מודל שיתוף תרבות תלת-ממדי לגידול אינטראקציה-סטרומה

סיכום

כאן אנו מציגים פרוטוקול לתרבית משותפת בתלת מימד, שימושי לחקירת אינטראקציות רב-תאיות ואפנון תלוי מטריצה חוץ-תאית של התנהגות תאי סרטן. במודל ניסיוני זה, תאים סרטניים מתורבתים על ג'ל קולגן המשובץ בפיברובלסטים הקשורים לסרטן אנושי.

תקציר

התקדמות הסרטן (התחלה, גדילה, פלישה וגרורות) מתרחשת באמצעות אינטראקציות בין תאים ממאירים לתאי הסטרומה של הגידול שמסביב. המיקרו-סביבה של הגידול מורכבת ממגוון סוגי תאים, כגון פיברובלסטים, תאים חיסוניים, תאי אנדותל כלי דם, פריציטים ותאים שמקורם במח העצם, המוטבעים במטריצה החוץ-תאית (ECM). לפיברובלסטים הקשורים לסרטן (CAFs) יש תפקיד פרו-גידולי באמצעות הפרשת גורמים מסיסים, אנגיוגנזה ושיפוץ ECM. המודלים הניסיוניים להישרדות תאים סרטניים, התפשטות, נדידה ופלישה הסתמכו בעיקר על תרביות רקמה חד-תאיות וחד-שכבתיות דו-ממדיות או מבחני תא ביידן. עם זאת, ניסויים אלה אינם משקפים במדויק את התנאים הפיזיולוגיים או הפתולוגיים באיבר חולה. כדי להשיג הבנה טובה יותר של אינטראקציות סטרומליות של גידול או מטריצת גידול, תרבויות רב-תאיות ותלת מימדיות מספקות כלים חזקים יותר לחקירת תקשורת בין-תאית ואפנון תלוי ECM של התנהגות תאי סרטן. כפלטפורמה למחקר מסוג זה, אנו מציגים מודל ניסיוני שבו תאים סרטניים מתורבתים על ג'ל קולגן המשובץ בתרביות ראשוניות של CAFs.

מבוא

רקמת סרטן יכולה להיתפס כסוג של איבר, המתפתח באמצעות אינטראקציות קרובות בין הסרטן למיקרו-סביבה סטרומלית של הגידול, המורכבת מפיברובלסטים הקשורים לסרטן (CAFs), תאים חיסוניים, כלי גידול והמטריצה החוץ-תאית (ECM). CAFs הם המקור העיקרי לגורמים מסיסים (ציטוקינים, גורמי גדילה וכימוקינים) המפעילים השפעות מיטוגניות, פרו-נדידה ופרו-פולשניות על תאים סרטניים. הם גם מעוררים היווצרות כלי גידול ומגייסים תאים מבשר, כגון תאים שמקורם במח העצם (BMDC). CAFs מופעלים מעורבים בייצור ובעיצוב מחדש של ה-ECM, ובכך מקדמים את הצמיחה וההתפשטות של תאים סרטניים¹. CAFs מספקים גם נישה המאפשרת קולוניזציה וגרורות של תאי גידול ומסוגלים להעניק פנוטיפים של תאי גזע לתאי סרטן שכנים. תצפיות פתולוגיות מצביעות על כך שתגובות סטרומליות או שינויים פיברוטיים ברקמות סרטן מעידות על פרוגנוזה גרועה. מחקרים אחרונים הראו גם כי תכונות סטרומליות של הגידול, כגון חתימת הגן, יכולות לחזות את הפרוגנוזה של המטופל. יתר על כן, גורמים שמקורם ב-CAF יכולים לווסת את הרגישות לכימותרפיה, ולהדגיש את תפקידם של CAFs בקביעת רגישות ועמידות לתרופות².

מכיוון ש-CAFs ממלאים תפקיד רב פנים בקידום התקדמות הגידול באמצעות מסלולי איתות המתווכים אינטראקציות בין CAFs וסוגי תאים שונים בתוך מיקרו-סביבת הגידול, הם משכו תשומת לב הולכת וגוברת כמטרות חדשות לטיפולים בסרטן. ההטרוגניות של אוכלוסיות התאים בתוך המיקרו-סביבה הסרטנית מהווה מכשול למיקוד CAFs. הוצעו מספר סמנים ל-CAFs, כגון אקטין שריר חלק α (α-SMA), חלבון הפעלת פיברובלסטים (FAP) ופרוטן-1 ספציפי לפיברובלסטים (FSP-1: נקרא גם S100A4); עם זאת, סמנים מולקולריים אלה אינם ספציפיים להבחנה בין CAFs לתאים אחרים הקיימים ברקמות לא סרטניות³. לכן, יש צורך במחקרים נוספים כדי להשיג ידע נוסף על המאפיינים הספציפיים של CAFs. לשם כך, זה אינפורמטיבי לאפיין CAFs מתורבתים ראשוניים בהשוואה לפיברובלסטים רגילים המותאמים למטופל.

לאחרונה דווח על ניתוחים על CAFs שמקורם בחולה במספר סוגי סרטן, וחשפו דפוסי ביטוי גנים ייחודיים והתנהגויות תאים בהשוואה לפיברובלסטים שמקורם ברקמות לא סרטניות. באמצעות CAFs מבודדים מרקמות סרטן ריאות אנושיות, פיתחנו שיטת תרבית משותפת תלת מימדית, המאפשרת לנו להעריך את התכונות של CAFs ריאות. במודל זה, חקרנו את ההשפעות של ה-CAFs על פלישת תאי סרטן ריאה, התפשטות והתכווצות ג'ל קולגן, אשר סיכמו באופן ניסיוני את התפקידים מקדמי הגידול של CAFs⁴ ריאות.

פרוטוקול

הערה: מחקר זה אושר על ידי ועדות האתיקה המתאימות.

1. יסודי תרבות של Fibroblasts ריאות האדם

1. אוסף של רקמת ריאה:
   1. להשיג דגימות רקמת ריאה אנושיות מחדר הניתוח כירורגי ישירות. לאסוף כ 1 סנטימטר ³ בלוקים מרקמת ריאה סרטנית ולא-סרטנית, עם המדגם שאינו סרטני שנאסף כרחוק מן הגידול ככל האפשר.
   2. להשעות את הדגימות במדיום של הנשר שונה Dulbecco (DMEM) בתוספת 100 יחידות / מיליליטר פניצילין, 100 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מיליליטר ו 0.25 מיקרוגרם / מיליליטר amphotericin B (בינוני סרום ללא). לשמור על הדגימות התלויות בצינורות 50 מיליליטר סטרילי ולהעביר למעבדה.
      הערה: פיברובלסטים הם נוהג לנדוד ופרוליפרטיביים לעומת סוגי תאים אחרים, כגון אפיתל, אנדותל ותאי שריר חלק. שיטת תולדה מנצלת תכונות של fibroblasts אלה, וoutgroתאי כנף מסעיפי רקמות נמצאים בשפע בfibroblasts. לאחר כמה קטעי תא, סוגי תאים אחרים לא יצליחו לשרוד ולהפיץ בDMEM עם 10% בסרום שור עוברי (FBS), וכתוצאה מכך בתרביות תאי פיברובלסטים מטוהרים. יכולים לשמש התאים 3-7 קטעים הבאים תרבות העיקרית.
2. תרבות explant ואוויר לתולדת תא:
   1. בצע תרבות העיקרית של fibroblasts באמצעות פרוטוקול שדווח בעבר עם שינויים ^5.
   2. במעבדה, למקם את דגימת הרקמה על צלחת תרבית רקמת 10 סנטימטרים מבלי מדיום התרבות וחתוך לחלקים קטנים ~ 2-3 מ"מ בגודל באמצעות מלקחיים סטרילית ואזמל. במהלך תהליך זה, להימנע מיבש הסעיף, אחרת היעילות של תולדת תא נפגמת.
3. הפרדה של שכבת תאי האפיתל ורקמת חיבור:
   1. משרים את חלקי רקמות קיצוץ במדיום תרבות המכיל 2,000 PU / מיליליטר dispase אני ותרבות במשך 16 שעות על 4 מעלות צלזיוס.
   2. העבר את סעיפי רקמות לצלחת, ולהפריד את שכבת תאי האפיתל מרקמת חיבור הסמוכה. לעבד את החלקים בספסל נקי כדי למנוע זיהום של מיקרואורגניזמים.
      הערה: אם יש צורך בתרבות העיקרית של תאי אפיתל, לבצע שלב 1.3. אם fibroblasts רק הם להיות מבודד, להשמיט צעד 1.3 בגלל מעברי תרבות explant והתא הבאים הם שליליים עבור תאי אפיתל, אשר יניבו אוכלוסיות פיברובלסטים מטוהרים.
4. קובץ מצורף של סעיפי רקמות:
   1. לרכך את הרקמות לחתיכות 1 מ"מ באמצעות שני אזמלים. אם החלקים אינם קטנים מספיק, הם לנתק בקלות רבה יותר מהצלחת, והתאים לא יצליחו להיגמל על פני השטח הצלחת.
   2. הנח קטעי רקמת ריאות קטנים זו מזו כדי לשמור על אזור ריק המקיף את כל חתיכה. הפוך סריטות על פני השטח של צלחת תרבית רקמה באמצעות סכין אזמל כדי להקל על התקשרות של סעיפי רקמות.
      הערה: מגרדמופיע גם כדי להקל על תולדת תא, מתן מסלולים שלאורכו תאים יכולים להעביר.
      1. לחלופין, להניח את חלקי רקמות טחונים בנפרד לתוך היטב בכל צלחת 6-היטב, ומכסה אותם עם תלוש כיסוי. צרף את תלוש לכסות על פני השטח של הצלחת באמצעות גריז סיליקון.
      2. הנח גריז סיליקון בשתי נקודות בנפרד 1.5 סנטימטרים בכל אחד גם באמצעות סיכת סטרילי. כיסוי של פיסות רקמה משפר את היעילות של תולדת תא ותא התפשטות הבאה כמה קטעים.
5. תרבות explant לאחר:
   1. בעדינות להוסיף בינוני תרבות לצלחת לפני סעיפי הרקמות להתייבש, כתולדת תא יעילה הולכת לאיבוד ברוב המקרים אם הדגימות להתייבש. אין לשפוך הבינוני מדי במהירות כמו בסעיפי הרקמות היו לנתק.
   2. תרבות תאים בDMEM עם 10% FBS. השתמש מספיק בינוני רק כדי לכסות את הרקמה, אבל לא יותר מדי, כי זה מאפשר צף, כציפה נוספת מקדמת ניתוק מצלחת.
6. מעבר נייד:
   1. ידית מדיום התרבות בזהירות בכל העת כמו תנועות חוזרות ונשנות של את המנה התרבות יכולות להוביל לניתוק של חלקי רקמות.
   2. מניחים את הכלים התרבות באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5-7 ימים. רענן הבינוני בכל יום אחר, ולטפל בכלי התרבות מינימאלית במהלך השינויים בינוניים. Fibroblasts להיגמל מקצה קטעי הרקמה בשבועות הבאים.
      הערה: לאחר ~ 2-3 שבועות, fibroblasts התבגרות כמעט מגיע למפגש, בהתאם לכמות של שטח פנים.
   3. לשטוף את התאים עם 1x PBS, ולהוסיף 1 מיליליטר של טריפסין אני לצלחת.
   4. לאחר trypsinization, לנתק את התאים באמצעות 9 מיליליטר של DMEM בתוספת 10% FBS. איסוף תאים תלויים במדיום בצינור 10 מיליליטר, יחד עם קטעי הרקמה. בעקבות צנטריפוגה כדי ליצור כדורי תא, resuspend את כדורים וכתוצאה מהמדיום החדש.
   5. זרעי התאים וחלקי רקמות על רחוב ללא מוצא חדשצלחת ture, ובשלב הרקמות מצליחות לצרף הצלחת ואילו התאים לדבוק ולגדול. למחרת, להסיר את פיסות הרקמה צף על ידי שאיפה, ולשנות את המדיום. fibroblasts המצורף להפיץ עם תרבויות שלאחר מכן.

2. Co-תרבות תלת ממדית של Fibroblasts ריאות אדם ותאי הסרטן

1. הכנת תאים וחומרים כימיים:
   1. כ להשתמש 2 x 10 ⁵ תאי אפיתל 2.5 x 10 ⁵ fibroblasts בכל טוב. הכן סוג קולגן IA (3 מ"ג / מיליליטר, pH 3), FBS (100%), חיץ הכינון מחדש (50 מ"מ NaOH, 260 מ"מ NaHCO _3, 200 מ"מ HEPES), 5x DMEM, DMEM בתוספת 10% FBS לתרבות פיברובלסטים, ובינוני שיתוף תרבות 3D (1: 1 תערובת של מדיום תרבות פיברובלסטים ובינוני תרבות לתאים סרטניים).
   2. תאי A549 תרבות אדנוקרצינומה ריאתית, fibroblasts והתרבות המשותף 3D A549 DMEM בתוספת 10% FBS.
2. f ג'ל קולגןormation:
   1. לשטוף fibroblasts התרבותי על צלחת 10 סנטימטרים עם 1x PBS, ולהוסיף 1 מיליליטר של טריפסין אני לצלחת. לאחר trypsinization ל~ 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, לנתק את התאים באמצעות 9 מיליליטר DMEM בתוספת 10% FBS. איסוף תאים תלויים במדיום בצינור 10 מיליליטר, ו צנטריפוגות ב200-300 XG כדי ליצור כדורי תא.
   2. Resuspend את כדורים וכתוצאה מכך FBS 100% בצפיפות של 5 x 10 ⁵ מיליליטר /.
   3. הכן את ג'ל קולגן על קרח. לקרר את חומרים כימיים, טפטפות וצינורות במקרר לפני ההליך הבא. אפילו על קרח, התערובת מתמצקת במידה מסוימת, ואת הנפח הכולל הוא פחות מהסכום של כל המרכיבים.
   4. בכל טוב, להכין ג'ל קולגן על ידי ערבוב של 0.5 מיליליטר של השעיה פיברובלסטים (2.5 x 10 ⁵ תאים) בFBS, 2.3 מיליליטר סוג IA קולגן, 670 μl 5x DMEM, ו -330 חיץ הכינון מחדש μl. לאפשר לג'לים להגדיר בקלות בטמפרטורת חדר.
      1. במרץ פיפטה כדי להבטיח מיל הומוגניתxture. הימנע מיצירת בועות בתהליך pipetting.
   5. מוסיף את התערובת (3 מיליליטר) היטב בכל צלחת 6-היטב ולאפשר לgelatinize בחממה ב 37 ° C ללא הפרעה במשך 30-60 דקות.
3. תרבית תאי סרטן על ג'ל קולגן:
   1. לבצע שיתוף תרבות תלת-ממדית באמצעות פרוטוקול שדווח בעבר עם שינויים ^6.
   2. תאי סרטן גלולים במדיום שיתוף תרבות 3D (או בDMEM עם FBS 10% במקרה של תאי A549) בצפיפות של 1 x 10 ⁵ / ml.
   3. יוצקים 2 מיליליטר של הפתרון המושעה בתא (2 x 10 ⁵ תאים) על פני השטח של כל ג'ל. לשנות את מספר תא של תאים סרטניים או fibroblasts בשיתוף התרבות בהתאם לתנאי ניסוי.
4. התכווצות ג'ל:
   1. דגירה ג'לי הלילה בשעה 37 ° C כל כך התאים הסרטניים יכולים לדבוק בג'ל קולגן. לנתק את כל ג'ל, וליצור "תרבות הצפה" בכל טוב of 6-גם הצלחת.
      הערה: על ידי שימוש בתרבות צף, שינויים שונים בגודל ג'ל הנגרמים על ידי מתח מכאני והשפלה קולגן, אשר מתווכים על ידי אינטראקציה סלולרית בין תאים סרטניים שיתוף תרבותי וfibroblasts.
   2. השתמש במחט בזווית 21 G או מרית קטנה כדי להפריד בין ג'ל מהקצה של הבאר. כל 2-3 ימים, לרענן את הבארות עם 2 מיליליטר של מדיום שיתוף התרבות 3D. למדוד את גודלו של כל ג'ל בכל יום במשך 5 ימים.
5. ניתוח של ג'ל קולגן:
   1. מדוד את תוכן קולגן של כל ג'ל תוך שימוש בשיטות לכמת קולגן, כגון assay Sircol. לבצע ניתוח transcriptomic או RT-PCR לאחר איסוף RNA מהג'לי ^5.

3. אוויר נוזלי ממשק תרבות והפלישה Assay

1. לאחר culturing ג'ל קולגן על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 ימים, לחשוף את ג'לי נדבק לאוויר על ידי הצבת אותם ברשת (70 גודל נקבובית מיקרומטר) ב6- החדשצלחות גם. הפוך את הרשת ממסננות תא זמינות מסחרי המשמשות לזרימה cytometry.
2. בעדינות למלא היטב כל אחד עם 11 מיליליטר של מדיום שיתוף התרבות 3D.
3. מקם את ג'לי על הרשת בעזרת כף סטרילי, ולהסיר כל מדיום שנותר מהג'לי. במצב זה, לצלול ג'לי במדיום תוך לחשוף את פני השטח העליונים של ג'ל לאוויר. להגדיר מצב זה כתרבות ממשק אוויר נוזלי.
   הערה: לאחר 5-7 ימים של שמירה על תרבות ממשק האוויר הנוזלית על 37 מעלות צלזיוס בחממה, תאי סרטן פולשני להגר לתוך הג'ל. בהתאם לסוג התא וכתוצאה מאינטראקציות הסלולר, מעלות משתנה של שינוי מורפולוגי תא בתאים הסרטניים הנגרמות על ידי תרבות ממשק האוויר הנוזלית.
4. להערכה היסטולוגית, לתקן את הג'ל בתמיסת פורמלין לילה בטמפרטורת חדר ולהטביע בפרפין. כתם חלקים אנכיים (4 מיקרומטר) עם hematoxylin ו eosin (H & E). בצע o ניתוח immunohistochemicaln הסעיפים ^4.

תוצאות

שיטת שיתוף תרבות זו, מחקה את המיקרו-הסביבה של הגידול, היא כלי שימושי כדי לחקור את יחסי הגומלין בין תאים הסרטניים וfibroblasts המשובצים ג'ל קולגן. במחקר הקודם, שלושה פרמטרים הוערכו במודל זה ניסוי: התכווצות ג'ל קולגן, פלישה של תאי סרטן ושינוי מורפולוגי. התפשטות תאי הסרטן גם נאמדה באמצעות immunostaining Ki67 ^4. דגימות רקמת ריאה נאספו מסעיפים סרטניים ולא-סרטניים של אונת ריאה כריתה (איור 1 א). דגימות טחונות לחתיכות קטנות ותרבותית בDMEM בתוספת 10% FBS...

דיון

Cafs מהווה רכיב מרכזי של ECM סביב תאי סרטן ולא רק לספק פיגום לגידול, אלא גם להשתתף באופן פעיל בהתפתחות גידולי ^7. צבירת ראיות פורמת את ההשפעה של cafs או מולקולות הקשורים אליהם בסופו של דבר את הפרוגנוזה, המדגישה את התפקידים הקריטיים של התקדמות גידול בתיווך CAF ^8.

במחקר הקודם, שהועסקנו שיטת תולדה כדי לבודד cafs ריאות ^4. בניסוי זה, התחזוקה של הידבקות סעיף רקמה על פני השטח הצלחת היא קר...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796
FBS	GIBCO	10437
קולגן מסוג IA	ניטה ג'לטין בע"מ	CELL-1A
מאגר בנייה מחדש	Nitta gelatin Inc.
תלוש כיסוי	NUNC	174934
גריז סיליקון	Dow Corning Toray	גריז
Dispase I	WAKO	386-02271
צלחת 6 בארות	BD Falcon	353046
מסננת תאים (70 μ מ)	בז BD	352350

ואקום גבוה