מאמר שיטה

מותנה הגנטי Transsynaptic איתור במוח העכבר עוברי

DOI:

10.3791/52487

⸱

22 בדצמבר 2014

 , 
1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Saarland School of Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תוך ניצול אסטרטגיה גנטית בינארית אנו מספקים פרוטוקול מפורט למעקב אחר מעגלים עצביים בעכברים המבטאים עוקבים טרנס-סינפטיים משלימים לאחר רקומבינציה בתיווך Cre. מכיוון שייצור עוקבים ספציפיים לתא מקודד גנטית, הגישה הניסיונית שלנו מתאימה לחקור את היווצרותם והתבגרותם של מעגלים עצביים במהלך התפתחות המוח העוברי של עכברים ברזולוציית תא בודד.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מעקב אחר נתיב אנטומי הוא בעל חשיבות מכרעת לפענוח הקשר בין המוח להתנהגות. עם זאת, חשיפת היווצרותם של מעגלים עצביים במהלך ההתבגרות העוברית של המוח היא מאתגרת מבחינה טכנית מכיוון שרוב שיטות המעקב הטרנס-סינפטיות שפותחו עד כה תלויות בהזרקת מעקב סטריאוטקסי. כדי להתגבר על בעיה זו, פיתחנו אסטרטגיה גנטית בינארית למעקב גנטי טרנס-סינפטי מותנה במוח העכבר. לקראת מטרה זו יצרנו שני זני עכברים משלימים כדי לבטא באופן סלקטיבי את לקטין השעורה הטרנס-סינפטי הדו-כיווני (BL) ואת העוקב הטרנס-סינפטי הנסיגתי Tetanus Toxin שבר C מלוקוס ROSA26 לאחר רקומבינציה בתיווך Cre. ייצור עוקב ספציפי לתא בעכברים אלה מקודד גנטית ואינו תלוי בהזרקת מעקב מכנית. לכן הגישה הניסויית שלנו מתאימה לחקר היווצרות מעגלים עצביים במוח העכברי העוברי. יתר על כן, מכיוון שהעברת עוקבים על פני סינפסות תלויה בפעילות סינפטית, ניתן להשתמש בזני עכברים אלה כדי לנתח את התקשורת בין אוכלוסיות עצביות מוגדרות גנטית במהלך התפתחות המוח ברזולוציה של תא בודד. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט למעקב טרנס-סינפטי בעוברי עכברים באמצעות האללים הרקומביננטיים החדשים ROSA26. השתמשנו בטכניקה ניסויית זו על מנת לתאר את המעגלים העצביים העומדים בבסיס התבגרות ציר הרבייה במוח העכבר הנקבה המתפתח.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מעקב נתיב האנטומי הוא אחד הכלים הנפוצים ביותר בשימוש לפענח את הקשר בין המוח והתנהגות 1. קידום בטכנולוגיות מעגל התחקות עצביות העניק מדעני מוח עם היכולת לעקוב אחר מעגלים עצביים מאוכלוסיות נוירון זיהו גנטי בעכברים 2. למרות התקדמות הטכנולוגית אלה נותרים מאתגרים לפענח את היווצרותם של מעגלים עצביים במיוחד בתקופת התבגרות עוברית. סיבה לכך הוא שרוב שיטות המעקב שפותחו עד היום מבוססים על הזרקת stereotaxic של קליעים נותבים transsynaptic או וירוסי neurotropic מהונדסים גנטי (איור 1) 2,3. בעוד טכניקות אלה להשיג רזולוציה מרחב ובזמן של קישוריות, כמה מגבלות מובנות כגון זריקות נותב מאתגרות מבחינה טכנית למוח המתפתח, שחזור של אתר הזרקה, דלקת פוטנציאלית במקום ההזרקה וimpor ביותרcytotoxicity tantly נגרמת על ידי וירוסי neurotropic להגביל את השימוש בם 4.

שיטה חלופית היא להביע קליעים נותבים transsynaptic כtransgenes בעכברים שעברו מוטציה גנטית. יש לנו לאחרונה שונו בטכניקה זו ופיתחתי מערכת בינארית transsynaptic גנטי התחקות למפות את המעגלים העצביים של כל אוכלוסייה עצבית מזוהה גנטי 5. האסטרטגיה הניסיונית שלנו מבוססת על שני זנים חדשים לדפוק בעכבר, המבטאים גם לקטינים שעורה נותב דו-כיווני (BL) 6 או בר רעלנים נותב מדרדר C התמזג GFP (GTT) 7 מלוקוס ROSA 26 לאחר Cre תיווך רקומבינציה. כאן אנו משמשים זני עכבר אלו כדי להביע את BL וGTT בתאי עצב המייצרים kisspeptin, neuropeptide שמעורב בויסות ההתבגרות של ציר הרבייה 8,9 באופן סלקטיבי. אנו מראים כי טכניקה זו היא מתאימה כדי לחזות את ההתפתחות והתבגרות של נשיקהמעגלים עצביים peptin במהלך התפתחות עוברית של מוח העכבר נקבת 5.

אסטרטגית רבייה

R26-BL-IRES-τlacZ (BIZ) והקווים נותב R26-GFP-TTC (GTT) הם לדפוק בזנים 5 שנושאים אללים ROSA26 רקומביננטי. R26-BIZ ואללים R26-GTT הם תעתיק שקטים בשל נוכחותם של איתות חזקה תעתיק תחנה, שמעוטרת בשני אתרי loxP 5. ביטוי של transgene BIZ וGTT מופעל על ידי ההסרה בתיווך Cre של אות תחנת תעתיק. ניתן להשתמש אללים R26-BIZ וR26-GTT באופן עצמאי על ידי פשוט חצייה עם קו נהג Cre. להטרוזיגוטיים בעלי חיים ניתוח לאללים Cre וR26 המתאימים ניתן להשתמש. המלטת ביצוע Cre אחד או אחת אלל R26, בהתאמה, צריכה לשמש כקבוצת ביקורת. לחלופין, אפשר גם ליצור triple לדפוק בבעלי חיים שנשאו את אללים Cre, R26-BIZ וR26-GTT, אולם זה יחייב צלב אחד נוסף.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: אתיקה הצהרה: נהלים כרוכים בנושאי בעלי חיים אושרו על ידי ועדת רווחת בעלי החיים של אוניברסיטת המבורג ובאוניברסיטת Saarland.

1. הכנה וקיבוע של רקמה העוברית

  1. מסדרים את כל הציוד הדרוש ללנתח את העוברים ולהכין פתרונות לקיבעון הבא של הרקמה לפני להקריב בעלי החיים.
    הערה: תמיד להכין פתרון paraformaldehyde 4% טריים (PFA) (4% PFA ב 0.1 M מלוח פוספט (PBS), להתאים את ה- pH 7.4).
  2. להרדים נקבת עכבר בהריון בעיתוי בנוהל שאושר מבחינה אתית.
  3. העבר את העכבר על גבי פלטפורמה. להרטיב את הצד הגחוני של הבטן עם 70% אתנול ו לעשות חתך אנכי באמצעות מספריים חדים לחשוף את חלל הבטן.
  4. זהה את השרשרת העוברית ולמשוך אותו החוצה מלקחיים בוטים באמצעות זהירות ולמקם אותו לתוך PBS קר כקרח.
  5. הסר את העוברים הבודדים מהשרשרת העוברית באמצעות מספריים ומלקחיים בסדר. הסרה של רקמה נוספת סביב העוברים ולשטוף אותם בPBS קר כקרח.
  6. לקחת ביופסיה זנב קטנה (לפני העברת העובר לPFA) ודגירה אותו במאגר תמוגה זנב לזיהוי המין וgenotyping אלל נותב PCR.
  7. תתחיל מהעובר בצד לרוחב ביותר ולהעביר כל עובר בנפרד לתוך צינור המכיל 4% PFA קר כקרח על קרח על שייקר.
  8. משרים את העוברים בגיל צעיר יותר E13.5 או עבור 1.5 שעות על קרח עם רעד קבוע. משרים את העוברים בE14.5 הגיל וE15.5 תמורת 2.5 שעות על קרח עם רעד קבוע.
  9. לE16.5 גיל עוברים או יותר, לערוף ולהסיר את העור החיצוני לפני השריית הראש בפתרון PFA. ראשי עוברי E16.5 יכולים להיות טבולים תמורת 4.5 שעות על קרח עם רעד קבוע.
  10. לאחר הקיבוע מתאים, לשטוף את העוברים שלוש פעמים עם PBS קר כקרח. מעביר את העוברים לתוך סוכרוז 30% בפתרון PBS על 4 מעלות צלזיוס עד שהם שוקעיםלתחתית.

2. הקפאה

  1. לסדר את כל החומרים הדרושים לפני שמתחיל את תהליך ההקפאה: cryo-עובש, cryo-כפפות, מלקחיים אנטומולוגיה במשקל הנוצה, בטוש ומתחם טמפרטורה אופטימלי חיתוך (אוקטובר)
  2. תווית cryo-העובש עם סמן אלכוהול עמיד קבוע (להזכיר את הכיוון של רקמות, תאריך וגנוטיפ). הכן רפש של קרח יבש כתוש ו 100% אתנול בדלי קרח. מניחים כוס זכוכית בתוך המכיל איזופנטאן. חכה 10 דקות לאיזופנטאן להתקרר.
  3. בינתיים להסיר את הרקמה מפתרון סוכרוז, נגב את סוכרוז העודף סביב הרקמות באמצעות מגבוני מעבדה. העברת הרקמה לתוך cryo-עובש שכותרתו מראש עם אוקטובר מספיק כדי לכסות את הרקמה. הימנע מכל בועות אוויר ב- OCT; במיוחד סביב הרקמה.
  4. כוון את הרקמה ב אוקטובר באמצעות מלקחיים אנטומולוגיה במשקל נוצה, כדי למנוע נזק לרקמות. התחל הקפאה על ידי העברת cryo-molד לאמבטיה איזופנטאן מקורר מראש. לא להתיז איזופנטאן ל- OCT כפי שהוא לא להקפיא כראוי. עטוף את הדגימות ברדיד אלומיניום ולאחסן ב -80 ° C.

3. Cryosectioning

  1. לחתוך 14 מיקרומטר חלקים סידוריים דקים בסדרה "חמש באמצעות cryostat ולאסוף בשקופיות זכוכית SuperFrost® פלוס עבור immunofluorescence ניתוח (IF). אחסן את השקופיות ב -80 ° C עד מנוצל.

4. הדמיה Tracer שימוש בפרוטוקול Tyramide איתותים ההגברה (TSA)

  1. הכן את המאגרים וחומרים כימיים הנדרשים לצביעה. תמיד טרי להכין את חיץ טריס-NaCl-Tween (TNT) ביום השימוש.
    1. הכן חיץ TNT באמצעות 100 מיליליטר של 1 M טריס- HCl pH 7.5, 30 מיליליטר של 5 M NaCl וDDH 2 O עד נפח סופי של 1 ל הוסף 500 μl של Tween 20 בעזרת פיפטה 1 מיליליטר. הוסף את Tween 20 לאט ולשטוף את פיפטה מעלה ומטה מספר פעמים כדי לוודא שכל Tween 20 הוא בפתרון.
    2. הכן טריס-NaCl-חסימת חיץ (TNB) באמצעות של 1 M טריס-HCl 100 מיליליטר 7.5 pH, 30 מיליליטר של 5 M NaCl וDDH 2 O עד נפח סופי של 1 ל הוסף 5 גרם חסימה מגיב (מסופק עם ערכה) לאט במרווחים קטנים למאגר תוך ערבוב. מחממים את הפתרון בהדרגה ל -55 מעלות צלזיוס עם ערבוב רציף לפזר מגיב חסימה לחלוטין (זה לא צריך לקחת יותר מ30-60 דקות). כדי להשיג חימום אחיד להשתמש אמבט מים ב 55 ° C. הפתרון יופיע חלבי. להביא את הפתרון לטמפרטורת חדר לפני השימוש. Aliquot ולאחסן ב -20 ° C לאחסון לטווח ארוך.
    3. מחדש מגיב ביוטין tyramide (מצורף לערכה) בכיתה HPLC-ביולוגיה מולקולרית / DMSO. תלוי איזה ערכה משמשת את הכמות המתאימה של DMSO עשויה להשתנות. אחסן את פתרון המניות ב 4 מעלות צלזיוס.
      הערה: סעיפים מבעלי חיים הטרוזיגוטיים לאללים Cre וR26 המתאימים יכולים לשמש לניתוח מעגל. שימוש שלections מהמלטת ביצוע Cre אחד או אחת אלל R26, בהתאמה, כפקדים שליליים. פנק את שקופיות בקרה שליליות בדיוק כמו שקופיות מבעלי חיים כפולים הטרוזיגוטיים. בנוסף, כולל שקופיות שליטה אחד מבעלי חיים כפולים הטרוזיגוטיים אבל להשאיר את מגיב TSA (שליטת unamplified).
  2. באמצעות אזמל טרי חד להסיר אוקטובר העודף המקיף את חלקי רקמות ולסמן את הגבול סביב החלקים עם עט PAP.
  3. ייבש את השקופיות במשך 2-3 דקות בטמפרטורת חדר (RT). שטוף את השקופיות ב3x RT עם TNT במשך 5 דקות כל אחד. דגירה השקופיות ב RT למשך 30 דקות בשיעור של 0.3% פתרון H 2 O 2 במתנול קר כקרח כדי להרוות את פעילות peroxidase אנדוגני.
  4. 3x לשטוף עם PBS במשך 5 דקות כל אחד ב RT. דגירה של 10 דקות ב 0.5% Triton-X 100 בPBS לpermeabilization רקמות. שטוף את השקופיות ב3x RT עם TNT במשך 5 דקות כל אחד.
  5. בלוק עם TNB (חסימת פתרון, 200-300 μl לכל שקופית) במשך 30דקות ב RT בתא humidified. ודא שכל החלקים מכוסים לחלוטין על ידי TNB. אל תתנו לשקופיות להתייבש בין הצעדים.
  6. מסננים את חיץ חסימת עודף ולהחיל antiserum העיקרי הכרה נותב (1: 1,000 העז נגד WGA לBL, 1: 15,000 ארנב נגד GFP לGTT) מדולל בTNB לשעה 2 ב RT או הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. הקפד להשתמש נפח מספיק כדי לכסות את קטע הרקמה (200-300 μl לכל שקופית) לחלוטין.
    הערה: דילולים antisera העיקריים המומלצים כאן עשויים להיות מותאמים.
  7. שטוף את השקופיות ב3x RT עם TNT במשך 5 דקות כל אחד עם תסיסה.
  8. דגירה הקטעים עם antiserum המשני biotinylated הכרה בשורה של antiserum הראשון (1: IgG 500 הסוס האנטי-העז לאנטי-WGA, 1: IgG נגד ארנב העז 5,000 לאנטי-GFP בTNB עבור שעה 1 ב RT).
  9. 3x לשטוף עם TNT ב RT במשך 5 דקות כל אחד עם תסיסה. דגירה ב 1: 100 streptavidin (SA) peroxidase חזרת -conjugated (SA-HRP wi, ובלבדth הערכה) בTNB למשך 30 דקות ב RT בתא humidified. שטוף את השקופיות ב3x RT עם TNT במשך 5 דקות כל אחד. בינתיים להפשיר TSA.
  10. לדלל TSA 01:50 בdiluent ההגברה TSA (מצורפת לערכה; להשתמש בערכת TSA להדמיה של BL וערכת TSA + לGTT). דגירה סעיפי הרקמות בTSA המדולל לבדיוק 10 דקות ב RT. לדלל TSA רק לפני השימוש, באופן אידיאלי בשלב הכביסה הקודם, לא להשתמש בכל מגיב TSA מדולל שנותר לניסויים עתידיים; תמיד להכין טרי.
  11. שטוף את השקופיות ב3x RT עם TNT במשך 5 דקות כל אחד עם תסיסה. דגירה עם 1: 500 המצומד Alexa Fluor® 546 streptavidin בTNB למשך 30 דקות ב RT. שטוף את השקופיות ב3x RT עם TNT במשך 5 דקות כל אחד עם תסיסה.
  12. דגירה של 10 דקות ב 5% פתרון bisbenzimide PBS ב RT עבור מכתים גרעיני. שטוף את השקופיות ב3x RT עם TNT במשך 5 דקות כל אחד עם תסיסה. הר עם Fluromount G ולבצע epifluorescence או confocal.
    פתרון בעיות: יעילות של העברה נותב תהיה תלויה ברמת הביטוי של מוקד ROSA26 בתאים המייצרים (שנקבע על ידי קו נהג Cre בשימוש) ועל המעגלים העצביים ניתחה (למשל מספר הנוירונים הפקה נותב, וכו 'התכנסות). לכן דילולים antisera העיקריים המומלצים כאן עשויים להיות מותאמים כדי למנוע אות נמוכה או עודפת. רקע תמיד צריך לנתח באמצעות שקופיות בקרה מתאימות (ראה לעיל).

5. τlacZ מכתים לסעיפים עובריים

  1. הכן את המאגרים וחומרים כימיים הנדרשים לצביעה. תמיד טרי להכין את חיץ C LacZ לפני השימוש.
    1. הכן 5-bromo-4-כלורו-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) פתרון מניות (40 מ"ג / מיליליטר) על ידי הוספת 40 גרם של X-gal עד 1 dimethylformamide מיליליטר 70% (DMF). מכסה ברדיד האלומיניום ולאחסן ב -20 ° C לאחסון לטווח ארוך.
    2. הכן tetrazolium הכחול ניטרו (NBT) stפתרון Ock (50 מ"ג / מיליליטר) על ידי הוספת 50 גרם של NBT לDMF 1 מיליליטר 70%. מכסה ברדיד האלומיניום ולאחסן ב -20 ° C לאחסון לטווח ארוך.
    3. הכן LacZ קוֹבֵעַ באמצעות 80 μl של glutaraldehyde 25%, 5 מיליליטר של 4% PFA, 20 μl של 1 M MgCl 2, של 500 מ"מ EGTA 100 μl, 1 מיליליטר של חיץ pH M פוספט 1 7.4 וDDH 2 O עד גמר נפח של 10 מיליליטר.
    4. הכן LacZ חיץ 1 מיליליטר באמצעות של 1 M MgCl 2, 5 מיליליטר של 500 מ"מ EGTA, 50 מיליליטר של 1 M pH חיץ פוספט 7.4 וDDH 2 O עד נפח סופי של 500 מיליליטר.
    5. הכן B חיץ LacZ באמצעות 1 מיליליטר של 1 M MgCl 2, 5 מיליליטר של 500 מ"מ EGTA, 5 deoxycholate מיליליטר של 1% נתרן, 10% NP-40 100 מיליליטר, 50 מיליליטר של חיץ פוספט pH 1 M 7.4 וDDH 2 O עד נפח סופי של 500 מיליליטר.
    6. הכן חיץ C LacZ על ידי הוספת 10 μl של פתרון מניות NBT ו12.5 μl של מניות פתרון X-gal עד 1 מיליליטר של חיץ B. LacZ הפוך טרי רק לפני השימוש ומכסים ברדיד אלומיניום.
  2. ייבש את השקופיות ב RT לפחות במשך 10-15 דקות (בינתיים להכין שקופיות עם עט PAP).
  3. לתקן את הסעיף עם LacZ קוֹבֵעַ למשך 2 דקות בטמפרטורת חדר בתא humidified בתוך קטר-מנדף כימי. לשטוף 3 פעמים עם PBS בתוספת 2 מ"מ MgCl 2.
  4. יש לשטוף את השקופיות עם א 'חיץ LacZ שטוף את השקופיות עם LacZ חיץ 3 פעמים במשך 10 דקות כל אחד ב RT. לשטוף 2 פעמים עם החיץ B LacZ במשך 5 דקות כל אחד. דגירה השקופיות בC חיץ LacZ ב30-37 מעלות צלזיוס במשך שעה 6 או לילה בתא humidified.
    הערה: הוספת נפח מספיק של חיץ C LacZ; שקופיות לא צריכים להתייבש במהלך דגירה.
  5. לאחר הדגירה מתאימה לשטוף את השקופיות עם PBS בתוספת 2 מ"מ MgCl 2. יש לשטוף את החלקים בקצרה עם DDH 2 O. Coverslip עם ג'לטין גליצין של מאיר. מתאים למיקרוסקופ אור מצויד בסט-אפ הדמיה התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC).

6. Gendאה וGenotyping Tracer

  1. הכן מאגר תמוגה זנב באמצעות 1 מיליליטר של 1 M טריס- HCl pH 8.5, של 500 מ"מ EGTA 100 μl, 200 μl של 10% SDS, 400 μl של 5 M NaCl וDDH 2 O כדי לפצות נפח סופי של 10 מיליליטר.
  2. הוסף 500 μl של חיץ תמוגה זנב לכל צינור Eppendorf המכיל ביופסית זנב. להוסיף K proteinase לריכוז סופי של 100 מ"ג / מיליליטר. דגירה הלילה על שייקר ב 55 ° C.
  3. צנטריפוגה דגימות 17,000 XG במשך 10 דקות ב RT. מעביר את supernatant לצינור צנטריפוגות חדש. הוסף 500 μl של isopropanol לsupernatant. מערבבים במשך לפחות 5 דקות על ידי היפוך הצינורות למעלה ולמטה.
  4. ספין בצנטריפוגות ב 17,000 XG במשך 5 דקות בRT. יוצקים את supernatant. הוסף 200 μl של 70% אתנול. לנער במשך 5 דקות לפחות.
  5. צנטריפוגה ב17,000 XG במשך 5 דקות. הסר supernatant עם Pipetman (לא לשפוך את). ייבש את הכדור בתא חם (37 מעלות צלזיוס) במשך 15-30 דקות.
  6. גלולה גלולה ב100 μlpH הנמוך TE 8.0 או מים באמצעות טיפים רחבים נשא מסוננים. שים ב -55 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 ועל 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה להמסה נכונה. חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
  7. השתמש μl 1 של ה- DNA לתגובת PCR (תערובת תגובת 50 μl המכילה 1 μl של DNA זנב, 2.5 μl DMSO, 10:00 של כל צבע יסוד, 25 מיקרומטר של כל dNTP, וbetaine 1M). פריימרים PCR לgenotyping וזיהוי מין רשומים בטבלת חומרים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סעיף זה מציג תוצאות נציג שניתן להשיג בעבודה עם R26-BIZ (Z RES-τlac L- אני B) וR26-GTT (G FP- TT C) אללים. כאן אנו משתמשים R26-BIZ ואללים R26-GTT לנתח את ההבשלה של המעגלים העצביים המסדירים את ציר הרבייה. הרבייה בבעלי החוליות נשלטת מרכזית על ידי קבוצה קטנה של תאי עצב בהיפותלמוס, שמפרישים הורמון משחרר גונדוטרופין (GnRH). Kisspeptin, activator חזק של נוירונים GnRH, היה מעורב בהסדרת פעילותם של נוירונים GnRH, עם זאת, כאשר המעגלים העצביים ב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש להביע קליעים נותבים transsynaptic כtransgenes להתחקות המעגלים העצביים של אוכלוסיות נוירונים מוגדרות גנטי יש מספר יתרונות בהשוואה להזרקת stereotaxic של קליעים נותבים או וירוסי neurotopic. ראשית, נותב מופק כחלבון אנדוגני ולכן אינו מפיק כל תגובה חיסונית ומסלול עצבי סלקטיבית ניתן לנתח בבעלי חיים שונים עם שחזור גבוה. שנית, משום שזו שיטה לא פולשנית זה יכול להיות מנוצל כדי לאתר את המעגלים מתאי עצב אינו נגישים בקלות לזריקות stereotaxic, למשל ברחם. מגבלות כוללות יעילות נמוכה בד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לא הוכרז על ניגוד עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים למייקל קנדליש על ההערות הביקורתיות על כתב היד. פרויקט זה נתמך על ידי מענקי Deutsche Forschungsgemeinschaft BO1743/6 ו-SFB/TRR 152 P11 ו-Z02 לאולריך בוהם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ביסבנזימיד (צבע Hoechst 33258)Sigma14530-100MG
אתנולSigma32205-1L
תבנית קריו (Peel-a-way)Polyscience Inc.18646A-122 x 22 x 20 מ"מ
DMSOSigmaD8418-100ML
דימתיל פורממיד (DMF)VWR כימיקלים23470,293
EGTAROTH3054.3
Fluoromount GSouthern Biotech0100-01
GlutaraldehydeSigmaG5882-50ML
מי חמצןסיגמא34988-7
איזופנטן (מתיל 2-בוטאן)סיגמאM32631-2.5L
גליצין ג'לטין של קייזרMerck1092420100
מתנולסיגמא494437-1L
MgCl2SigmaM2670-100G
NaClROTHHN00.2
NBTסיגמא298-83-9
תחליף Nonidet P40Fluka743.85
OCTLeica14020108926
PAP עטDakoS2002
ParafarmaldehydeSigmaP6148-1KG
נתרן דאוקסיכולאטסיגמאD6750-25G
סוכרוזסיגמאS7903-1KG
Superfrost slidesThermo ScientificFT4981GLPLUS
ערכת TSAPerkinElmerNEL700
TSA plus kitPerkinElmerNEL749A001KT
TrisROTHAE15.2
Triton-X 100ROTH3051.2
Tween 20ROTH9127.1
X-galROTH2315.1
מיקרוסקופ CryostatLeicana
Light מצויד בהדמיית DICZeissAxioskop2 מצויד בתוכנת
מיקרוסקופ FluroscenceZeissAxioskop2 מצויד בתוכנת
PhotoshopAdobePS6
Goat anti-WGA (מזהה BL)Vector LaboatoriesAS-2024
Biotinylayted סוס נגד עזים IgGוקטור LaboatoriesBA-9500
עז ביוטינילציה אנטי ארנב IgGוקטור LaboatoriesBA-1000
ארנב אנטי-GFP (מזהה GTT)InvitrogenA11122
ארנב אנטי-GnRHזיקה ביו ריאגנטPA1-121
Dylight488-חמור אנטי-ארנב IgGThermo ScientificSA5-10038
SA-Alexa Fluor 546Life TechnologiesS-11225
פריימרים
BL Fwd (לגנוטיפ BIZ)Eurofins MWG OperonATGAAGATGAGCACCAGGGC
BL Rev (לגנוטיפ BIZ)Eurofins MWG OperonAGCCCTCGCCGCAGAACTC
Cre Fwd (לגנוטיפ Cre)Eurofins MWG OperonGTCGATGCAACGAGTGATGAGGTTCG
Cre Rev (for Cre genotyping)Eurofins MWG OperonCCAGGCTAAGTGCCTTCTCTACACCTGC
TTC Fwd (עבור גנוטיפ GTT)Eurofins MWG OperonAGCAAGGGCGAGGAGCTGTT
TTC Rev (עבור גנוטיפ GTT)Eurofins MWG OperonGTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAA
XY Fwd (עבור גנוטיפ מגדרי)Eurofins MWG OperonTGAAGCTTTTGGCTTTGA
XY Rev (for gender genotyping)Eurofins MWG OperonCCGCTGCCAAATTCTTTG
ROSA26 FwdEurofins MWG OperonCGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC
ROSA26 RevEurofins MWG OperonGCAGATGGAGCGGGAGAAAT
SA RevEurofins MWG OperonCGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC
Axio VisionAxio Vision

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals. Brain. Res. Bull. 51, 11-28 (2000).
  2. Huang, Z. J., Zeng, H. Genetic approaches to neural circuits in the mouse. Annu. Rev. Neurosci. 36, 183-215 (2013).
  3. Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. A half century of experimental neuroanatomical tracing. J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).
  4. DeFalco, J., et al. Virus-assisted mapping of neural inputs to a feeding center in the hypothalamus. Science. 291, 2608-2613 (2001).
  5. Kumar, D., et al. Murine arcuate nucleus kisspeptin neurons communicate with GnRH neurons in utero. J. Neurosci. 34, 3756-3766 (2014).
  6. Horowitz, L. F., Montmayeur, J. P., Echelard, Y., Buck, L. B. A genetic approach to trace neural circuits. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 3194-3199 (1999).
  7. Maskos, U., Kissa, K., ST Cloment, C., Brulet, P. Retrograde trans-synaptic transfer of green fluorescent protein allows the genetic mapping of neuronal circuits in transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 10120-10125 (2002).
  8. De Roux, N., et al. Hypogonadotropic hypogonadism due to loss of function of the KiSS1-derived peptide receptor GPR54. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 10972-10976 (2003).
  9. Seminara, S. B., et al. The GPR54 gene as a regulator of puberty. N. Engl. J. Med. 349, 1614-1627 (2003).
  10. Mayer, C., et al. Timing and completion of puberty in female mice depend on estrogen receptor alpha-signaling in kisspeptin neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 22693-22698 (2010).
  11. Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat. Genet. 21, 70-71 (1999).
  12. Seibler, J., et al. Single copy shRNA configuration for ubiquitous gene knockdown in mice. Nucleic Acids Res. 33, e67(2005).
  13. Semaan, S. J., Kauffman, A. S. Emerging concepts on the epigenetic and transcriptional regulation of the Kiss1 gene. Int. J. Dev. Neurosci. 31, 452-462 (2013).
  14. Feil, R., et al. Ligand-activated site-specific recombination in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 10887-10890 (1996).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

CreROSA26C Tetanus Toxin

מאמרים קשורים