מאמר שיטה

Transfection, בחירה, ומושבת קטיף של תאי גזע האנושי המושרה pluripotent Talen-ממוקד עם גן GFP לSafe Harbor AAVS1

DOI:

10.3791/52504

⸱

1 בפברואר 2015

 ,  ,  , 
1National Institute of Arthritis, Musculoskeletal and Skin Diseases, National Institutes of Health, 2Q Therapeutics

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עריכת גנים בתיווך TALEN בלוקוס AAVS1 בנמל המבטחים מאפשרת הוספת טרנסגנים ביעילות גבוהה ב-iPSCs אנושיים. פרוטוקול זה מתאר את ההליכים להכנת iPSCs להעברת TALEN וקטור תורם, טרנספקציה של iPSCs ובחירה ובידוד של שיבוטי iPSC כדי להשיג אינטגרציה ממוקדת של גן GFP ליצירת קווי דיווח.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תוספת טרנסגנים ממוקדת יכולה לספק ביטוי גנים מתמשך תוך עקיפת השתקת הגנים ומוטגנזה הנגרמת על ידי אינטגרציה אקראית בתיווך וקטור ויראלי. פרוטוקול זה מתאר פלטפורמת הוספה ממוקדת טרנסגנים אוניברסלית ויעילה ב-iPSCs אנושיים המבוססת על שימוש ב-TALENs מאומתים בקוד פתוח ותורם דמוי מלכודת גנים כדי להעביר טרנסגנים למקום נמל מבטחים. חשוב לציין, עריכת גנים יעילה מוגבלת בקצב על ידי יעילות המסירה של וקטורים לעריכת גנים. לכן, פרוטוקול זה מתמקד תחילה בהכנת iPSCs לטרנספקציה כדי להשיג יעילות שיגור גרעינית גבוהה. כאשר iPSCs מפורקים לתאים בודדים באמצעות ריאגנט דיסוציאציה עדין של תאים ומועברים באמצעות תוכנית אופטימלית, ניתן לגרום ל->50% מהתאים לקלוט את הווקטורים הגדולים לעריכת גנים. מכיוון שלוקוס AAVS1 ממוקם באינטרון של גן פעיל (PPP1R12C), נעשה שימוש בגן עמיד לפורומיצין (PAC) המקושר לשחבור (SA) לבחירת iPSCs ממוקדים תוך אי הכללת תאים אקראיים לאינטגרציה בלבד ולא מועברים. אסטרטגיה זו מגדילה מאוד את הסיכוי להשיג שיבוטים ממוקדים, וניתן להשתמש בה גם בניסויים אחרים של מיקוד גנים פעילים. שבועיים לאחר בחירת הפורומיצין במינון המותאם לקו ה-iPSC הספציפי, שיבוטים מוכנים לאיסוף על ידי חיתוך ידני של מושבות גדולות ומבודדות לחתיכות קטנות יותר המועברות למדיום טרי בבאר קטנה יותר להרחבה נוספת ובדיקה גנטית ותפקודית. ניתן לעקוב אחר פרוטוקול זה כדי להשיג בקלות קווי iPSC מרובים של מדווח GFP שימושיים להדמיה in vivo ו-in vitro ובידוד תאים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היכולת לתכנת מחדש תאים סומטיים אנושיים לתאים כמו תאי גזע עוברי הנגרמים גזע pluripotent (iPSCs) התגלה לראשונה על ידי et al טקהאשי. בשנת 2007 1. Fibroblasts עורי אדם transduced עם רטרווירוסים להביע ארבעה גורמי שעתוק (יאמאנאקה מה שזכה לכינוי גורמי Oct3 / 4, Sox2, c-Myc, וKlf4) הוצג להיות דומה מאוד לתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) המבוססים על מורפולוגיה, הפצה, ביטוי גנים, ומעמד אפיגנטיים; באופן מכריע, iPSCs גם מסוגל להבדיל לתאים של כל שלוש השכבות הנבט 1. הקיבולת הפוטנציאלית ובידול השגשוג של iPSCs גורמת להם כלים מאוד אטרקטיביים; על ידי תכנות מחדש של תאים מחולים הסובלים ממחלות מסוימות, יכול לשמש גם כiPSCs מערכות במבחנה מודל מחלה וכמו הרפוי פוטנציאלי.

לצורך האחרון, כמה בעיות יש לטפל לפני את מלוא הפוטנציאל של iPSCsבסביבה קלינית יכול להתממש; הפוטנציאל הסרטני במבחנה של hESCs התרבותי וiPSCs, השימוש בנגזרי xenogenic במהלך תכנות מחדש ותחזוקת תא, והצורך לעקוב אחר תאים מושתלים in vivo כל המכשולים הקריטיים ליישום הקליני בתאי גזע pluripotent (נבדק על ידי et Hentze ב. 2). פתרון אידיאלי לצורך מעקב אחר תאים מובחנים לאחר ההשתלה יהיה כרוך סמן חזותי לגילוי שמתנגד השתקה ואת הגיוונים ללא תלות ביישום. ביטוי חזק ומתמשך של transgenes המשולב הוא הכי בקלות להשגה כאשר DNA אקסוגני מוחדר לוקוסים בטוח נמל; כלומר, אתרים הגנומי המאפשרים שעתוק מספק של וקטור משולב ובו בזמן מיתון הפרעות ביטוי בגנים 3 שכנים. אתר אחד כזה שהתאפיין גם מאוד מאז גילויו הוא integr וירוס adeno הקשוריםאתר ation 1 (AAVS1), באינטרון הראשון של 1 12C מקטע הרגולציה גן phosphatase החלבון (PPP1R12C). מוקד זה הוכח לא רק כדי לאפשר ספג וביטוי חזק של transgenes המשולב בזמן הוארך בתרבות ובבידול המבחנה 3, אלא גם כדי להגן מקיפים גנים מהפרעות תעתיק 4; שני התכונות נחשבות בשל נוכחותם של אלמנטים המבודדים הכרומטין אנדוגני איגוף אתר AAVS1 5.

התקדמות בכלים הנדסי הגנום מעל רק בעשור האחרון הקלה באופן משמעותי את קלות ויעילות שבה ניתן להשיג מניפולציות גנטיות בכל סוג תא. בעוד ניסויים מוצלחים מוקדמים הסתמכו על רמות נמוכות ביותר של רקומבינציה אנדוגני ההומולוגית (HR) עם תורם הציג להשיג גן המיקוד בESCs 6,7, השימוש בnucleases אתר ספציפי, כגון nucleases אצבע אבץ (ZFNs), שsignificantly לגרום רקומבינציה ההומולוגית באמצעות הדור של הפסקת פעמיים תקועים DNA גדל היעילות של ניסויים כאלה 8,9 מאוד. Repurposing של שתי effectors כמו activator-השעתוק (הסיפורים) של סוגי Xanthomonas פתוגניים צמח וחוזר פרוקריוטים התקבץ interspaced באופן קבוע הקצר palindromic / מערכת Cas9 לnucleases מעצב אתר ספציפי יעיל (CRISPR) הפך גן מיקוד בתאי גזע pluripotent ונגיש מתודולוגיה מעשית 10-13.

מאמר האחרון שתואר שיטה יעילה לשילוב היציב של קלטת כתב ניאון ירוקה למוקד בטוח נמל AAVS1 בiPSCs האנושי באמצעות nucleases TALE (TALENs) 14. iPSCs הממוקד אלו שומרים על הקרינה שלהם גם לאחר התמיינות מכוונת לשריר לב והשתלה לתוך מודל עכבר של אוטם שריר לב (MI), מתן ראיות חזקות לשירות כזהיציבות בתאי גזע pluripotent ניאון 14. כדי להשיג מושבות ממוקדות, שיטת גן-מלכודת שימשה בי שחבור-acceptor (SA), רצף הפפטיד ביקוע עצמי 2A מציב את puromycin N-אצטיל-transferase הגן (PAC) תחת השליטה של אמרגן PPP1R12C אנדוגני; כך, רק iPSCs ששלב תורם DNA במוקד AAVS1 להביע PAC, טיוח אותם לבחירה המבוסס על puromycin התנגדות; (איור 1, 15). פרוטוקול זה מפרט את הנהלים של יצירת AAVS1-GFP iPSCs דיווח בעיתון האחרון 14, כולל התהליך של transfecting iPSCs עם TALENs ותורם 9.8 kb לשלב קטע DNA 4.2kb למוקד AAVS1 בטוח-הנמל, בחירת iPSCs המבוססים על puromycin-התנגדות, ומושבות קטיף להרחבה משובט. הטכניקות המתוארות במסמך זה יכול להיות מיושם על ניסויי הנדסה גנטית רבים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת ממברנה מטריקס מרתף וציפוי של Plasticware

  1. הנח את מניית מטריקס קרום במרתף הקפואה מ-20 ° C על קרח ולהפשיר לילה בשעה 4 מעלות צלזיוס.
  2. לאחר הפשרה, aliquots פיפטה 2 מ"ג של מטריצת קרום במרתף לתוך צינורות eppendorf טרום צוננים. אחסן אלה ב -20 ° C עד צורך.
  3. כדי להכין צלחות מצופים מטריצת קרום במרתף, להפשיר aliquot אחד על קרח עד החתיכה האחרונה של קרח בנעלם צינור Eppendorf (בדרך כלל תוך ~ 2 שעות).
  4. לאחר הפשרה, להוסיף מטריצת קרום במרתף 12 מיליליטר של DMEM / F12 הקר (4 מעלות צלזיוס) כדי להפוך את פתרון ציפוי מטריצת קרום במרתף.
  5. הוסף פתרון מטריצת קרום במרתף לכלי התרבות המתאימים. לצלחת 6-היטב, לוותר 1 מ"ל לכל טוב. לערבל את הצלחת לוודא פתרון מטריצת הקרום במרתף מכסה לחלוטין כל טוב.
  6. Parafilm לאטום את הצלחת / המנה מצופה מטריצת קרום במרתף, ולדגור על רוטמפרטורה מ 'במשך שעה 1 לפני השימוש. לחלופין, צלחות מצופים מטריצת קרום במרתף חנות / מנות ב 4 ° C ולהשתמש בתוך 2 שבועות של ציפוי.
    הערה: הוספת DMEM / F12 נוסף לצלחת / המנה מצופה מטריצת קרום במרתף כדי למנוע התייבשות. לפני שימוש 4 ° C צלחת / מנה מצופה מטריצת קרום במרתף מאוחסן, למקם אותו בארון בטיחות ביולוגי ולאפשר להם להגיע לטמפרטורת חדר למשך לפחות 30 דקות.
  7. מטריצת קרום במרתף לשאוב לפני התוספת של מדיום ותאים לחלוטין.

2. הכנת בינונית E8

  1. להכין מדיום תרבות E8 על ידי הפשרת תוספת E8 הלילה ב 4 מעלות צלזיוס.
  2. הסר 10 מיליליטר של מדיום בסיס E8 מהמניות 500 מיליליטר וזורקים.
  3. פיפטה כל בקבוקון 10 מיליליטר של תוסף E8 ישירות לתוך 490 מיליליטר של מדיום בסיס E8. האם מדיום E8 מלא לא חם באמבט מים 37 מעלות צלזיוס, כמו תנודות טמפרטורה חוזרות ונשנות יכולות לבזות את bFGF במכלוליםבינוני te E8.
  4. השתמש בינוני E8 מלא בתוך 2 שבועות של תוספת של התוספת.

3. הפשרה של iPSCs

  1. הסר בקבוקון של iPSCs הקפוא מהחנקן נוזלי ומניחים על קרח יבש.
  2. במהירות להפשיר את הבקבוקון באמבט מים 37 מעלות צלזיוס; לערבל את הבקבוקון באמבט המים עד שבר זעיר בלבד של שרידי קרח.
  3. תרסיס הבקבוקון עם 70% אתנול והעברה לארון בטיחות ביולוגי.
  4. הוסף 1 מיליליטר של dropwise הבינוני טמפרטורת חדר E8 ישירות לבקבוקון.
  5. בעזרת פיפטה 2 מיליליטר, להעביר את dropwise ההשעיה תא לתוך 9 מיליליטר של מדיום E8 בצינור חרוטי 15 מיליליטר. לערבל את הצינור לעתים קרובות כדי להבטיח שהתאים ובינוניים מערבבים היטב במהירות.
  6. צנטריפוגה התאים ב XG 200 במשך 5 דקות.
  7. לשאוב supernatant, וresuspend התא גלולה בנפח מתאים של E8 בתוספת 10 מיקרומטר Y-27632.
  8. הוסף את התאים למספר מתאים של מרתף membranמצופי מטריצת דואר בארות, ומקום ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור במשך הלילה. מומלץ צלחת לפחות 0.2 x 10 6 iPSC לכל טוב של 6-גם צלחת כדי לאפשר התאוששות מהירה לאחר הפשרה.

4. תחזוקה וPassaging השגרתי של iPSCs

  1. רענן בינוני E8 יומי.
  2. לפקח על המורפולוגיה וconfluency של תאים עם מיקרוסקופ הפוכה. iPSCs באיכות גבוהה גדל במושבות שטוחות עם גבולות ברורים; מושבות בודדות להחזיק הופעה "כמו מרוצפת-".
  3. מעבר תאי iPSCs כאשר הם מגיעים ~ confluency 70%.
  4. הכן פתרון passaging EDTA על ידי הוספת 0.9 g NaCl ו -500 EDTA μl 0.5 M 500 מיליליטר DPBS. מערבבים היטב כדי לפזר NaCl, ומסנן אבק לעקר. לחמם aliquot של פתרון passaging באמבט מים 37 מעלות צלזיוס לפני passaging.
  5. למעבר, לשאוב בילה בינוני תרבות תאים לשטוף פעם אחת עם נפח שווה של pas החםsaging פתרון. לשאוב, ומספיק EDTA פיפטה פתרון passaging למעייל התאים (1 מיליליטר לכל טוב של 6-גם צלחת).
  6. מניחים את התאים תחת מיקרוסקופ הפוכה ולבחון את מושבות iPSC. המראה של חורים בתוך מושבות וגבולות מורמים יתברר בתוך 2 עד 5 דקות.
  7. בזהירות לשאוב פתרון passaging EDTA.
  8. בעזרת פיפטה 10 מיליליטר, לוותר 4 מיליליטר של מדיום E8 (אם משתמש בצלחת 6-היטב) בלחץ גבוה ישירות לתוך זה גם להיות passaged.
  9. לאסוף את גושי iPSC, ומחולק למספר מתאים של בארות בהתאם ליחס הפיצול בין 1: 8 ל01:12. לא, כמו פירוק של גושי תאים יגרום יתר פיפטה בכדאיות עניה.
  10. מניחים את הצלחת בחממה, ולטלטל את הצלחת בחזרה-ושוב וכמה פעמים מצד לצד כדי לפזר את התאים.

5. הכנת MEFs וiPSCs לTansfection

  1. 48 שעות לפני transfection, iPSCs המעבר ב ~ 1: 6 לארבע או יותר בארות צלחת 6-גם מצופי מטריצת קרום במרתף, כך שהם יהיו מחוברים% 70 יומיים ומכאן.
  2. למחרת, להפשיר MEFs DR4 לתוך מדיום MEF בהיקף של DMEM (גלוקוז גבוהה) בתוספת 10% FBS ו1x MEM-NEAA.
  3. צלחת MEFs DR4 לשתי מנות של 10 סנטימטר ב ~ 2 x 10 4 תאים / 2 סנטימטר ודגירת הלילה על 37 מעלות צלזיוס.
  4. ביום transfection, לשנות בינוני MEF לE8 בתוספת 10 מיקרומטר Y-27632 30 דקות לפני ביצוע transfection על iPSCs.
  5. אופציונאלי: אם ניתוח התזרים cytometric של לאחר transfection iPSCs הוא רצוי, להסיר את צלחת קרום במרתף מצופה מטריצה ​​מ4 ° C ומקום בטמפ 'החדר.
  6. אופציונאלי: 4 שעות לפני transfection, מוסף תרבות iPSC מראש transfection עם Y-27632 בריכוז הסופי של 10 מיקרומטר.

6. עדין-תא דיסוציאציה מגיב לטיפולnd Transfection של iPSCs באמצעות מערכת Electroporation

  1. הסר פתרון transfection התא ראשוני P3 מ4 ° C ולאפשר לו להגיע לטמפרטורת חדר למשך 30 דקות ~. להוסיף את תוספת 100 μl השלם לפתרון transfection לפני השימוש.
  2. מגיב חם עדינים תאי ניתוק באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
  3. להשיג AAVS1 TALENs (PZT-AAVS1-L1 וPZT-AAVS1-R1) תורם וAAVS1-CAG-EGFP מ-20 ° C.
  4. הסר iPSCs מן החממה ולשטוף פעם אחת עם DPBS.
  5. הוסף 1 מיליליטר של מגיב ניתוק עדין תאים לכל טוב, ודגירת iPSCs על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, או עד שיותר מ -50% מהתאים ניתקו מכלי התרבות.
  6. פיפטה את התאים למעלה ולמטה כמה פעמים בעזרת פיפטה p1000 לנתק את כל תאים שנותרו מספינת התרבות, וכדי לשבור את גושי iPSC.
  7. הוסף 2 מיליליטר של מדיום E8 היטב כל אחד, ופיפטה מספר פעמים למעלה ולמטה באמצעות פיפטה 10 מיליליטר לפיורדאאה disaggregate גושי תאים לתאים בודדים
    הערה: יעילות Transfection יורדת באופן משמעותי אם גושי תא אינם מספיק מפוצלים.
  8. לאסוף iPSCs בצינור חרוטי 15 מיליליטר, ו צנטריפוגות ב 3 דקות 100 XG.
  9. לשאוב supernatant, ותאים גלולים בסכום מינימאלי של מדיום E8.
  10. ספירת התאים באמצעות hemocytometer לאחר היישום של כתם חיוני כמו 0.4% Trypan כחול. ודא כי תאים הם ניתקו מספיק תוך ספירת (1-3 תאים לכל "גוש").
  11. לוותר 3 x 10 6 תאים לכל אחד משני צינורות חרוטי 15 מיליליטר, וספין למטה שוב ב 100 XG במשך 3 דקות.
    הערה: צנטריפוגה במהירות נמוכה מפחיתה את מתח התא ומאפשרת מחדש השעיה קלה של iPSCs לפני electroporation.
  12. הגדר את מערכת electroporation לתכנית הספציפית תאים מהסוג לקו העוברי האנושי בתאי גזע H9 (תכנית CB-150).
  13. לאחר צנטריפוגה, לשאוב supernatant מcelכדורי l. לגלולה אחת, להוסיף 10 מיקרוגרם של תורם HR כמדגם שליטה. לגלולה אחרת להוסיף 10 מיקרוגרם של תורם HR, יחד עם 5 מיקרוגרם של כל Talen (PZT-AAVS1-L1 וPZT-AAVS1-R1) כמדגם ניסיוני.
  14. Resuspend כל תא גלולה בפתרון של transfection התא הראשוני P3 100 μl, ולהעביר לקובט.
  15. בצע את transfection ולהוסיף מייד 500 μl של מדיום E8 טמפרטורת חדר לכל קובט.
  16. העבר את dropwise iPSCs transfected לצלחת 10 סנטימטרים אחד המכילה MEFs DR4 מוכן בשלב 5.4.
  17. אופציונאלי: להוסיף כמה טיפות מכל ניסוי ולאחת מצלחת 6-היטב מצופה מטריצת קרום במרתף אם זרימת cytometry anaylsis של יעילות transfection היא רצויה.
  18. חזור על שלבים 6.15-6.17 לסיים שתי הדגימות. למחרת, לשטוף תאים עם DPBS פעמיים ולעבור מדיום התרבות NutriStem, המופיע לתמוך תרבות iPSC על מתקני האכלה טובות יותר מאשר E8.
  19. Trפסגות ביטוי EGFP ansient ב48 עד 72 שעות לאחר transfection; להעריך את יעילות transfection כרצוי.

7. puromycin בחירה של iPSCs הממוקד

  1. בגין בחירת puromycin 72 שעות לאחר transfection כאשר iPSCs להגיע 70% confluency.
  2. לNCRM5 iPSCs, יתחיל בחירת puromycin ברמה של 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר puromycin (1/2 מנה המלאה) המדולל למדיום תרבות NutriStem. ריכוז puromycin האופטימלי עשוי להשתנות מ0.25 ל1 מיקרוגרם / MLL לכמה קווי iPSC.
  3. iPSCs תרבות ב0.5 מיקרוגרם / מיליליטר puromycin NutriStem + במשך 3 ימים, מרענן הבינוני יומי.
  4. אחרי 3 ימים, להגדיל את הריכוז של puromycin ל1 מיקרוגרם / מיליליטר.
  5. iPSCs תרבות תחת 1 מיקרוגרם / בחירת puromycin מיליליטר במשך 7 עד 8 ימים נוספים, או עד מושבות שונות מופיעים גדולה מספיק למסיק מושבה.

8. מושבה קטיף והרחבה של iPSCs הממוקד

  1. קרום במרתף שימושמטריצה ​​למעייל צלחת 96-היטב על ידי מחלק 50 μl של פתרון ציפוי מטריצת קרום במרתף (מטריצת קרום במרתף 2 מ"ג המדולל ל -12 מיליליטר DMEM / F12) לתוך כל טוב. אחסן את הצלחת ב 4 מעלות צלזיוס למשך לילה לפני השימוש.
  2. לאחר שאפשר את הצלחת מצופה מטריצת הקרום במרתף כדי להגיע לטמפרטורת חדר, לשאוב את מטריצת הקרום במרתף ולוותר 100 μl E8 בתוספת 10 מיקרומטר Y-27632 לכל אחד.
  3. הנח מיקרוסקופ הפוכה לארון בטיחות ביולוגי, ולרסס קל עם 70% EtOH לעקר.
  4. משוך זכוכית פיפטה פסטר מעל מבער בונזן להשיג כלי המושבה קטיף אידיאלי שיש לו "וו" זעיר בקצה. לעקר עם 70% EtOH, ואת המקום במכסת המנוע לייבוש.
  5. הסר את הצלחת המכילה מושבות iPSC ממוקדות מהחממה, ואת המקום לתוך מכסה המנוע מתחת למיקרוסקופ.
  6. בחר iPSCs על ידי התחקות מעגל סביב גבול המושבה עם כלי קטיף המושבה.
  7. השתמש ב" הוו "של כלי המושבה הקטיף כדי לגרד בעדינות ולהסיר את המושבה iPSC מפני שטח של הצלחת. למושבות גדולות יותר, ציור X עם כלי קטיף המושבה לרבעון המושבה תקל תא צמיחה לאחר מחדש ציפוי.
  8. ברגע שגושי תאים מנותקים וצפים בחופשיות, להשתמש פיפטה p200 מוגדרת ~ 30 μl לאסוף iPSCs. פלייט תאים ישירות לתוך צלחת 96-היטב.
  9. אופציונאלי: להשתמש פיפטה P20 מוגדרת ~ 5 μl לאסוף iPSCs לתוך צינור eppendorf, ולאחר מכן להוסיף 50 μl מגיב ניתוק עדין תאים לעכל במשך 5 דקות על 37 מעלות צלזיוס. לאחר עיכול, להוסיף בינוני E8 500 μl לתוך צינור eppendorf לדלל מגיב ניתוק העדין-תא ולסובב את התאים ב XG 200 בmicrocentrifuge טבלה העליון סטנדרטי למשך 5 דקות. אז לשאוב ביותר של המדיום ולהשאיר ~ 30 μl לresuspend ולהעביר את התאים לתוך הצלחת 96-היטב.
    הערה: זוגישה תקל על הניתוק של גוש התא והתרחבות מהירה של מושבה הרימה.
  10. המשך קטיף מושבה עד מספר מספיק של מושבות iPSC נאספו (בערך 20-30 מושבות לכל ניסוי מומלץ).
  11. לאחר קטיף מושבה, למקם את צלחת 96-היטב באינקובטור במשך לילה. רענן עם מדיום מלא E8 למחרת, ותרבות ומחוברות עד ~ 70%.
  12. תאי מעבר מ96-היטב לתוך 24 גם, אז ל6-גם, כפי שמתוארים בשלבי 4.5-4.10.
    הערה: הכרכים של פתרון EDTA ובינוני E8 צריכים להיות מופחתים באופן יחסי בעת שימוש בבארות קטנות יותר מצלחת 6-היטב.
  13. להעריך הצלחת מיקוד בצומת PCR וניתוח כתם דרום כדי לאשר שילוב ממוקד קלטת והעדר וקטורים הוכנסו באופן אקראי 16.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדמיה של הפרוטוקול מסופקת באיור 2, עם תקופות בי iPSCs בתרבית בינונית שונה מודגש על ידי שני ירוקים לE8 או הכחול לNutriStem. חשוב transfect רק iPSCs באיכות גבוהה; לבחון מנות תרבות ברחבי תחזוקה שוטפת ולוודא שתרבויות iPSC מכילות מושבות בעיקר ברורות נושאות מורפולוגיה כמו מרוצפת (איור 3 א); תאים מובחנים לא צריכים לכבוש יותר מ -10% מהתרבות. Transfectability של iPSCs מוערך ומותאם באמצעות הווקטור הקטן Pmax-GFP (איור 4 א-B), כtransfection ע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השלבים הקריטיים ביותר עבור הדור המוצלח של נמל בטוח AAVS1 ממוקד iPSCs האנושי: (1) ביעילות מספק פלסמידים Talen ותורם לiPSCs ידי transfection; (2) אופטימיזציה של הניתוק של iPSCs לתוך תאים בודדים לפני transfection וציפוי צפיפות לאחר transfection; (3) אופטימיזציה של מינון וזמן של סמים-בחירה מבוססת על הצמיחה של קו iPSC; (4) לנתח בזהירות ולקטוף מושבות ממוקדות והעברה לצלחת חדשה / טוב. בהשוואה לשיטות דומות בשימוש בנייר של Hockemeyer 10, פרוטוקול זה משמש זוג קוד הפתוח AAVS1-TALEN...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי הקרן המשותפת של ה-NIH ותוכנית המחקר התוך-מוראלית של המכון הלאומי לדלקת מפרקים, מחלות שרירים ושלד ועור.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מטריצת ממברנת הבסיס של Matrigel Growth Factor Reduced (GFR), *ללא LDEV, 10 מ"לCorning354230חנות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
DMEM/F-12Life Technologies11320-033חנות ב-4 מעלות צלזיוס.
Costar 6 Well Clear TC-Treated TC Multiple Well LightsCorning3506
Essential 8 MediumLife TechnologiesA1517001לאחסן את המדיום הבסיסי ב-4 מעלות
Y-27632 דיהידרוכלורידTocris1254חנות בטמפרטורת החדר. לאחר המסה ב-H2O, יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
נתרן כלוריסיגמאS5886-500G
UltraPure 0.5 מ' EDTA, pH 8.0Life Technologies15575-020
DPBS, ללא סידן, ללא מגנזיוםLife Technologies14190-250
100 מ"מ קורנינג תרבית מטופל430167
DR4 MEF 2M IRR -GlobalStemGSC-6204Gאקדמי אחסון בחנקן נוזלי.
DMEM, גלוקוז גבוה, פירובטLife Technologies11995-040חנות ב -4 מעלות צלזיוס.
סרום בקר עוברי מוגדר,HyCloneSH30070.03חנות ב -20 & מעלות צלזיוס הפשרה ב -4 מעלות; C לילה ו-aliquot. אחסן את הכמויות בטמפרטורה של -20 מעלות; C עד הצורך.
MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות (100X)Life Technologies11140-050חנות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
יחידת ליבת נוקלאופקטור 4D LonzaAAF-1001Bחלק ממערכת האלקטרופורציה
4D-Nucleofector X unit LonzaAAF-1001Xחלק ממערכת האלקטרופורציה
P3 תא ראשוני 4D-Nucleofector X Kit L (24 RCT)LonzaV4XP-3024עם ההגעה, הסר את תמיסת התא הראשוני והשלם ואחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
StemPro Accutase Cell Dissociation ReagentLife TechnologiesA1110501חנות ב -20 מעלות צלזיוס הפשרה למשך הלילה ב -4 מעלות; C ולחמם aliquot ב -37 מעלות; C אמבט מים לפני השימוש.
NutriStem XF/FF Culture MediumStemgent01-0005חנות ב-20 מעלות צלזיוס. C
AAVS1 TALENs (pZT-AAVS1-L1 ו-pZT-AAVS1-R1)Addgene52637 ו-52638
[header]
AAVS1-CAG-EGFP תורם רקומבינציה הומולוגיתAddgene22212
Puromycin DihydrochlorideLife TechnologiesA11138-03אחסן ב-20 °C. הכן ציטוטי עבודה של 1 מ"ג/מ"ל ב-ddH2O.
חד פעמי בורוסיליקט זכוכית פסטר פישרסיינטיפיק13-678-20A
Sorvall Legend XTR (מקורר), 120 V 60 הרץThermo Scientific75-004-521
TX-750 4 & פעמים; 750 מ"ל דלי מתנדנד רוטורThermo Scientific75003607
Trypan Blue Solution, 0.4%Life Technologies15250-061
צלזיוס. TC ממקור ארה"ב

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Hentze, H., Graichen, R., Colman, A. Cell therapy and the safety of embryonic stem cell-derived grafts. Trends Biotechnol. 25 (1), 24-32 (2007).
  3. Smith, J. R., et al. Robust, persistent transgene expression in human embryonic stem cells is achieved with AAVS1-targeted integration. Stem Cells. 26 (2), 496-504 (2008).
  4. Lombardo, A., et al. Site-specific integration and tailoring of cassette design for sustainable gene transfer. Nat Methods. 8 (10), 861-869 (2011).
  5. Ogata, T., Kozuka, T., Kanda, T. Identification of an insulator in AAVS1, a preferred region for integration of adeno-associated virus DNA. J Virol. 77 (16), 9000-9007 (2003).
  6. Zwaka, T. P., Thomson, J. A. Homologous recombination in human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 21 (3), 319-321 (2003).
  7. Urbach, A., Schuldiner, M., Benvenisty, N. Modeling for Lesch-Nyhan disease by gene targeting in human embryonic stem cells. Stem Cells. 22 (4), 635-641 (2004).
  8. Hockemeyer, D., et al. Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases. Nature biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).
  9. Zou, J., et al. Gene targeting of a disease-related gene in human induced pluripotent stem and embryonic stem cells. Cell stem cell. 5 (1), 97-110 (2009).
  10. Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nature. 29 (8), 731-734 (2011).
  11. Sanjana, N. E., et al. A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering. Nature protocols. 7 (1), 171-192 (2012).
  12. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  13. Ding, Q., et al. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell stem cell. 12 (4), 393-394 (2013).
  14. Luo, Y., et al. Stable Enhanced Green Fluorescent Protein Expression After Differentiation and Transplantation of Reporter Human. Induced Pluripotent Stem Cells Generated by AAVS1 Transcription Activator-Like Effector Nucleases. Stem Cells Transl Med. 3 (7), 821-835 (2014).
  15. Zou, J., et al. Oxidase-deficient neutrophils from X-linked chronic granulomatous disease iPS cells: functional correction by zinc finger nuclease-mediated safe harbor targeting. Blood. 117 (21), 5561-5572 (2011).
  16. Luo, Y., Rao, M., Zou, J. Generation of GFP Reporter Human Induced Pluripotent Stem Cells Using AAVS1 Safe Harbor Transcription Activator-Like Effector Nuclease. Curr Protoc Stem Cell Biol. 29, 5A.7.1-5A.7.18 (2014).
  17. Peters, D. T., Cowan, C. A., Musunuru, K. Genome editing in human pluripotent stem cells. StemBook. , Harvard Stem Cell Institute. Cambridge, MA. Available from: http://www.stembook.org/node/1438 (2008-2013).
  18. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  19. Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat Protoc. 7, 2029-2040 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

iPSCTargeting TALENGFP ReporterE8

מאמרים קשורים