מאמר שיטה

ומניפולציה

24.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/52496

⸱

9 בפברואר 2015

 ,  , 
1Wellcome Trust/Cancer Research UK Gurdon Institute, University of Cambridge, 2Department of Zoology, University of Cambridge

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים שיטות למניפולציה של ביציות לא בשלות Xenopus laevis, הבשלת ביציות במבחנה לביציות והזרקת זרע תוך ציטופלזמית. פרוטוקול זה מאפשר פירוק של כמה חלבונים אימהיים וביטוי יתר של גנים מעניינים בעת ההפריה, ולכן הוא בעל ערך לחקר תפקידים של גורמים ספציפיים בהתפתחות עוברית מוקדמת.

תקציר

ביצי דו-חיים היו בשימוש נרחב לחקר התפתחות עוברית. התפתחות עוברית מוקדמת מונעת על ידי גורמים המאוחסנים על ידי האם שהצטברו במהלך הביציות. על מנת לחקור את תפקידם של גורמים אימהיים כאלה בהתפתחות עוברית מוקדמת, רצוי לתמרן את תפקודיהם כבר מתחילת ההתפתחות העוברית. דרכים קונבנציונליות להתערבות גנים מושגות על ידי הזרקת אוליגונוקלאוטידים אנטי-סנס (אוליגוס) או mRNA לביציות מופרות, מה שמאפשר ביטוי חסר או יתר של חלבונים ספציפיים, בהתאמה. עם זאת, שיטות אלה בדרך כלל דורשות יותר ממספר שעות עד שביטוי החלבון מושפע, ולכן ההתערבות בתפקודי הגנים אינה יעילה בשלבים העובריים המוקדמים. כאן, אנו מציגים מערכת ניסויית שבה ניתן לשנות את רמות הביטוי של חלבונים אימהיים לפני ההפריה. ביציות Xenopus laevis המתקבלות מהשחלות מנוקות על ידי דגירה עם אנזימים. אוליגוס אנטיסנס או mRNA מוזרקים לביציות מפוזרות בשלב שלפוחית הנבט (GV). ביציות אלו מבשילות במבחנה לביציות בשלב המטאפאזה II (MII), ולאחר מכן הזרקת זרע תוך ציטופלזמית (ICSI). בדרך זו, עד 10% מעוברי ICSI יכולים להגיע לשלב הראשן השחייה, ובכך לאפשר בדיקות פונקציונליות של הפלת גנים ספציפיים או ביטוי יתר. גישה זו יכולה להיות דרך שימושית לחקור את התפקידים של גורמים המאוחסנים על ידי האם בהתפתחות עוברית מוקדמת.

מבוא

laevis Xenopus הוא בשימוש נרחב אורגניזם מודל רב עוצמה, ללמוד פיתוח 1. סיבה לכך הוא ביצי Xenopus הן גדול במיוחד (כ 1.2-1.4 מ"מ, בהשוואה לעמיתיהם יונקים להיות על 0.1 מ"מ) ושפע. ביצים מכילות רכיבים אימהיים מסונתזים ומאוחסנים, שהם מספיק כדי לנהוג התפתחות עוברית עד מעבר אמצע blastula (MBT, המתרחשות בשלב 8-8.5 עם 4,000-8,000 תאים). MBT מלווה בהפעלת הגנום zygotic, אשר לאחר מכן מייצרת מוצרי גן עובריים המכוונים את התפתחות נוספת.

מחקרים רבים שמטרה לזהות גורמים אימהיים חשובים להתפתחות. מחקרים רבים מסתמכים על הזריקה של oligonucleotides antisense (oligos) כולל oligonucleotides morpholino לעוברי מופרים, ובמקרה זה פירוק של חלבונים אימהיים ניתן לצפות בשלב gastrula 2-4. לחלופין, mRNAs מוזרק להם מופריםbryos להפריע פונקציות גן או לאתר את גורלם של חלבוני ביטוי יתר. עם זאת, ההזרקה לעוברי שלב אחד תא בדרך כלל אינה משפיעה על רמות ביטוי של חלבונים אימהיים בשלבים עובריים בשלב מוקדם מאוד לפני MBT.

Heasman ויילי הקימו את שיטת העברת מארח ללהתגבר על בעיה זו 5. בשיטה שלהם, ביציות defolliculated ידנית מוזרקות עם oligos antisense והועברו לנקבות מארח 6. חלבונים downregulated לפני הפריה כך שניתן לבחון תפקידים של חלבוני downregulated בהתפתחות עוברית מוקדמת. שיטת האזילה אימהית זה הובילה לזיהוי של מספר תפקידים התפתחותיים ייחודיים של חלבונים אימהיים, כפי שנסקרה ב- 7.

בדוח זה, הפרט השיטה שפותחה לאחרונה, שבה דלדול אימהי או ביטוי יתר של mRNA לפני ההפריה מושגת ללא defolliculation ידני והעברת מארח8. Defolliculation הידני דורש הרבה זמן והעברת מארח לעתים קרובות צריכה טכניקות מיומנים והרישיון הספציפי לניתוח בעלי חיים, ובכך פוגעים שימוש תכוף בשיטת האזילה האימהית. Defolliculation והעברת מארח יוחלפו על ידי defolliculation האנזימטית 9,10 והזרקת זרע intracytoplasmic (ICSI) 11-13, בהתאמה. ICSI לביצים שימש במקור כדי לייצר צפרדעים מהונדסים 12. גרעיני זרע ועובריים גם הושתלו במבחנה ביציות דו-חיים התבגרו 11,14,15. כאן, אנו מציגים שיטת צעד-אחר-צעד שלנו להזריק זרע לביציות במבחנה התבגרו שהיו לפני שהוזרק עם oligos antisense או mRNA.

פרוטוקול

הערה: כל הניסויים עם צפרדעים בוצעו בעקבות דרישות של משרד הפנים הבריטי.

1. הכנת Xenopus laevis ביציות

  1. כשבוע לפני אוסף הביצית, להזריק צפרדעי נקבה עם 150 U של הסוסה הרה הסרום Gonadotropin (PMSG) לטרום תחול באמצעות מזרק 1 מיליליטר סטרילי עם מחט 27 G. הזרקה נעשית מתחת לעור לתוך שק הלימפה הגבי.
    הערה: זה אופטימלי לשימוש צפרדעים שלא להטיל את הביצים במשך זמן רב (לפחות יותר ממחצית שנה) או שמעולם לא הטילה ביצים לפני.
  2. חנות מראש דרוכה צפרדעים במכל מים נקבעו על 18 מעלות צלזיוס בחדר אור מבוקר (07:00-19:00: ב, 19:00-07:00: כבוי).
  3. ביום אוסף ביצית, להכין 1 ליטר של 1x הפתרון (MBS) השתנה של בארת 'ממניות 10x MBS על ידי דילול במים מזוקקים פעמיים (DDH 2 O), ולהוסיף פניצילין וסטרפטומיצין בריכוז הסופי של 10 מיקרוגרם / מיליליטרכל אחת (MBS + PS). מניית 10x MBS מורכבת של 880 מ"מ NaCl, 10 מ"מ KCl, 24 מ"מ NaHCO 3, 8.2 מ"מ MgSO 4 .7H 2 O, 3.3 מ"מ Ca (NO 3) 2 .4H 2 O, 4.1 מ"מ CaCl 2 .6H 2 O, 100 HEPES מ"מ, pH 7.5.
  4. הרדימי צפרדע-דרוך מראש על ידי הזרקה תת עורית של 120 מ"ג (400 μl) של methanesulfonate Tricaine (MS222). שמור את הצפרדע שהוחדר במכל קטן עם מים.
  5. לאחר 10 דקות, לבדוק את הצפרדע בהרדמה ידי הפיכתו מאז הצלחת צפרדעים הרדים לא מגיבות לזה. אם ההרדמה היא לא שלמה, להוסיף קרח לתוך הטנק ולחכות עוד 10 דקות.
  6. להרים את הצפרדע מהמכל הקטן והמקום שכיבה על גב לח לנגב.
  7. בעזרת מלקחיים ומספרי כירורגיות קטנים, לצבוט את העור ולעשות חתך קטן (2 סנטימטר) בחלק התחתון של הבטן, לרוחב קו האמצע. לעשות חתך אחר בצד השני.
  8. לאחר חיתוך העור, להסיר את שכבת שריר wiמלקחיים ה ולעשות חתך בשכבת השריר.
  9. שים לב לשחלה אחרי שכבת השריר היא לחתוך ולהוציא את השחלה מהחתכים באמצעות מלקחיים.
  10. העברת חילוץ השחלה לצינור 50 מיליליטר עם פתרון MBS.
    הערה: נסה לאסוף כמה שיותר השחלה ככל האפשר משני החתכים.
  11. לשחוט נקבת הצפרדע על ידי exsanguination, ואחרי הקפאה לרשות מתאימה שלאחר מכן.
  12. יש לשטוף את השחלה שחולצה כמה פעמים עם MBS + PS עד הדם נשטף. לאחר מכן, להעביר את השחלה ל9 סנטימטר צלחת פטרי המכילה MBS + PS
    הערה: בדוק את איכות הביציות תחת מיקרוסקופ לנתח בשלב זה. אם ביציות הן באיכות גרועה, ככל הנראה, כגון ביציות עם פיגמנטציה לא אחידה במחצית בעלי החיים (איור 1 א), לא לעבד יותר ובמקום לקבל השחלה חדשה. באופן אידיאלי, צריכה להיות ביציות ההמיספרות בעלי החיים פיגמנט באותה מידה ותהיה שווה בגודלן כ.
  13. להקניט את השחלה לחתיכות קטנות(1-2 סנטימטר 2) ולאסוף 5 מיליליטר של ביציות בשפופרת 50 מיליליטר חדש.
  14. יש לשטוף 5 מיליליטר של השחלה הקרועה כמה פעמים עם MBS + PS ולהוסיף MBS + PS עד 15 מיליליטר.
  15. להוסיף 7 יחידות של האנזים לdefolliculation להשעית השחלה (ראה חומרי רשימה).
    הערה: מחדש אנזים lyophilized עם 10 מיליליטר של DDH 2 O (28 יחידות / מיליליטר). מניחים את הצנצנת למשך 30 דקות על קרח עם מתערבל עדינים מדי פעם. Aliquot μl 250 ולאחסן ב -80 ° C עד שימוש.
  16. דגירה פיסת השחלה עם האנזים עבור שעה 1 עם רעד עדין על שייקר (מהירות ב 15 REV / min, שווה ערך לכ 0.014 XG).
    הערה: להסרת תאי זקיק, 2 שעות לשעה 2 15 דקות עם דגירה האנזים נחוץ בדרך כלל כמעט מוחלטת. דגירה ארוכה יותר נחוצה לניסוי העברת גרעין ביצית 16.
  17. לאחר הדגירה 1 שעה, להרים את מספר קטן של ביציות שטופלו (10-20 ביציות) והעברה לצלחת פטרי 6 סנטימטר המכיל MBS + PS בדוק את exteNT של defolliculation תחת מיקרוסקופ לנתח. אם ביציות מופרדות זה מזה ולפחות באופן חלקי defolliculated (איור 1), מייד להמשיך את התגובה הבאה העצירה (שלב 18). אם ביציות עדיין מוקפות בכבדות על ידי תאי זקיק, דגירה של 15 דקות נוספות במקסימום.
  18. להוסיף שפע של MBS + PS כדי לעצור את התגובה וזורקים supernatant. חזור על הכביסה במשך 10 פעמים.
    הערה: הוסף MBS + PS ידי שפיכה לקיר של צינור 50 מיליליטר, אבל לא באופן ישיר לביציות. לאחר ההשעיה בMBS + PS, ביציות לא בשלות קטנות נוטות לצוף בחלק העליון של כביסה חיץ וזורקי ביציות צף קטנות כזה.
  19. לאחר שטיפה, להעביר ל9 סנטימטר צלחת פטרי המכילה MBS + PS
    הערה: בשלב זה מואילך, לשמור על ביציות ב16-18 מעלות צלזיוס עד כמה שניתן. ניתן לעשות זאת על ידי שמירה על המנה המכילה ביציות בשלב טמפרטורה מבוקרת.
  20. בחר ביציות VI שלב על פי הסיווג של דומוןלשימושים הבאים ולהעביר לצלחת 9 סנטימטר חדש פטרי המכילה MBS + העברת ביצית PS יכול להיעשות על ידי שימוש בפיפטה זכוכית עם גודל מתאים קצה (גדול יותר מגודל הביצית).
    הערה: ביציות באיכות טובות צריכה אונה בעלי חיים באופן שווה עם פיגמנט ניגוד ברור בין האונה בעלי החיים וחצי הכדור הצמחי, ולהיות שווה בגודלן כ (איור 1 ג). ביציות VI שלב מייצגות גדלו באופן מלא ביציות שיכולים להגיב לפרוגסטרון (קוטר ביצית הוא כ 1.2-1.4 מ"מ).

2. הזרקה של Oligonucleotides antisense או mRNA לביציות

הערה: יש לעשות כל השלבים בסעיף זה ב16-18 מעלות צלזיוס על הבמה מיקרוסקופ מצויד במים במחזור בטמפרטורה מבוקרת או בקופסא פלסטיק מלא בקרח.

  1. העבר 200-300 ביציות שנבחרו לתוך צלחת חדשה 9 סנטימטר פטרי מלא MBS + PS, שבי microinjection יבוצע.
    הערה: בEACמצב h, 200-300 ביציות משמשות בדרך כלל. בסך הכל, כ -1,000 ביציות המשמשות בניסוי אחד.
  2. להכנת זריקה של oligos antisense או mRNA, להוציא את בוכנת המתכת של microinjector.
  3. מלא נימי זכוכית עם שמן מינרלים באמצעות מזרק והכנס את נימי זכוכית מלאות בשמן לבוכנת המתכת של microinjector.
    הערה: זכוכית נימים נמשכת על ידי חולץ micropipette. מחטים אלה מוחזקות בתיבה מבלי לפגוע טיפים.
  4. חותך את קצה המחט באמצעות מספריים כירורגיות קטנים מתחת למיקרוסקופ על ידי מכוון כקצה בקוטר קטן להזרקה ככל האפשר.
    הערה: קצה המחט ניתן חידד באמצעות beveler לזייף או micropipette מיקרו. לפוע המחט בזווית של 25 מעלות משפר את היכולת לחדור קיר הביצית.
  5. במקום רצועה קטנה של Parafilm על הבמה של מיקרוסקופ לנתח ולוותר ירידה של 3 μl של אוליגו antisense או פתרון mRNA.
  6. הזז את tip של מחט הזריקה לתוך אגל הקטן של פתרון ולמלא את המחט עם הפתרון להיות מוזרק.
    הערה: אם קצה מחט הזריקה הוא קטן מדי, בועות האוויר אמורות להופיע בקצה בוכנת המתכת. ואז, להפוך את קצה גדול יותר על מחט הזריקה עד שזה לא יקרה.
  7. סמן את מחט הזריקה כ -0.5 מ"מ מהקצה. סימן זה משמש כמדד לעומק הזרקה.
  8. הכנס את קצה המחט לתוך ביצית לאורך הגבול המשווני על ידי מכוון לנקודה של ביצית המרכז (מתחת לשלפוחית ​​הנבטיה) כשהוא אוחז בעדינות בצד השני של הביצית לנקודת ההזרקה עם מלקחיים למניעת תנועת ביצית בלתי רצויה במהלך הזרקה .
    הערה: מצא את השטח החופשי של תאי זקיק (איור 1) ולהכניס את המחט מנקודה שכן אפילו מחט דקה לא יכולה לעתים קרובות לחדור שכבה של תאי זקיק.
  9. הוצא 4.6 ng / 4.6 NL או 9.2 ng / 9.2 nl של חומרים אנטיoligos ense, או נפח מתאים של mRNA (250 pg 13.8 ng) על ידי שימוש במתג הרגל. פרטים של הכנת אוליגו antisense מתוארים ב -7.
  10. מעביר את הביציות מוזרקות לתוך צלחת 6 סנטימטר פטרי מלא MBS + PS בתוספת 0.1% BSA (בינוני דגירה ביצית; לעקר את הפתרון באמצעות מסנן 0.45 מיקרומטר נקבובית).
  11. דגירה הביציות בגיל 16 מעלות צלזיוס או 18 מעלות צלזיוס במשך 1-2 ימים.
    יכולות להיות נתונה ביציות מוזרקת לכמה שעות במבחנה התבגרות לאחר הזרקה, ובמקרה של הזרקת oligos antisense 4.6 ng עדיפה: הערה. הכלל הוא כי קצר תקופת הדגירה היא, טוב יותר את ההתפתחות העוברית שלאחר מכן.

3. במבחנת ההתבגרות (IVM) של ביציות

  1. בערבו של ניסוי הבשלת הביצית, להביא פתרון מניות פרוגסטרון (30 מ"מ באתנול) ממקפיא -80 מעלות צלזיוס ולפזר משקעים בTEM החדרperature עם מדי פעם מערבולת.
    הערה: מניית פרוגסטרון היא בדרך כלל השאירה בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות לשעה 1.
  2. הוסף 5 μl של מניית פרוגסטרון ב 50 מיליליטר של MBS + PS (בינוני התבגרות; הריכוז הסופי של פרוגסטרון ב3 מיקרומטר) ולנער שבייקר למשך 30 דקות כדי להפיץ פרוגסטרון בפתרון באופן שווה.
  3. להכין מנות 6 סנטימטר מצופה agarose בטיפול התבגרות מבחנה.
    1. להוסיף 1 גרם של agarose 50 מיליליטר של MBS 1x ללא מגנזיום וסידן.
    2. לפזר agarose על ידי חימום במיקרוגל.
    3. יוצקים נפח קטן של פתרון agarose עד 6 מנות סנטימטר כדי לכסות את התחתית של מנות.
    4. חכה לפחות למשך 30 דקות עד התמצקות.
    הערה: הציפוי מונע הידבקות Agarose של ביציות למאכלים. ברגע שביציות מבחנה התבגרה הם מחוברים בחוזקה לכלים, סביר להניח שרוב הביציות תופעל על ידי הגירויים שהם מקבלים במהלך הניתוק מדיסהס.
  4. יוצקים 5-8 מיליליטר של מדיום ההתבגרות לagarose מצופים מנות ולהעביר 200-300 ביציות לכל 6 מנות סנטימטר.
    הערה: נסה להעביר ביציות עם כמות מינימאלית של מדיום דגירה ביצית.
  5. דגירה של 16 שעות על 16 מעלות צלזיוס.
    הערה: לדוגמא, להתחיל את הטיפול בשעה 5 בערב, ולסיים בשעה 9 בבוקר ביום שלמחרת.

4. הזרקת Intracytoplasmic זרע (ICSI)

  1. הכנת מניית זרע קפוא
    הערה: הכנת הזרע הבאה צריך להיעשות לפני תחילת ניסוי הבשלת הביצית, ומניות זרע קפוא נשמרות ב -80 ° C לICSI.
    1. לאסוף את האשכים מצפרדע זכר על ידי ביצוע שלבים 1.4-1.11, פרט למשייכת שומן ואשכים החוצה מהחתכים באמצעות מלקחיים והסרת אשכים מהשומן.
    2. לשטוף אשכים ב1x אצבעותיו של מארק שונה (MMR, 100 מ"מ NaCl, KCl 2 מ"מ, 1 מ"מ MgSO 4, 2 מ"מ CaCl 2, 5 מ"מ HEPES, pH 7.4).
    3. הסר שומןכלי דם ד על ידי גלגול האשכים שטף על ממחטת נייר נקי ולאחר מכן על ידי הסרת כלי דם שנותרו באמצעות מלקחיים.
    4. מניחים כל אשך בצלחת פטרי המכילה 3.5 סנטימטר 1 מיליליטר של 1x MMR.
    5. לחתוך longitudinally עם מספריים עדינים, ולקרוע לחתיכות קטנות עם מלקחיים עד שלא יישארו חתיכות גדולות.
    6. פיפטה למעלה ולמטה באמצעות טיפ 1 מיליליטר פלסטיק שסופו הוא לחתוך, ועומס 1 מיליליטר של פתרון האשך נמחץ לתוך homogenizer זכוכית.
    7. Homogenize על ידי 2-3 משיכות ואז לשפוך את הפתרון על מסנן נקבובית 50 מיקרומטר המצורף לחלק העליון של צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר. אפשר הפתרון לעבור את הסינון.
    8. חזור על שלב 4.1.7 על ידי resuspending אשך החתך שנותר ב 1 מיליליטר של 1x MMR. לבסוף, לשטוף homogenizer כמה פעמים עם MMR 1x ולהעביר אותו דרך המסנן.
    9. חזור על השלבים 4.1.5 ל4.1.8 לאשך ובריכת שני אשכים האחרים לתוך צינור צנטריפוגות אחד 15 מיליליטר.
    10. ספין התאים ב 800 XG ב 46; צלזיוס למשך 20 דקות.
    11. בטל supernatant ו resuspend תאי pelleted ב 2 מיליליטר של 1x MMR. לאחר מכן, להעביר לתוך צינור חדש.
      הערה: יש לוודא שאין תאי דם גלויים נוכחים.
    12. הכן שיפוע צעד בצינור צנטריפוגות אולטרה-ברור 14 מיליליטר. שכבה תחתונה: 4 מיליליטר של iodixanol 30%. שכבה שנייה תחתונה: 1 מיליליטר של iodixanol 20%. שכבה שלישית תחתונה: 5 מיליליטר של iodixanol 12%. שכבה עליונה: אשך תאים 2 מיליליטר של 1x MMR. כיסוי הדרגתיים מאוד בעדינות עם קצה פיפטה מיליליטר 1 (כיסוי לאט שלא להפריע את השלב התחתון).
      הערה: רק שכבה אחת של iodixanol 30% צריכה גם לעבוד לבידוד זרע בלבד.
    13. ספין בהרוטור SW40 באמצעות ultracentrifuge על 10,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות (האטה ללא הפסקה).
    14. הוצא בעדינות את הצינור מultracentrifuge. לאשר ממשק בין כל שכבה של הצבע והגלול בתחתית.
    15. לאסוף את שבר הזרע מהגלולה.
    16. Resuspend pel הזרעבואו ב1x MMR לשטיפת iodixanol. ספין ב 800 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
      הערה: אם הרבה זרע עדיין יישאר בהשעיה לאחר הספין, מחדש ספין supernatant ב3,220 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות וברכת זרע pelleted.
    17. בטל supernatant ו resuspend גלולה הזרע ב 1 מיליליטר של 1x הגרעיני הכנת מאגר (NPB; 250 מ"מ סוכרוז, 0.5 מ"מ trihydrochloride Spermidine, 0.2 מ"מ tetrahydrochloride Spermine, 1 mM EDTA, 15 מ"מ HEPES, pH 7.7) 13. לאחר מכן, להעביר לצינור Eppendorf.
    18. הוסף 50 μl של 10 מ"ג / מיליליטר פתרון digitonin ב1x NPB (אבקת Resuspend digitonin בDMSO ב 50 מ"ג / מ"ל ​​ולהקפיא aliquots ב -80 מעלות צלזיוס. שימוש לפני, לדלל 50 מ"ג / מיליליטר aliquot עד 10 מ"ג / מיליליטר עם 1x NPB. שאינה בשימוש יכול להיות קפוא 10 מ"ג / מיליליטר digitonin ומאוחסן ב -20 ° C ושימוש חוזר) עד 1 מיליליטר של פתרון הזרע.
    19. דגירה של 5 דקות בטמפרטורת חדר.
    20. בדוק שיעור permeabilization ידי מכתים DAPI (0.3 מיקרוגרם / מיליליטר DAPI כFINAריכוז l). אם פחות מ -95% מתאים permeabilized, דגירה קצת יותר זמן.
      הערה: לפעמים אם תאי זרע רבים מדי מודגרת באותו הזמן (במיוחד כאשר הזרע נאספים מאשכים מרובים), קשה permeabilize, ובמקרה זה ייתכן שיהיה צורך להוסיף כמות קטנה נוספת של digitonin; לדוגמא, אם 20% מזרע אינם permeabilized, 20 μl נוסף של digitonin הוא הוסיף.
    21. להפסיק permeabilization ידי הוספת BSA 10% ל -3% ריכוז סופי.
    22. ספין התאים ב 4 מעלות צלזיוס.
      הערה: נסה מהירות צנטריפוגה מעט ככל האפשר על ידי מתחיל עם 5 דקות 100 XG. אם לא די ב, להגדיל את המהירות ו / או זמן.
    23. לשטוף את התאים עם BSA 0.3% ב 1x NPB ו צנטריפוגות באותה המהירות כמו צעד 4.1.22. בינתיים, מכין את זרע חפצים הצפת (SSB; 2 מיליליטר של 2x NPB, 120 μl של BSA 10%, 1.2 מיליליטר autoclaved גליצרול, 680 μl של H 2 O).
    24. הוסף 500 μl של SSB לזרעגלולה. כמה פעמים פיפטה מעלה ומטה כדי resuspend עם קצה לחתוך כדי לא לגרום נזק לתאים.
    25. לאפשר לאזן לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
    26. פיפטה את התאים למעלה ולמטה כמה פעמים עם קצה לחתוך.
    27. לדלל כמה מיקרוליטר 10 פעמים ב 1x MMR או ב1x PBS לספור את התאים באמצעות hemocytometer.
    28. להקפיא aliquots ב -30,000 הזרע / μl (או יותר) באופן ישיר ב -80 ° C ולאחסן ב -80 ° C בaliquots שימוש יחיד.
  2. ICSI לביציות במבחנה התבגר
    הערה: יש לעשות כל התהליכים הכרוכים בביציות ב16-18 C °.
    1. הכן פיפטה זכוכית להעברת ביציות הבשילו.
      הערה: טפטפת הזכוכית צריך להיות רחב מספיק כדי להכיל את הביציות ללא סחיטה.
    2. שישה-עשר שעות לאחר שעברו ביציות למדיום המכיל פרוגסטרון, העברה הבשילה ביציות לתוך צלחת מצופה agarose 6 סנטימטר המלא בMBS + PS לשטיפה.
      הערה: חשוב לציין, מ 'ביציות atured צריכים להיות מטופלים מאוד בזהירות. עבירה הגסה של ביציות עשויה לגרום להפעלה ספונטנית לפני הזרקת זרע.
    3. ספירת ביציות הבשילו על ידי המאשר את הופעת כתמים לבנים, מה שמרמז על ההתמוטטות הנבטיה שלפוחית ​​(איור 2). אם קצב ההבשלה הוא פחות מ -80%, אין זה סביר כדי לקבל את המספר מספיק לשרוד עובר לניתוח נוסף.
      הערה: תאי זקיק שנותרו הם התקלפו לאחר הבשלת ביצית (איור 2).
    4. העברת ביציות מכביסת MBS לצלחת 6 סנטימטר חדש מצופה agarose המלא בינוני הזרקה (הכינו 500 מיליליטר: 30 גרם של Ficoll (6%), 20 מיליליטר של 10x MMR ו -500 μl של מניית 1,000x PS).
    5. דגירה לפחות למשך 30 דקות לפני תחילת ICSI.
    6. הגדר את microinjector כמתואר בשלבים 2.2-2.4.
      הערה: גודל קצה מחט ההזרקה נשמרת קטנה ככל האפשר על-ידי ביצוע ההליך המתואר בשלב 2.6. הקוטרשל המחט הוא 20-40 מיקרומטר. לפוע קצה המחט כמתואר בשלב 2.4 עשויים לאפשר הזרקה יעילה.
    7. להביא את aliquot הזרע ולדלל את ההשעיה זרע זרע דילול המאגר (SDB; 250 מ"מ סוכרוז, 75 מ"מ KCl, 0.5 מ"מ Spermidine, 0.2 מ"מ Spermine, 200 מיקרומטר HEPES pH 7.5).
      הערה: דילול יכול להיות מגוונת בהתאם גודל מחט וכן הלאה. לדלל 120 פעמים של 30,000 זרע / μl המניה כניסיון ראשוני ולהתאים נוסף במידת הצורך.
    8. במקום רצועה קטנה של Parafilm על הבמה של מיקרוסקופ לנתח. מערבבים פתרון הזרקת זרע על ידי pipetting ולוותר כמה ירידת μl של פתרון הזרע.
    9. למצוץ ההשעיה הזרע המדולל לתוך המחט, להזריק 4.6 nl לתוך 10 טיפות רצופות המכילות 0.3 מיקרוגרם / מיליליטר DAPI בשקופית מיקרוסקופ, ולספור את מספר תאי הזרע מועברים להזרקה במיקרוסקופ פלואורסצנטי במהירות.
      הערה: מטרת 1-2 זרע לכל זריקה. במידת צורך, לדלל את פתרון הזרקת הזרע יותרולבדוק את מספר תאי הזרע לכל זריקה שוב עד להשגת ריכוז רצוי.
    10. הוצא את פתרון הזרקת מבחן ולמלא פתרון הזרקת הזרע חדש עם ריכוז נכון.
    11. הזרק 4.6 nl של פתרון זרע 100 ביציות הבשילו.
      הערה: חשוב להזריק את הפתרון ברציפות. ראשית לקבוע את הזמן הנדרש וללהוציא 4.6 NL (בדרך כלל 1-2 שניות). חזור על התהליך הבא; להזריק בביצית, לחכות כמה שניות, להסיר מחט ודגמי הזרקה בפתרון הזרקה, לחכות כמה שניות, להזריק בביצית. הזרקה רציפה זו גם מונעת חסימה של קצה המחט. לחלופין, השיטה באמצעות משאבה עשויה לשמש 13.
    12. לאחר כ 100 זריקות, להוציא את פתרון הזרע שנותר ולמלא מחדש את פתרון הזרע (להשתמש באותו פתרון הזרע, אבל פיפטה למעלה ולמטה לפני הניפוק).
      הערה: אם המחט לא למצוץ פתרון זרע היטב, לחתוך את הקצה של הצורךle. אם זה לא ישפר את המצב, להכין מחט חדשה.
    13. חזור על תהליך ההזרקה עד שכל הביציות מוזרקות.
      הערה: אם איכות הביצית היא טובה והזריקה היא מוצלחת, התכווצות של ביציות הזריקו נתפסה בתוך 20 דקות של זמן ההזרקה.
    14. הזז את המנות שהוחדרו עד 16 מעלות צלזיוס או 18   ° C חממה.
    15. 4-5 שעות לאחר ההזרקה, לבדוק את שיעור המחשוף של עוברי ICSI.
      הערה: תלמי מחשוף של עוברים אלה לא יכולים להיות ברורים כמו אלה של עוברים מופרים נורמלים. עוברי חלק גם מראים שסעים חריגים, שעלול להיגרם על ידי הזרקת זרע מרובה.
    16. עוברי העברה ביקע כוללים עוברים בקעו באופן חריג עד בינוני דגירה (הכן 500 מיליליטר: 20 גרם של Ficoll (4%), 5 מיליליטר של 10x MMR ו -500 μl של מניית 1,000x PS).
    17. דגירה עובר גם ב -16   ° C או C חממת 18 ° לילה.
    18. למחרת בבוקר, אמברי העברהמערכת הפעלה לMMR 0.1x ולספור שרדה עוברים.
    19. בממוצע, כ -10% מביציות מוזרקי זרע יכולים לפתח לשלב ראשן שחייה (איור 3 א).

תוצאות

התפתחות עוברית של עוברי ICSI באמצעות ביציות מבחנה התבגרה נבדקה (איור 3 א). שיעורי הבשלה של ביציות GV לבמה MII משתנים ובמידה רבה תלויים באיכות הביצית. בניסויים טובים, כמעט 100% מביציות GV להגיב לסימני פרוגסטרון ותכנית של הבשלת ביצית, סוף סוף הופכים לביצים בשלב MII. כל הביציות התבגרו היו נתונים לICSI וכ -25% מביצים שהוחדרו ביקעו (איור 3 א, n = 13 לשליטה מקושקשות ביציות מוזרקות אוליגו וn = 7 ללא ביציות מוזרקות אוליגו). כ -60% או 80% מעוברים ביקעו, המופקים מביציות מוזרקות אוליגו שליטה או ביצית-הזריק עישון, בהתאמה, הגיעו לשלב blastula / gastrula. בין עוברי blastula / gastrula, כמחצית מעוברים בדגימות מוזרקת אוליגו היתה באיכות טובה (כמעט ללא סימני מחשוף נורמלי ואפופטוזיס) ואילו 82% מעוברי blastula / gastrula היו באיכות טובה בnדגימות מוזרקות על-(איור 3 א). לבסוף, 41% ו -11% מעוברים ביקעו בדגימות מוזרקות אוליגו הגיעו תגובת השרירים ושלבי ראשן שחייה, בהתאמה, ואילו 60% ו -29% מעוברים ביקעו בדגימות מוזרקות אינם עשו (איור 3 א). עוברי ICSI אלה הם התערובת של עוברים נורמלים ולא נורמלים (איור 3). חלקם עוברים מטמורפוזה ולפתח להתבגר צפרדעי 8. תוצאות אלו מצביעות על כך שהזרקה של oligonucleotides antisense לתוך ביציות GV, ואחריו IVM וICSI, מאפשרת התפתחות עוברית מוקדמת יעילה. למרות שההזרקה של oligos antisense עצמו מקטינה התפתחות עוברית, אנחנו עדיין הצלחנו להשיג מספיק עוברים למטרות ניסויים רבים כגון בדיקת שיעורים התפתחותית, RT-PCR, כתם מערבי וכן הלאה.

figure-results-1
איור יור 1: דוגמאות אופייניות של Xenopus laevis ביציות באיכות טובה או באיכות גרועה לניסויי התבגרות במבחנה. (א) דוגמא של ביציות באיכות גרועות. לדוגמא, ביציות מראים פיגמנטציה בלתי סדיר אינן משמשות לניסויים הבאים. כל Xenopus laevis ביצית היא כ 1.2-1.4 מ"מ קוטר. (ב) ביצית defolliculated באופן חלקי. המחצית הימנית של הביצית היא מכוסה על ידי תאי זקיק, שניתן להבחין בנוכחותם של כלי דם. חץ מראה על שטח חופשי של תאי זקיק ושלתוכו מחט הזריקה מוזרקת. (ג) דוגמא של ביציות באיכות טובות, שהם שווים בהגודל ולהראות ההמיספרות בבעלי חיים באופן שווה עם פיגמנט ניגוד ברור בין האונה בעלי החיים וחצי הכדור הצמחי.

2,496 / 52496fig2highres.jpg "/>
איור 2:. Xenopus laevis ביציות לפני ואחרי ההתבגרות לאחר הבשלת ביצית, כתמים ברורים לבנים מופיעים בחלק העליון של ההמיספרות בעלי חיים ותאי זקיקם התקלף. כל ביצית laevis Xenopus היא כ 1 מ"מ בקוטר.

figure-results-2
איור 3: פיתוח של עוברי ICSI, המופקים מביציות מבחנה התבגרה. (א) לפיתוח של עוברי ICSI לכל שלב הוא סיכם. ביציות הוזרקו שליטה מקושקשת oligonucleotides antisense (הזרקת אוליגו שליטה) או בלי הזרקה (הזרמה שאינה), ואחריו IVM וICSI. המספר המתאים של עוברים בכל שלב מוצג לעיל הסורג והבריח. ממוצע ± SEM מוצג. N = 4-13 ניסויים עצמאיים / f שונהemales. (ב) דוגמאות לשרוד עוברי ICSI. עובר שלב tailbud אלה יוצרו בניסוי אחד, שבו כ -200 ביציות שמשו כחומר מוצא.

דיון

אנחנו כאן פירוט שיטה חדשה לרוקן גורמים אימהיים או לביטוי יתר גורמים אקסוגניים לפני ההפריה. מערכת זו דורשת שני microinjections, אבל במקום זה מדלג הניתוח של צפרדעים, המשמש ב7,17 שיטת העברת מארח. זה הוא אופטימלי כדי להסיר את שלב ניתוח הצפרדע במונחים של טיפול בבעלי חיים. יתר על כן, אין לנו לקחת בחשבון לאיכות של צפרדעי נקבת מארח לניסויי ההעברה, מה שאומר שאנחנו יכולים להיפטר מגורם ביולוגי אחד שמשפיע על ההצלחה של ניסויים. לכן במערכת זו האיכות של ביציות שהתקבלו מצפרדעים דרוכים-PMSG היא גורם ביולוגי מרכזי שהוא מפתח לניסויים מוצלחים. האיכות של ביציות יכולה להישפט לאחר איסוף defolliculation השחלה או אחרי. אם כל חריגות שנצפו בשלבים האלה, זה אופטימלי כדי לאסוף השחלה אחרת מצפרדע חדשה. נקודה נוספת, כאשר אתה יכול לבדוק את איכות הביצית היא לאחר הבשלת ביצית. אם פחות מ -80% מprogesteronביציות שטופלו דואר להראות סימנים של התבגרות, ייתכן שלא תוכל לקבל מספיק מספר העוברים לניתוח נוסף. השימוש בdefolliculation האנזימטית במקום defolliculation הידני הוא גם יתרון נוסף של שימוש במערכת זו כדי להפחית את העבודה הדרושה לdefolliculation. עם זאת, זה עדיין אפשרי שdefolliculation הידני עשוי לתת פיתוח טוב יותר מאשר הטיפול האנזימטית.

כפי שניתן לראות באיור 3, כמעט 10% במבחנה התבגרו ביציות יכולים להגיע לשלב ראשן שחייה. נתונים אלה נאספו מ -13 ניסויים עצמאיים כוללים אלה שדווחו ב- 8 וחדשים ניסויי הזרקה. שיטת העברת מארח צריך 75-150 ביציות בכל טיפול לקבלת נתונים משמעותיים מאז 30-60% מהביציות הועברו יכולים להגיע לשלב neurula 17. השיטה שלנו בדרך כלל מתחילה עם 200-300 ביציות בכל קבוצת ניסוי מאז כ 40-60% מעוברים ביקעו יכולים להגיעשלב תגובת שרירים. נתונים אלה מראים כי שני השיטות לתמוך בשיעור התפתחותי סביר. עד כה יש לנו להשיג 10 צפרדעים בחיים מביציות מוזרקות אוליגו antisense-הזריק mRNA ובקרת שליטה באמצעות טכניקה זו, מצביעה על כך שגישה זו תומכת בפיתוח באמצעות מטמורפוזה.

שיטת המניפולציה-ICSI הביצית שלנו מספקת הזדמנות לבחון את תפקידם של גורמים אימהיים במהלך התפתחות עוברית בשלב מוקדם מאוד, זמן קצר לאחר ההפריה. בנוסף, ביטוי יתר של גורמי שינוי הכרומטין לפני ההפריה יכול לעשות את זה אפשרי לשפץ הכרומטין האימהי לפני ההפריה להבנת מצבי הכרומטין אימהיים הכרחיות לפיתוח. אסטרטגיה זו יכולה גם לעבוד היטב עם מערכות עריכת הגן הנוכחיות כגון nuclease תמלול כמו activator-מפעיל (Talen) 18,19 וCRISPR / CAS9 20,21 מאז אלה יכולים לבוא לידי ביטוי עוד לפני ההפריה. לכן, לגישה החדשה שלנו potentiאל לשמש ליישומים רבים בעתיד.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

אנו אסירי תודה לחברי מעבדת גורדון על הדיון המועיל. ק.מ. הוא עמית מחקר במכללת וולפסון ונתמך על ידי מלגת הרשל סמית לפוסט-דוקטורט וקרן ססאקאווה הבריטית. מעבדת גורדון נתמכת על ידי מענקים מקרן וולקאם (RG69899) ו-MRC ל-J.B.G.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
גונדוטרופין בסרום סוסות בהריון (PMSG) MSD Animal HealthVm 01708/4309PMSG-Intervet 5000iu אבקה וממס לתמיסה להזרקה
אתיל 3-אמינובנזואט מלח מתאן סולפונאט (MS222)SigmaA5040להרדמה
Liberase TM דרגת מחקרRoche05 401 127 001להסרת ביציות. יש לאחסן ב-20  °ג.
Drummond NanojectDrummond Scientific Company3-000-205/206מיקרו-הזרקה
 מעבדות אלפא7 אינץ' דראמונד #3-000-203-G/XLמיקרו-הזרקה
 מכשיר SUTTERדגם D-97למיקרו-הזרקה
UltraPure AgaroseInvitrogen16500-500להבשלה in vitro
וצינור צנטריפוגה שקוף במיוחד ICSI 14 מ"ל בקמן קולטר בריטניה בע"מ344060לטיהור זרע
OptiPrep צפיפות שיפוע בינוני (יודיקסאנול)SigmaD1556לטיהור זרע
DigitoninSigmaD141מגיב חדירות תאים
שייקרHybaid HB-SHK-1
למיקרוסקופ ניתוח ביציות (מיקרוסקופ זום סטריאו)ZEISSSemi SV6לאיסוף ביציות והזרקת מיקרו
50 μ m מסנן נקבוביותCellTrics04-0042-2317לטיהור זרע
אולטרה צנטריפוגהבקמן קולטראופטימה L-100XPלטיהור זרע
50 מ"ל צינור צנטריפוגהCellstar Greiner Bio-One227261 או 210261איסוף ביציות ותגובת דפוליקולציה
15 מ"ל צינור צנטריפוגהFALCON352097לטיהור זרע
90 מ"מ פטרי מנה Thermo Scientific101VR20/C
צלחת תרבית תאים קלה לאחיזה, 60  x  תאים FALCON353004
לאחיזה קלה, 35  x  351008FALCON
עבור נימי זכוכית לחולץ מיקרופיפטה צלחת תרבית 15 מ"מ 15 מ"מ

מקורות

  1. Miyamoto, K., Gurdon, J. B. Insights into the amphibian egg to understand the mammalian oocyte. Biology and Pathology of the Oocyte: Role in Fertility, Medicine, and Nuclear Reprogramming. Trounson, A., Gosden, R., Eichenlaub-Ritter, U. , Second, Cambridge University Press. 1-11 (2013).
  2. Heasman, J., Kofron, M., Wylie, C. Beta-catenin signaling activity dissected in the early Xenopus embryo: a novel antisense approach. Developmental biology. 222 (1), 124-134 (2000).
  3. Oelgeschlager, M., Kuroda, H., Reversade, B., De Robertis, E. M. Chordin is required for the Spemann organizer transplantation phenomenon in Xenopus embryos. Developmental cell. 4 (2), 219-230 (2003).
  4. Szenker, E., Lacoste, N., Almouzni, G. A developmental requirement for HIRA-dependent H3.3 deposition revealed at gastrulation in Xenopus. Cell reports. 1 (6), 730-740 (2012).
  5. Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C. Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules. Methods in cell biology. 36, 213-230 (1991).
  6. Heasman, J., et al. Overexpression of cadherins and underexpression of beta-catenin inhibit dorsal mesoderm induction in early Xenopus embryos. Cell. 79 (5), 791-803 (1994).
  7. Hulstrand, A. M., Schneider, P. N., Houston, D. W. The use of antisense oligonucleotides in Xenopus oocytes. Methods. 51 (1), 75-81 (2010).
  8. Miyamoto, K., et al. Nuclear Wave1 is required for reprogramming transcription in oocytes and for normal development. Science. 341 (6149), 1002-1005 (2013).
  9. Halley-Stott, R. P., et al. Mammalian nuclear transplantation to Germinal Vesicle stage Xenopus oocytes - a method for quantitative transcriptional reprogramming. Methods. 51 (1), 56-65 (2010).
  10. Astrand, C., Belikov, S., Wrange, O. Histone acetylation characterizes chromatin presetting by NF1 and Oct1 and enhances glucocorticoid receptor binding to the MMTV promoter. Experimental cell research. 315 (15), 2604-2615 (2009).
  11. Amaya, E., Kroll, K. L. A method for generating transgenic frog embryos. Methods in molecular biology. 97, 393-414 (1999).
  12. Kroll, K. L., Amaya, E. Transgenic Xenopus embryos from sperm nuclear transplantations reveal FGF signaling requirements during gastrulation. Development. 122 (10), 3173-3183 (1996).
  13. Smith, S. J., Fairclough, L., Latinkic, B. V., Sparrow, D. B., Mohun, T. J. Xenopus laevis transgenesis by sperm nuclear injection. Nature protocols. 1 (5), 2195-2203 (2006).
  14. Drury, K. C., Schorderet-Slatkine, S. Effects of cycloheximide on the 'autocatalytic' nature of the maturation promoting factor (MPF) in oocytes of Xenopus laevis. Cell. 4 (3), 269-274 (1975).
  15. Smith, L. D., Ecker, R. E. Role of the oocyte nucleus in physiological maturation in Rana pipiens. Developmental biology. 19 (3), 281-309 (1969).
  16. Miyamoto, K., Pasque, V., Jullien, J., Gurdon, J. B. Nuclear actin polymerization is required for transcriptional reprogramming of Oct4 by oocytes. Genes & development. 25 (9), 946-958 (2011).
  17. Schneider, P. N., Hulstrand, A. M., Houston, D. W. Fertilization of Xenopus oocytes using the host transfer method. J. Vis. Exp. (45), (2010).
  18. Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis). Biology open. 1 (12), 1273-1276 (2012).
  19. Sakane, Y., et al. Targeted mutagenesis of multiple and paralogous genes in Xenopus laevis using two pairs of transcription activator-like effector nucleases. Development, growth & differentiation. 56 (1), 108-114 (2014).
  20. Nakayama, T., et al. Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).
  21. Guo, X., et al. Efficient RNA/Cas9-mediated genome editing in Xenopus tropicalis. Development. 141 (3), 707-714 (2014).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

IIWestern Blot
ומניפולציה
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.