עריכת גנים בתיווך TALEN בלוקוס AAVS1 בנמל המבטחים מאפשרת הוספת טרנסגנים ביעילות גבוהה ב-iPSCs אנושיים. פרוטוקול זה מתאר את ההליכים להכנת iPSCs להעברת TALEN וקטור תורם, טרנספקציה של iPSCs ובחירה ובידוד של שיבוטי iPSC כדי להשיג אינטגרציה ממוקדת של גן GFP ליצירת קווי דיווח.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Transfection, בחירה, ומושבת קטיף של תאי גזע האנושי המושרה pluripotent Talen-ממוקד עם גן GFP לSafe Harbor AAVS1
במאמר זה
סיכום
תקציר
תוספת טרנסגנים ממוקדת יכולה לספק ביטוי גנים מתמשך תוך עקיפת השתקת הגנים ומוטגנזה הנגרמת על ידי אינטגרציה אקראית בתיווך וקטור ויראלי. פרוטוקול זה מתאר פלטפורמת הוספה ממוקדת טרנסגנים אוניברסלית ויעילה ב-iPSCs אנושיים המבוססת על שימוש ב-TALENs מאומתים בקוד פתוח ותורם דמוי מלכודת גנים כדי להעביר טרנסגנים למקום נמל מבטחים. חשוב לציין, עריכת גנים יעילה מוגבלת בקצב על ידי יעילות המסירה של וקטורים לעריכת גנים. לכן, פרוטוקול זה מתמקד תחילה בהכנת iPSCs לטרנספקציה כדי להשיג יעילות שיגור גרעינית גבוהה. כאשר iPSCs מפורקים לתאים בודדים באמצעות ריאגנט דיסוציאציה עדין של תאים ומועברים באמצעות תוכנית אופטימלית, ניתן לגרום ל->50% מהתאים לקלוט את הווקטורים הגדולים לעריכת גנים. מכיוון שלוקוס AAVS1 ממוקם באינטרון של גן פעיל (PPP1R12C), נעשה שימוש בגן עמיד לפורומיצין (PAC) המקושר לשחבור (SA) לבחירת iPSCs ממוקדים תוך אי הכללת תאים אקראיים לאינטגרציה בלבד ולא מועברים. אסטרטגיה זו מגדילה מאוד את הסיכוי להשיג שיבוטים ממוקדים, וניתן להשתמש בה גם בניסויים אחרים של מיקוד גנים פעילים. שבועיים לאחר בחירת הפורומיצין במינון המותאם לקו ה-iPSC הספציפי, שיבוטים מוכנים לאיסוף על ידי חיתוך ידני של מושבות גדולות ומבודדות לחתיכות קטנות יותר המועברות למדיום טרי בבאר קטנה יותר להרחבה נוספת ובדיקה גנטית ותפקודית. ניתן לעקוב אחר פרוטוקול זה כדי להשיג בקלות קווי iPSC מרובים של מדווח GFP שימושיים להדמיה in vivo ו-in vitro ובידוד תאים.
מבוא
היכולת לתכנת מחדש תאים סומטיים אנושיים לתאים כמו תאי גזע עוברי הנגרמים גזע pluripotent (iPSCs) התגלה לראשונה על ידי et al טקהאשי. בשנת 2007 1. Fibroblasts עורי אדם transduced עם רטרווירוסים להביע ארבעה גורמי שעתוק (יאמאנאקה מה שזכה לכינוי גורמי Oct3 / 4, Sox2, c-Myc, וKlf4) הוצג להיות דומה מאוד לתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) המבוססים על מורפולוגיה, הפצה, ביטוי גנים, ומעמד אפיגנטיים; באופן מכריע, iPSCs גם מסוגל להבדיל לתאים של כל שלוש השכבות הנבט 1. הקיבולת הפוטנציאלית ובידול השגשוג של iPSCs גורמת להם כלים מאוד אטרקטיביים; על ידי תכנות מחדש של תאים מחולים הסובלים ממחלות מסוימות, יכול לשמש גם כiPS....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת ממברנה מטריקס מרתף וציפוי של Plasticware
- הנח את מניית מטריקס קרום במרתף הקפואה מ-20 ° C על קרח ולהפשיר לילה בשעה 4 מעלות צלזיוס.
- לאחר הפשרה, aliquots פיפטה 2 מ"ג של מטריצת קרום במרתף לתוך צינורות eppendorf טרום צוננים. אחסן אלה ב -20 ° C עד צורך.
- כדי להכין צלחות מצופים מטריצת קרום במרתף, להפשיר aliquot אחד על קרח עד החתיכה האחרונה של קרח בנעלם צינור Eppendorf (בדרך כלל תוך ~ 2 שעות).
- ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הדמיה של הפרוטוקול מסופקת באיור 2, עם תקופות בי iPSCs בתרבית בינונית שונה מודגש על ידי שני ירוקים לE8 או הכחול לNutriStem. חשוב transfect רק iPSCs באיכות גבוהה; לבחון מנות תרבות ברחבי תחזוקה שוטפת ולוודא שתרבויות iPSC מכילות מושבות בעיקר ברורות נושאות מורפולוגיה כמו מרוצפת (איור 3 א); תאים מובחנים לא צריכים לכבוש יותר מ -10% מהתרבות. Transfectability של iPSCs מוערך ומותאם באמצעות הווקטור הקטן Pmax-GFP (איור 4 א-B), כtransfection ע.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
השלבים הקריטיים ביותר עבור הדור המוצלח של נמל בטוח AAVS1 ממוקד iPSCs האנושי: (1) ביעילות מספק פלסמידים Talen ותורם לiPSCs ידי transfection; (2) אופטימיזציה של הניתוק של iPSCs לתוך תאים בודדים לפני transfection וציפוי צפיפות לאחר transfection; (3) אופטימיזציה של מינון וזמן של סמים-בחירה מבוססת על הצמיחה של קו iPSC; (4) לנתח בזהירות ולקטוף מושבות ממוקדות והעברה לצלחת חדשה / טוב. בהשוואה לשיטות דומות בשימוש בנייר של Hockemeyer 10, פרוטוקול זה משמש זוג קוד הפתוח AAVS1-TALEN.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
תודות
מחקר זה נתמך על ידי הקרן המשותפת של ה-NIH ותוכנית המחקר התוך-מוראלית של המכון הלאומי לדלקת מפרקים, מחלות שרירים ושלד ועור.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מטריצת ממברנת הבסיס של Matrigel Growth Factor Reduced (GFR), *ללא LDEV, 10 מ"ל | Corning | 354230 | חנות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320-033 | חנות ב-4 מעלות צלזיוס. |
| Costar 6 Well Clear TC-Treated TC Multiple Well Lights | Corning | 3506 | |
| Essential 8 Medium | Life Technologies | A1517001 | לאחסן את המדיום הבסיסי ב-4 מעלות |
| Y-27632 דיהידרוכלוריד | Tocris | 1254 | חנות בטמפרטורת החדר. לאחר המסה ב-H2O, יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. |
| נתרן כלורי | סיגמא | S5886-500G | |
| UltraPure 0.5 מ' EDTA, pH 8.0 | Life Technologies | 15575-020 | |
| DPBS, ללא סידן, ללא מגנזיום | Life Technologies | 14190-250 | |
| 100 מ"מ קורנינג תרבית מטופל | 430167 | ||
| DR4 MEF 2M IRR - | GlobalStem | GSC-6204G | אקדמי אחסון בחנקן נוזלי. |
| DMEM, גלוקוז גבוה, פירובט | Life Technologies | 11995-040 | חנות ב -4 מעלות צלזיוס. |
| סרום בקר עוברי מוגדר, | HyClone | SH30070.03 | חנות ב -20 & מעלות צלזיוס הפשרה ב -4 מעלות; C לילה ו-aliquot. אחסן את הכמויות בטמפרטורה של -20 מעלות; C עד הצורך. |
| MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות (100X) | Life Technologies | 11140-050 | חנות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. |
| יחידת ליבת נוקלאופקטור 4D | Lonza | AAF-1001B | חלק ממערכת האלקטרופורציה |
| 4D-Nucleofector X unit | Lonza | AAF-1001X | חלק ממערכת האלקטרופורציה |
| P3 תא ראשוני 4D-Nucleofector X Kit L (24 RCT) | Lonza | V4XP-3024 | עם ההגעה, הסר את תמיסת התא הראשוני והשלם ואחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A1110501 | חנות ב -20 מעלות צלזיוס הפשרה למשך הלילה ב -4 מעלות; C ולחמם aliquot ב -37 מעלות; C אמבט מים לפני השימוש. |
| NutriStem XF/FF Culture Medium | Stemgent | 01-0005 | חנות ב-20 מעלות צלזיוס. C |
| AAVS1 TALENs (pZT-AAVS1-L1 ו-pZT-AAVS1-R1) | Addgene | 52637 ו-52638 | |
| [header] | |||
| AAVS1-CAG-EGFP תורם רקומבינציה הומולוגית | Addgene | 22212 | |
| Puromycin Dihydrochloride | Life Technologies | A11138-03 | אחסן ב-20 °C. הכן ציטוטי עבודה של 1 מ"ג/מ"ל ב-ddH2O. |
| חד פעמי בורוסיליקט זכוכית פסטר פישר | סיינטיפיק | 13-678-20A | |
| Sorvall Legend XTR (מקורר), 120 V 60 הרץ | Thermo Scientific | 75-004-521 | |
| TX-750 4 & פעמים; 750 מ"ל דלי מתנדנד רוטור | Thermo Scientific | 75003607 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 |
מקורות
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Hentze, H., Graichen, R., Colman, A. Cell therapy and the safety of embryonic stem cell-derived grafts. Trends Biotec....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
