פעימות לדקה) במבחנה, בפעם הראשונה לאלו של לב עכברי ודומים לטפח במבחנה תאי קטרי סינוס המבודדים מלב עכברי ^6. תחת ממשל Isoprenaline אפילו תדרים פועמים של 550 פעימות לדקה מושגות. יש לציין, iSABs מורכב של מעל 80% תאי קטרי פונקציונליים כפי שעולים פיסיולוגי נרחב מנתח ^7. לאחרונה, מספר גישות ליצירת תאי סינוס קטרי באמצעות תכנות מחדש ישיר ^19, משטח סמני ¹⁴ או טיפול תרופתי עם מולקולות קטנות ^16,17 תוארה. עם זאת, אף אחת מהשיטות הללו הוביל לטוהר גבוה כל כך של תאי קוצב לב ומכה את תדרים קרובים לעכברי הואאמנות כפי שנצפה בiSABs.

יתר על כן, במודל vivo לשעבר של פרוסות חדרית מעובד עכבר מבוגר שאבדו את פעילות המכות הספונטנית שלהם, iSABs מסוגל להשתלב ברקמה הפרוסה, כך שנותרו פעיל באופן ספונטני ובאופן עמיד צעדה פרוסות לב להתכווצויות ^7. פרוטוקול מפורט לדור של iSABs אלה מתואר במאמר זה.

פרוטוקול

1. המלצות לפני שמתחיל

1. אל תשתמש בPSCs מזוהם בmycoplasma כי הם לא יבדילו כראוי לתאי צומת סינוס. מבחן לזיהום mycoplasma לפני תחילת הפרוטוקול. לעשות את זה באמצעות ערכת PCR לגילוי מהיר, רגיש מאוד של mycoplasmas ולעקוב אחר פרוטוקול manufacturer`s.
2. לכל צלחת פטרי (צעד 2.3.4), מעיל סנטימטר אחד 10 צלחת תרבות ² תא עם ג'לטין סטרילי 7 מיליליטר 0.1% מעור דג מים קרים למשך שעת 1 ב 37 ° C. הסר את הג'לטין ולתת יבש מנה בתנאים סטריליים בספסל סטרילי.
3. לפני שתוכל להתחיל את פרוטוקול הבידול אתה צריך שיבוט כפול עכבר היציב transfected ES קו תא המכיל את התכונות הבאות: i) מכוננת על ביטוי של TBX3 באמצעות וקטור ביטוי יונקים. Ii) גן התנגדות G418 תחת שליטתו של Myh6-האמרגן ^5.
4. התאים שלא עברו התמיינות PSCs צריכים להיות שותף לטפחד עם תאים מזינים המוקרנים בתנאים סטנדרטיים כמתואר ^1.

2. בידול נוהל

1. ימים לפני התמיינות - הסר PSCs מהתאים מזינים.
   1. לשאוב את המדיום, לשטוף את התאים עם מי מלח שנאגרו 10 מיליליטר פוספט PBS, להוסיף 7 מיליליטר פתרון Collagenase IV ודגירת התאים במשך 10 דקות על 37 מעלות צלזיוס. מניחים מסנן 40 מיקרומטר סטרילי בשפופרת 50 מיליליטר.
   2. לשטוף בזהירות את מושבות PSC (להימנע מלהסיר את התאים מזינים) על ידי pipetting פתרון collagenase למעלה ולמטה 5 פעמים.
   3. מעביר את ההשעיה התא למסנן 40 מיקרומטר, יש לשטוף את המסנן שלוש פעמים עם 8 מיליליטר PBS. להסתובב המסנן ולמקם אותו במהופך בצלחת פטרי. הסר את מושבות תאי PSC ידי pipetting 10 מיליליטר PBS לתחתית המסנן.
   4. מעביר את ההשעיה תא צינור 15 מיליליטר ו צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 300 x גרם.
   5. הסר את PBS, להשעות את התאים 1 מיליליטר Accutase וincubate על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
   6. הוסף 10 מיליליטר PBS, לערבב את פתרון התא על ידי pipetting מעלה ומטה 5 פעמים וצנטריפוגות במשך 5 דקות ב 300 x g.
   7. הסר את PBS, להשעות את התאים במדיום גידול 10 מ"ל ולקבוע את מספר התא.
   8. תאי זרע 15,000 / ² סנטימטר על בקבוק ² מסנן 75 סנטימטר ולטפח אותם במשך 2 ימים על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. לאחר 2 ימי הבקבוק צריך להיות 50-70% ומחוברות.
2. יום 0 - התחל של בידול
   1. הסר את המדיום ולשטוף את התאים עם 10 מיליליטר PBS.
   2. לשאוב PBS, להוסיף 2 מיליליטר Accutase ו דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. מניחים מסנן 40 מיקרומטר סטרילי בשפופרת 50 מיליליטר.
   3. הוסף 10 מיליליטר PBS, להעביר את ההשעיה התא למסנן 40 מיקרומטר, יש לשטוף את המסנן באמצעות תוספת של 10 מיליליטר PBS ו צנטריפוגות הזרימה דרך במשך 5 דקות ב 300 x גרם.
   4. להשעות את התאים בינוניים בידול 10 מיליליטר ולקבוע את מספר התא.
   5. לדלל tהוא תא השעיה עם מדיום בידול לריכוז סופי של 20,000 תאים / מיליליטר.
   6. פיפטה 20 מיליליטר מים ו -5 מיליליטר תלוי טיפת פתרון (HD) בצלחת פטרי ריבועית, כדי למנוע התייבשות של HDS.
      הערה: לכל 24 iSABs צלחת המכילה גם (ראה סעיף 2.8.6.4/2.8.7) להתחיל עם 16 צלחות פטרי.
   7. פיפטה עד 50 מיליליטר השעיה תא במגש.
   8. להסתובב את המכסה של צלחת פטרי. הנח 180 HDS כל 20 μl המכיל (400 תאים / HD) השעיה תא על המכסה בעזרת פיפטה 12 ערוצים.
   9. הפוך בזהירות מסביב למכסה ומניח אותו על גבי צלחת פטרי.
      הערה: המהירות להסתובב המכסה היא מאוד חשובה. אם המכסה הסתובב לאט מדי או מהר מדי, את המתח של ההשעיה תא השטח אינו גבוה מספיק כדי לשמר את תליית טיפות על המכסה. לפני שאנסה לייצר HDS לאימון בפעם הראשון להסתובב עם המכסה 20 טיפות μl של מדיום.
   10. לטפח את התאים עבור 2 ימים בשעה 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ כדי לאפשר להם ליצור EBS.
       הערה: מקום צלחת פטרי אחת מלא במים בחלק העליון של ערימה של 5 צלחות פטרי. אחרת HD בצלחת פטרי העליונה יתייבש.
3. יום 2
   1. הפוך בזהירות מסביב למכסה של צלחת פטרי ריבועית ולהעביר את EBS נגזר משתי צלחות פטרי (360 EBS) לצינור 50 מיליליטר.
   2. חכה 10 דקות כדי לאפשר לEBS להתיישב בחלק התחתון של הצינור (אל צנטריפוגות EBS).
   3. לשאוב באותה המידה בינונית ככל האפשר, להשעות את EBS ב 10 מיליליטר בינוני בידול ולהעביר את ההשעיה לצלחת פטרי 10 סנטימטרים.
4. תרבות 2-6 השעיה יום
   1. לטפח את EBS בהשעיה למשך 4 ימים על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2, לשנות בינוני לאחר 2 ימים.
      הערה: למרות שצלחת פטרי לא מצופה (בניגוד לצלחת תרבית תאים) EBS לעתים קרובות לצרף אל פני השטח. לשלוט בצלחות פטרי לEBS מצורף בכל יום, ואם יש צורך ניתוק EBSמהמשטח על ידי pipetting העדין. אופציונאלי: לנער את צלחות פטרי ברציפות בתקופת תרבות השעיה. תיזהר עם המהירות של ייקר. EBS צריך לא לצבור באמצע ולא לצוף לגבול של צלחות פטרי.
5. יום 6
   1. העבר את EBS מאחד צלחת פטרי לג'לטין אחד 10 סנטימטרים מצופים צלחת תרבות ² תא.
6. יום 7-12
   1. התאים צריכים להתחיל לנצח לאחר 8-12 ימים. בדקו אם מכה מוקדים של התאים יומיים תחת מיקרוסקופ. התאים מתחילים ליצור שכבה.
   2. שנה בינונית יומי.
      הערה: לאחר השינוי בינוני, התאים דורשים 3-4 שעות להתאושש ולהתחיל להכות שוב.
7. בחירת 12-15 היום של תאי קטרי סינוס.
   1. שלושה ימים לאחר שהתאים החלו להכות (סביב היום 12-15), לשאוב מיליליטר 10 הבינוני ופיפטה של ​​מדיום בידול טרי המכיל G418 / מיליליטר 400 מיקרוגרם לתאים.
8. ארבעה ימים לאחר תחילת הבחירה לנתק את שכבת התאים.
   הערה: ייתכן ששכבת התאים כבר מנותקת מהשטח.
   1. הסר את המדיום בזהירות מבלי aspirating שכבת התאים.
   2. להוסיף 10 מיליליטר של PBS ולהסיר את PBS בזהירות מבלי aspirating שכבת התאים.
   3. הוסף 10 מיליליטר של תמיסת Collagenase IV, להעביר את תאי צינור 50 מיליליטר ו דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
   4. במרץ לערבב את ההשעיה על ידי pipetting למעלה ולמטה 10 פעמים ודגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. השעיה של אשכולות קטנים צריכה להתרחש. אם יש עדיין חלקים עצומים של השכבה עזבה, חזור על שלב 2.8.4 פעמים נוספות.
   5. להוסיף 20 מיליליטר של PBS ו צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 300 x גרם.
   6. לשאוב PBS בזהירות.
      הערה: אם iSABs הוא להיות שנוצר להמשיך עם צעד 2.8.7. אם תאים בודדים קטרי סינוס נגזר iSAB הם להיות שנוצרו להמשיך בשלב 2.9.
   7. להשעות את התאיםב -12 מיליליטר בינוני בידול המכיל G418 / מיליליטר 400 מיקרוגרם וזרעם על 6 בארות של ג'לטין מצופה 24 בארות (2 מיליליטר / טוב).
9. דור של תא בודד קטרי.
   1. להשעות את התאים מצעד 2.8.6 ב 5 מיליליטר Accutase ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
   2. במרץ לערבב את ההשעיה על ידי pipetting למעלה ולמטה 10 פעמים ודגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
   3. להוסיף 20 מיליליטר של PBS ו צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 300 x גרם.
   4. להשעות את התאים בינוניים בידול 12 מיליליטר מכילים G418 / מיליליטר 400 מיקרוגרם וזרעם על 6 בארות של ג'לטין המצופה 24 בארות (2 מיליליטר / טוב).
10. היום 2 לאחר ניתוק, לשאוב את המדיום ולשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS. הוסף 1 מיליליטר בינוני בידול / טוב.
11. יום 4-8 לאחר הניתוק, לשנות בינוני כל 2 ^nd יום. ביום 10 אחרי iSABs שימוש דיסוציאציה או בסינוסים נגזרים iSAB קטרי תאים בודדים זמינים לניתוח נוסף.

תוצאות

הפרוטוקול המתואר מאפשר דור של iSABs בתדירות פעימות סביב 450 פעימות לדקה מPSCs (שמוצג בסרט) שנמצא ליד לתדר פעימות לב עכבר. לאחר הניתוק של iSABs (שלב 2.8.8) תאים בודדים שנצפו להראות את הצורה האופיינית לתאים של צומת סינוס (תאי כישור ועכביש) כפי שמוצג באיור 1. תאים אלה חלבונים מפורשים ביותר שידועים להיות חיוניים לתפקוד של צומת סינוס כמו ערוץ מופעל hyperpolarization המחזורי מגודרת נוקלאוטיד קטיון 4 (Hcn4), Connexin45 (Cx45), Connexin30.2 (Cx30.2) וMyh6 (איור 2 ...

דיון

היכולת לייצר תאי גזע קוצב לב תא נגזרים לב עשוי לאפשר הכינון מחדש של קצב הלב התקין, במובן של "קוצבי לב ביולוגיים". כמו כן, בדיקות סמים במבחנה תיהנה מזמינותם. PSCs יכול להצמיח כל סוג תא בגוף של היונקים, כולל שריר לב עם מאפייני תא קוצב לב ^{8,9,10,11,12,13.} עם זאת, בדרך כלל אוכלוסיות התאים בתוך "גופי Embryoid" הן הטרוגנית מאוד, אשר מוביל בהכרח לדרישה של אסטרטגיות בחירה ובידוד אמינות - זה חל במיוחד לסוג התא הנדיר מאוד של תאי קטרי לב. גישות רבות המבוססות על...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
המדיום הנוזלי של Iscove עם גלוטמין יציב	Biochrom AG	FG 0465
DMEM מדיום נוזלי ללא Na-pyruvate, עם גלוטמין יציב	Biochrom AG	FG 0435
CLS סוג IV, CLS IV	Biochrom AG	C4-22
חומצות אמינו לא חיוניות	Biochrom AG	K 0293
FBS Superior	Biochrom AG S	0615
נתרן פירובט (100 מ"מ)	Biochrom AG	L 0473
G 418-BC נוזל (תמיסה מוכנה לשימוש),	Biochrom AG	A 2912
PP f.multichannel pip. 60 מ"ל, מותג סטרילי		703409
Accutase	eBioscience, Inc.	00-4555-56
Eppendorf Xplorer/Xplorer plus, פיפטה אלקטרונית	Eppendorf	4861000155
מסננת תאי פלקון 40 ומיקרו; m	Falcon	352340
פניצילין/סטרפטומיצין	GE Healthcare	P11-010
צלחות פטרי	גריינר BioOne	663102
DPBS ללא Ca	ו-Mg PAN-Biotech	P04-36500
סרום בקר עוברי	PAN-Biotech	P30-3302
גורם מעכב לוקמיה	Phoenix Europe GmbH	LIF-250
צלחות פטרי ריבועיות	Roth	PX67.1
ג'לטין מעור דגי מים קרים	SigmaAldrich	G7765
2-Mercaptoethanol	SigmaAldrich	M3148
1-תיוגליצרול	SigmaAldrich	M6145
כלי תרבית רקמות	TPP	93100
בקבוק תרבית רקמות	TPP	90076
צלחות בדיקת תרבית רקמות (24 באר)	TPP	92424