מאמר שיטה

בידוד, תרבות והטווח ארוך תחזוקה של יסודיים mesencephalic דופאמין נוירונים ממוח עוברי מכרסם

13.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/52475

⸱

19 בפברואר 2015

 ,  ,  , 
1Division of Brain Sciences, Department of Medicine, Imperial College London, 2Department of Neurosurgery, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 3Department of Internal Medicine, Endocrinology, Yale University School of Medicine

במאמר זה

סיכום

הגורמים לניוון של נוירונים דופמינרגיים במוח התיכון במהלך מחלת פרקינסון אינם מובנים במלואם. מערכות תרבית תאיות מספקות כלי חיוני לחקר התכונות הנוירופיזיולוגיות של נוירונים אלה. כאן אנו מציגים פרוטוקול אופטימלי, שניתן להשתמש בו למודלים במבחנה של ניוון עצבי.

תקציר

ניוון של נוירונים דופמינרגיים מזנספליים (mesDA) הוא סימן ההיכר הפתולוגי של דיזיאה של פרקינסון. חקר התהליכים הביולוגיים המעורבים בתפקודים פיזיולוגיים ופגיעות ומוות של נוירונים אלה הוא חיוני להבנת הגורמים הבסיסיים ולפענוח התרופה להפרעה ניוונית נפוצה זו. תרביות ראשוניות של נוירונים mesDA מספקות כלי לחקירת התכונות המולקולריות, הביוכימיות והאלקטרופיזיולוגיות, על מנת להבין את ההתפתחות, ההישרדות ארוכת הטווח והניוון של נוירונים אלה במהלך המחלה. כאן אנו מציגים שיטה מפורטת לבידוד, תרבות ותחזוקה של נוירונים דופמינרגיים במוח התיכון מעוברי עכבר E12.5 (או חולדה E14.5). תנאי תרבית תאים אופטימליים בפרוטוקול זה מביאים לנוכחות של הקרנות אקסונליות ודנדריטיות, קשרים סינפטיים ותכונות מורפולוגיות עצביות אחרות, מה שהופך את התרביות למתאימות לחקר המאפיינים הפיזיולוגיים, הביולוגיים והמולקולריים של אוכלוסיית נוירונים זו.

מבוא

הפסד של נוירונים דופאמין מnigra substantia pars compacta מוביל לתסמינים מוטוריים העיקרי של מחלת פרקינסון (PD), ההפרעה ניוונית של מערכת עצבים הנפוצה ביותר השנייה. הסיבה הבסיסית של פטירתו של אוכלוסייה העצבית mesencephalic זה אינה ידועה. כדי לחקור את התהליכים הביוכימיים אחראים על הפיתוח וויסות נכסים והישרדות של תאי עצב mesDA, כמה תרבית תאים ומערכות מודל החיה neurophysiological היה בשימוש. שורות תאים הנציחו, כולל 1RB דופאמין עכברוש קו תא 3 27 (N27), שורת תאי נוירובלסטומה דופאמין אדם SH-SY5Y, שורת התאים היברידיים דופאמין העכבר MN9D וmesencephalic אדם LUHMES תאים היו בשימוש במשך מחקרים מכניסטית ביוכימיים ומוגבלים 1 -5. לצורך המחקר של האובדן הספציפי של נוירונים mesDA, כמה עצבים מבוססי ומודלים גנטיים פותחו 6-8. תרבויות המוח התיכון הגחון ראשיות, מספק כלי הכרחי ללימוד התכונות עצביות והסינפטי של נוירונים דופאמין והמסלולים מעורבים בפתוגנזה של הפרעה שכיחה זו.

כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט לבידוד של נוירונים דופאמין mesencephalic, המכיל שינויים וכתוצאה מכך שרידות גבוהות יותר ותשואה מוגברת של coverslips לעובר. שימוש בmesencephalon טרום בוגרים עכבר E12.5 (E14.5 בחולדה) משפר שרידות. בגיל זה הנוירונים לא פיתחו האקסונים עדיין, מה שמשאיר תאים שלמים במהלך נתיחה וממזער את הלחץ ובכך להגדיל באופן משמעותי את הכדאיות. בנוסף, לנתיחה זהירה של המוח התיכון הגחון, כפי שתוארו בסעיף 2 לפרוטוקול זה, משפרת עוד יותר את השרידות. כדי להגדיל את המספרים של coverslips לעובר, שיטת ציפוי חלופית מוצגת בסעיף 4 לפרוטוקול זה. זה מוביל לתשואה של עד 10 coverslips לכל עובר לעומת 4 coverslips תחתתנאי ציפוי סטנדרטיים ובכך להקטין את כמות בעלי חיים לכל ניסוי.

הנוירונים בתולדת תערוכת תרבות של אקסונים וdentrites, יוצרים קשרים סינפטיים ולחשוף את הנוכחות של סמנים עצביים והסינפטי עושים תרבויות אלה מתאימים להדמיה לחיות תא, immunocytochemical ומחקרי אלקטרו. יתר על כן, השימוש בתרבויות עצביות מאפשרת מניפולציה גנטית ותרופתית. תולדה של neurites מיום 2 במבחנה מאפשרת למחקרים התפתחותיים. יתר על כן, ההישרדות לטווח הארוך של תרבויות (עד שישה שבועות) הופכת אותם מתאימה למחקר של הניוון האיטי, ההדרגתי של תאי העצב האלה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: בעלי החיים נשמרו ומטופל בעמידה בהנחיות מוסדיות ונהלי כל החיה אושרו על ידי צער בעלי החיים של אימפריאל קולג 'ובגוף סקירה אתית (AWERB) והמשרד לבית ולאוניברסיטה הרווארד מוסדי הטיפול בבעלי חי ועדת שימוש (IACUC), בעמידה בתקנות פדרליות ואת המדינה.

1. מגיב והתקנת הציוד

  1. הפשרה, aliquot ופתרון חנות 1 מ"ג / מיליליטר Laminin ב -80 ºC. לפזר 2 μl ב 1 מיליליטר DMEM / F12, וכתוצאה מכך ריכוז ציפוי של 1-2 מיקרוגרם / 2 סנטימטר.
    הערה: הפשירי Laminin לאט על קרח ולפזר בDMEM / F12 הקר ומייד להוסיף אותו לצלחות / coverslips.
  2. לדלל 75 מיליליטר של 0.01% פולי-L-ornithine ב425 מיליליטר PBS ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: חיי המדף של הפתרון הוא לעבוד עד חודש.
  3. לפזר 25% BSA ב PBS (wt / כרך), pH 7.4, ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד year.
  4. הכן 50% FBS (בHBSS) תקשורת שחרור משרות.
  5. הכן בינוני מלא על ידי הוספת 50 U / ml פניצילין וסטרפטומיצין, תוספת 1x N2, 5% (כרך / כרך) FBS, 0.36% D - (+) - גלוקוז (wt / כרך), BSA 0.25% (wt / כרך) ל DMEM / F12 ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: חיי המדף הוא עד 10 ימים.
  6. coverslips מקום ברותח אתנול 70% (כרך / כרך) במשך לפחות 30 דקות כדי להסיר כל עקבות של שומן וחיטוי.
  7. coverslips המקום בצלחות 24 גם ולהוסיף פתרון 500 μl פולי-L-ornithine היטב כל אחד. דגירה שעה 1 מתחת למכסת המנוע בתרבית הרקמה בRT ולאחר מכן, לשטוף 3 פעמים עם 500 מים μl. הוסף פתרון laminin 500 μl לכל צלחת ודגירת O / N בתרבית רקמת חממת humidified על 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: למרות שאין שוטף נחוץ לאחר טיפול laminin, שטיפה פחות משלוש פעמים תוצאות poly-L-ornithine במוות של התאים 24 שעות לאחר culturing.
  8. פולני הטיפים של טפטפות זכוכית על גז טבעי או f לפידצולע.
    הערה: לאחר שלב זה הקוטר של הקצה צריך להיות כמחצית מגודלו הרגיל.
  9. חותך את הכובעים של 1.5 מיליליטר צינורות microcentrifuge, באמצעות מספריים וחיטוי autoclaved.

2. Dissection של עוברי הגחון מוח תיכון

  1. הסכרים לְהַרְדִים בעתו בהריון (E12.5) משאיפת CO 2 ולאחר מכן להרדים נקע בצוואר רחם.
  2. לרסס את הבטן עם אתנול 70% ולעשות חתך בבטן עד שקי רחם כל חשופים. שימוש במלקחיים לחתוך את הקובץ המצורף בנרתיק ולהסיר רחם. מניחים את הרחם בHBSS קר כקרח, בצלחת פטרי 100 מ"מ.
  3. הסר עוברים מן הרחם והשק מי שפיר, באמצעות מלקחיים (איור 1 ג). עוברי מקום בHBSS קר כקרח טרי.
    הערה: המלבן ב1D איור מציין את מיקומו של המוח התיכון הגחון העוברי.
  4. מניחים את העוברים תחת מיקרוסקופ לנתיחה (הגדלה 10x) ולנתח את mesencephalicקשת על ידי חיתוך במוח במצר ובאזור גבול mesencephalic-diencephalic, באמצעות bioscissor ומלקחיים (איור 1E, עיין באיור 1 א לקווים של חתך).
  5. לאחר שלקח את כל המוח התיכון, לעשות חתך במוח התיכון mediodorsal (איור 1F).
  6. הסר קרומי המוח, תוך שימוש בשני מלקחיים (איור 1H).
    הערה: שלב קריטי: צעד זה הוא חיוני לתשואה עצבית אופטימלית והישרדות. מאז תנאי התרבות הם אופטימליים לתאי מוח, רוב התאים מהרקמות המקיפות למות לאחר ציפוי והאות אפופטוטיים מהרקמה זו עלולה לגרום נזק לשלמות של התרבויות.
  7. שטח את רקמת המוח התיכון בצלחת פטרי להתבונן בצורת הפרפר ולחתוך כמחצית מכל כנף, באמצעות סכין גילוח מעוקר (איור 1H, I).
    הערה: איור 1J מתאר את המוח התיכון הגחון המבודד.
  8. העבר אתחתיכת המוח התיכון הגחון לתוך HBSS קר כקרח בצינור חרוטי 15 מיליליטר ולהמשיך בעובר הבא.
    הערה: שלבי 2.1-2.8 לא צריכים לקחת יותר משעה 1. שמירה על העוברים מעבר למסגרת זמן זו על קרח יורדת כדאיות תא באופן משמעותי.

3. דיסוציאציה של תאי המוח תיכונים הגחון

  1. העבר את החתיכות של המוח התיכון הגחון מתחת לזרימה למינרית. הסר את HBSS ולהוסיף 1 מיליליטר מחומם מראש (37 ºC) 0.05% טריפסין-EDTA לתוך צינור חרוטי (כרכים מספיק לתקופה של עד 12 חתיכות של המוח התיכון הגחון). דגירה הרקמה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות.
  2. הסר טריפסין-EDTA מתחת למכסה המנוע ולהוסיף בינוני דה-הפעלת 1 מיליליטר (הסרום יהיה לבטל טריפסין) לרקמות.
  3. הסר את מדיום שחרור משרות ולשטוף את הרקמה ב 1 מיליליטר בינוני מלא פעמיים.
    הערה: יש להימנע מהסרה כל המדיום מהצינור וpipetting הרקמות, כדי למנוע השלכת התאים ניתקו.
  4. הוסף בינוני מלא 1ml וטריטurate הרקמה עם טפטפת זכוכית מלוטשת אש. למנוע היווצרות של בועות ולהמשיך triturating עד השעיה תא בודדת מושגת.
    הערה: בדרך כלל, 8-10 עוברים בקצה המוגבל נדרשים לניתוק מוחלט.
  5. צנטריפוגה התאים ב 400 XG במשך 5 דקות בRT ולהסיר את המדיום.
  6. מחדש להשעות גלולה ב 1 מיליליטר בינוני מלא על ידי pipetting לאט מעלה ומטה עד ארבע פעמים.

4. תאי ציפוי הגחון המוח תיכונים

  1. מערבבים 10 μl של ההשעיה התא עם פתרון כחול 90 μl Trypan ולספור את מספר התאים עם hemocytometer.
    הערה: ליכולת הקיום של התאים גם ניתן לבדוק בשלב זה.
  2. הנח כובעי צינור microcentrifuge מעוקרים ב100 מ"מ צלחות פטרי ולהעביר את coverslips פולי-L-ornithine / Laminin המצופה, באמצעות מלקחיים, אחד בכל פעם בחלק העליון של הכובעים.
    הערה: אין לשטוף את coverslips ולמנוע התייבשות laminin, שכן הדבר עלול לגרום לuneveתרבויות n וירידה בשרידות של התאים.
  3. כוון את עוצמת הקול ל1,500 תאים לכל 1 μl על ידי הוספה בינונית מלא ולהוסיף 100 μl (כולל של 150,000 תאים) של ההשעיה התא על גבי כל coverslip (נפח אופטימלי כדי לכסות את פני השטח של coverslip ללא שפיכה). סגור את צלחות פטרי דגירה אותם במשך שעה 1 בתרבית רקמת חממת humidified (37 ° C, 5% CO 2).
    הערה: שלב קריטי: צעד זה נדרש לשיפור ההתקשרות ויכולת הקיום של התאים ולהגדלת מספר coverslips לעובר. לחלופין, ניתן להעביר את התאים ישירות לתוך הבארות (coverslips מכיל) אבל מספר התאים צריך להיות מוגבר ל350,000 לכל טוב (במקום 150,000). במילים אחרות, שימוש בשיטה זו, ניתן לרכוש 8-10 coverslips, תוך העברה ישירה מניבה כ 3-4 coverslips בגלל התאים, אשר לצרף לצלחות (לצד או מתחת לcoverslips). Viabili הממוצעty של התרבויות, שימוש בשיטה זו היה כ -90%.

5. תרבות צמיחה ותחזוקה

  1. אחרי שעה 1 של דגירה, להעביר בזהירות את coverslips כולל הבינוני לתוך צלחות 24 גם, המכיל בינוני מחומם מראש (עד 37 מעלות צלזיוס) מלא 400 μl (נפח כולל: 500 μl). דגירה התאים O / N ב 37 מעלות צלזיוס.
  2. תוך 24 שעות לאחר הדגירה של הבארות, בעדינות להוסיף בינוני שלם 500 μl לכל אחד.
    הערה: כמה השעות הראשונות היא השלב הקריטי ביותר להישרדות של נוירונים דופאמין ואת מספר התאים ששרדו אינו משנה באופן משמעותי מעבר לנקודה זו.
  3. אל תוסיף מדיה נוספת לתרבויות בשבועיים הראשונים או עד הבינוני הופך להיות צהוב. אם culturing במשך יותר משבועיים או בינוניים שינויי צבע למחצית חליפין של התקשורת (μl 500) הצהוב, עם תקשורת מלאה טרי מחוממת מראש (בדרך כלל כל שבועיים).
    הערה: נוירונים דופאמין בתרבויות תשרודנה במשך יותר מ -6 שבועות בתנאים אלה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

אימונוהיסטוכימיה נגד hydroxylase טירוזין (ה ') עולה כי בין 0.5-1% מהתאים בתרבית הם דופאמין. תחזיות עצביות מופיעות בתוך 2 שעות לאחר ציפוי ועל ידי ביום הראשון, אקסונים ודנדריטים ניתן להבחין (איור 2), באמצעות טירוזין hydroxylase (TH) ונוגדני microtubule הקשורים חלבון 2 (MAP2) (איור 3). נוירונים לשרוד במשך יותר משישה שבועות ולהראות תולדה נרחבת. יחס נוירון, גליה בתרבויות קשור באופן ישיר לריכוז של סרום בטווח הבינוני, כפי שהוצג קודם. תוך ביטול FBS מה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

נוירונים דופאמין במוח תיכון הם המקור העיקרי של דופמין במערכת העצבים המרכזית. הם חולקו לשלוש קבוצות, compacta סעיפי nigra substantia (SNpc), אזור הגחון tegmental (VTA) ושדה retrorubral (RRF) 10, 11. הנוירונים בSNpc וVTA להצמיח מסלולים עיקריים דופאמין, mesocortical, mesolimbic וNigro-striatal, מעורבים בפונקציות כגון שליטה על רגש, מוטיבציה והתנהגות מוטורית. פטירה של תאי העצב בSNpc והפרעה תפקודית של מערכת nigrostriatal היא המאפיין העיקרי של פתולוגי ההפרעה ניוונית של מערכת ע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

לא הוכרז על ניגוד עניינים.

תודות

עבודה זו בוצעה באמצעות המחלקה למדעי המוח, המחלקה לרפואה, קרנות הסטארט-אפ של אימפריאל קולג' בלונדון ל-K.N.A.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תערובת חומרים מזינים בינוניים של Eagle מעובדת F-12Invitrogen11330
תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS) (1X),Invitrogen24020-117
, מומת בחום (FBS)Invitrogen16140
N2 (100X),Invitrogenנוזלי 17502-048
D-(+)-גלוקוז תמיסה (45% (משקל/נפח) במיםסיגמאG8769
סרום בקר אלבומין BSAסיגמאA9430
למינין מקרום הבסיס של סרקומה עכברים אנגלברת-הולם-נחילסיגמאL2020
פניצילין/סטרפטומיציןInvitrogen15070
טריפסין (0.05% (משקל/נפח)Invitrogen25300
סרום בקר תרבית תאים אלבומין (BSA) נבדקהSigma A9418
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)SigmaP3813
נוגדן אנטי-טירוזין הידרוקסילאז (Th)Pel-Freez BiologicalsP60101-0 
Poly-L-ornithine, תמיסה 0.01%SigmaP4957
נוגדן Anti-Map2 (חלבון הקשור למיקרו-צינורות-2A ו-2B)MilliporeMAB3418
נוגדן נגד סינפסין-1MilliporeAB1543P
Alexa Fluor 488 חמור נגד ארנב IgG    נוגדניםבדיקות מולקולריותA-21206
Alexa Fluor 594 חמור נגד ארנב IgG    נוגדניםבדיקות מולקולריותA-21207
Alexa Fluor 488 חמור נגד כבשים IgG    נוגדניםבדיקות מולקולריותA-11015
Alexa Fluor 594 חמור נגד כבשים IgG    נוגדניםבדיקות מולקולריותA-11016
Alexa Fluor 594 חמור נגד עכבר IgG    נוגדניםבדיקות מולקולריותA-21203
תמיסה כחולה טריפן (0.4% (משקל/נפח))Biowhittaker17-942E
מיקרוסקופ סטריאוקארל זייססטמי 2000-C
מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוכהקארל זייסAxiovert 40 C
מלקחיים דומונטכלים מדעיים עדיניםמאי-45
מלקחיים להחליק כיסוי – DumoxelFine Scientific Tools11251-33
שני דומונט #45 מלקחיים – DumoxelFine Scientific Tools11245-30
מחזיק להב/מפסק אחיזה שטוחה - 11 ס"מFine Scientific Tools10052-11
מספריים לקשתית הסטודנטים - ישר 11.5 ס"מFine Scientific Tools91460-11
תאורת הלוגן סיבים אופטייםNikonMKII
חד פעמי בורוסיליקט זכוכית פסטר פיפטותפישרברנד13-678-20C
המוציטומטרProscitechSVZ2NIOU
0.2 ומיקרו; m יחידות סינון סטריליותNalgeneNL-CE-156-4020
100x20 מ"מ צלחות פטריBD Biosciences351005
כיסוי עגול החלקה #1 עובי זכוכית גרמנית 12 מ"מזכוכית בלקו1943-10012 
סרום בקר עוברי נוזלי תוסף

מקורות

  1. Prasad, K. N., et al. Establishment and characterization of immortalized clonal cell lines from fetal rat mesencephalic tissue. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 30A, 596-603 (1994).
  2. Fall, C. P., Bennett, J. P. Characterization and time course of MPP+ -induced apoptosis in human SH-SY5Y neuroblastoma cells. J Neurosci Res. 55, 620-628 (1999).
  3. Choi, H. K., Won, L., Roback, J. D., Wainer, B. H., Heller, A. Specific modulation of dopamine expression in neuronal hybrid cells by primary cells from different brain regions. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 8943-8947 (1992).
  4. Alavian, K. N., Sgado, P., Alberi, L., Subramaniam, S., Simon, H. H. Elevated P75NTR expression causes death of engrailed-deficient midbrain dopaminergic neurons by Erk1/2 suppression. Neural Dev. 4, 11(2009).
  5. Chung, C. Y., et al. The transcription factor orthodenticle homeobox 2 influences axonal projections and vulnerability of midbrain dopaminergic neurons. Brain. 133, 2022-2031 (2010).
  6. Betarbet, R., Sherer, T. B., Greenamyre, J. T. Animal models of Parkinson's disease. Bioessays. 24, 308-318 (2002).
  7. Schober, A. Classic toxin-induced animal models of Parkinson's disease: 6-OHDA and MPTP. Cell Tissue Res. 318, 215-224 (2004).
  8. Chesselet, M. F., Richter, F. Modelling of Parkinson's disease in mice. Lancet neurology. 10, 1108-1118 (2011).
  9. Takeshima, T., Johnston, J. M., Commissiong, J. W. Mesencephalic type 1 astrocytes rescue dopaminergic neurons from death induced by serum deprivation. J Neurosci. 14, 4769-4779 (1994).
  10. Sgado, P., et al. Slow progressive degeneration of nigral dopaminergic neurons in postnatal Engrailed mutant mice. PNAS. 103, 15242-15247 (2006).
  11. Alavian, K. N., et al. The lifelong maintenance of mesencephalic dopaminergic neurons by Nurr1 and engrailed. J Biomed Sci. 21, 27(2014).
  12. Simon, H. H., Bhatt, L., Gherbassi, D., Sgado, P., Alberi, L. Midbrain dopaminergic neurons: determination of their developmental fate by transcription factors. Ann N Y Acad Sci. 991, 36-47 (2003).
  13. Bjorklund, A., Dunnett, S. B. Dopamine neuron systems in the brain: an update. Trends Neurosci. 30, 194-202 (2007).
  14. Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson's disease: mechanisms and models. Neuron. 39, 889-909 (2003).
  15. Dexter, D. T., Jenner, P. Parkinson disease: from pathology to molecular disease mechanisms. Free Radic Biol Med. 62, 132-144 (2013).
  16. Schapira, A. H. Aetiopathogenesis of Parkinson's disease. J Neurology. 258, S307-S310 (2011).
  17. Chung, C. Y., et al. Cell type-specific gene expression of midbrain dopaminergic neurons reveals molecules involved in their vulnerability and protection. Hum Mol Gen. 14, 1709-1725 (2005).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Ventral Midbrain

מאמרים קשורים