קביעת טופולוגיה חלבון ממברנה באמצעות הקרינה הגנת פרוטאז (FPP)

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לקביעת הכיוון והטופולוגיה של חלבוני ממברנה אינטגרליים בתאים חיים. פרוטוקול פשוט זה מסתמך על רגישות סלקטיבית לפרוטאז של כימרות בין החלבון המעניין ל-GFP.

תקציר

הטופולוגיה והכיוון הנכונים של חלבוני ממברנה אינטגרליים חיוניים לתפקודם התקין, אך מידע כזה לא הוכח עבור חלבוני ממברנה רבים. מוצגת טכניקה פשוטה הנקראת הגנת פרוטאז פלואורסצנטי (FPP), המאפשרת קביעת טופולוגיית חלבון הממברנה בתאים חיים. לטכניקה זו יתרונות רבים על פני שיטות אחרות לקביעת טופולוגיית חלבון, בכך שהיא אינה דורשת זמינות של נוגדנים מרובים כנגד תחומים שונים של חלבון הממברנה, אינה דורשת כמויות גדולות של חלבון וניתנת לביצוע על תאים חיים. שיטת FPP משתמשת בפעולות המוגבלות מרחבית של פרוטאזות על פירוק חלבוני ממברנה מתויגים של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) כדי לקבוע את טופולוגיית הממברנה והכיוון שלהם. גישה פשוטה זו ישימה למגוון רחב של סוגי תאים, וניתן להשתמש בה כדי לקבוע את כיוון חלבון הממברנה באברונים תת-תאיים שונים כגון המיטוכונדריה, גולגי, רשתית אנדופלזמית ורכיבים של המערכת האנדוזומלית/מחזורית. חלבוני ממברנה, המתויגים על N-termini או C-termini עם היתוך GFP, באים לידי ביטוי בתא מעניין, הנתון לחדירות סלקטיבית באמצעות חומר הניקוי דיגיטונין. לדיגיטונין יכולת לחלחל את קרום הפלזמה, תוך השארת אברונים תוך תאיים שלמים. חלקי GFP החשופים לציטוזול יכולים להתפרק באופן סלקטיבי באמצעות מריחת פרוטאז, ואילו חלקיקי GFP הקיימים בלומן של אברונים מוגנים מפני הפרוטאז ונשארים שלמים. בדיקת FPP היא פשוטה, וניתן להשיג תוצאות במהירות.

מבוא

ממברנות הפלזמה, כמו גם את הקרומים תאיים הרבים, שמשו כחיץ המפריד בין שני תאים מימיים. במקרה של קרום הפלזמה, ההפרדה היא בין החוץ ופנים של התא; לאברונים תוך-תאיים הוא בין הציטופלסמה ולומן אברון. לדוגמא, קרום reticulum endoplasmic (ER) מפריד בין סביבת חמצון בתוך לומן של ER מcytosolic צמצום הסביבה ^1. חלבוני קרום מסונתזים על ריבוזומים הקשורים ER, ולהשיג טופולוגיה הסופית שלהם בתוך הקרום ER ^2. רכישת אוריינטצית קרום המתאימה וטופולוגיה לחלבונים היא חיונית לתפקוד הנורמלי שלהם. טופולוגיה הנכונה מאפשרת תחומים רלוונטיים של חלבונים בממברנה כדי אינטראקציה עם השותפים המחייבים שלהם, הוא מאפשר לאחר translational שינויים קריטיים להתרחש, ובמקרה של חלבוני קרום פלזמה, מאפשר לתא לקיים אינטראקציה עם ולהגיב to סביבתה. כדי להעריך את תפקודו של חלבון קרום באופן מלא, ברור שהכרחי לדעת איך חלבון שמכוון ביחס לקרום שבתוכה הוא שוכן, כלומר, טופולוגיה הממברנה שלו. בנוסף לרכישת ידע מדעי בסיסי, הבנת הטופולוגיה של חלבון קרום ואילו היבטים של משטח חלבון נחשפים לסביבות שונות סימנה השלכות קליניות מאז חלבוני קרום מהווים את רוב המטרות תרופתיות ^3. עד לאחרונה, גישות לקביעת טופולוגיה חלבון קרום דורשת השקעה רבה בזמן ובכסף, או שנדרש ריאגנטים שקשה להשיג.

שני גישות ניסיוניות ובסיליקון ולהיות מועסקים על מנת לקבוע את הטופולוגיה של חלבוני הקרום המתגוררים בתוך קרום הפלזמה. מאז התחזיות הראשונות של תחומים קרום פורש המבוססים על ההערכה של הידרופוביות indiviחומצות אמינו כפולים ^3, אלגוריתמים חזוי רבים זמינות כעת באינטרנט, ופשוט דורשות ידע של רצף החומצות האמיניות של החלבון. עם זאת, הנחות הן לעתים קרובות מרכזיות לתוכניות כגון דוגמנות, הנחות שיכולים להוביל למשימות לא נכונות של טופולוגיה ^4,5. יתר על כן, בעוד שתחזיות מבוססות מחשב אלה יכולים בהיסוס להקצות אזורים פורש קרום, הם לא תמיד לקבוע אם אמינו או termini carboxy של חלבונים הם בציטופלסמה, לומן אברון או חיצוני תא. אפילו עם עליית כוח חישוב, והשימוש באלגוריתמי למידת מכונה ^6, נתונים כאלה הוא עדיין מודל, וחייב להיות מאומת באמצעות נתונים שנרכשו באופן ניסיוני. קביעה ניסיונית ישירה של טופולוגיה קרום כבר התחייבה באמצעות פנלים של נוגדנים חד-שבטיים עם epitopes הידועה מופצת ברחבי החלבון, שבו הערכה של immunoreactivity נעשתה לפני ואחרי permeabilization התא. זהגישה דורשת מערך של נוגדנים, אשר לא יכול להיות זמינה לחלבון של עניין.

אסטרטגיה חלופית היא להנדס תגי epitope כגון myc או hemagglutinin (HA) למקומות שונים ברחבי החלבון, ואחרי שוב על ידי קביעת immunoreactivity לפני ואחרי permeabilization הקרום. בנוסף לתגים חיסוניים, תגים האנזימטית (כולל phosphatase אלקליין, β -galactosidase, או -lactamase β) ושינויים כימיים כגון סריקת ציסטאין שכל הועסקו כדי לקבוע טופולוגיה חלבון קרום ^7,8. שיטה נוספת המועסקות למיפוי טופולוגי של חלבוני קרום פלזמה מסתמכת על גישה מעט שונה לתגי epitope. בשיטה זו את רצף התג הוא רצף קונסנסוס glycosylation N הצמוד NXS / T. מאז glycosylation מתרחשת רק כאשר רצף זה נוכח בלומן של מסלול biosynthetic, הנוכחות של התג בluminal לעומתתא cytosolic הוא ציין בקלות כמו שינוי מסה על ג'לי SDS-PAGE. גישה כזו הוחל ערוץ יון multispanning ⁹ CFTR. בעוד שכל הגישות הללו כבר נוצלו, ברור שכל מה שהם דורשים השקעות רבות בביולוגיה מולקולרית כדי ליצור רצף ומבני הסעפת.

כדי לקבוע מידע טופולוגי לגבי חלבונים הטרנסממברני ממוקמים בתוך אברונים תוך-תאיים הוכיח להיות מאתגרים יותר. היישום של טכנולוגיות מבוססות הקרינה עם זאת, הפך את הנחישות של טופולוגיה קרום הרבה יותר פשוט. הטכניקה של שלמת הקרינה bimolecular (BiFC) מסתמכת על האינטראקציה בין שני שברים שאינם ניאון של חלבון פלואורסצנטי, שחזור מאפייני הניאון של החלבון ^ש-10. למרות שתחילה תאר לקביעת אינטראקציות בין חלבונים in vivo ^10, גישה זו גם נוצלהכדי לקבוע טופולוגיה חלבון קרום בתאי צמח ^11. עם זאת גישה זו היא גם זמן אינטנסיבי כפי שהוא דורש לא רק הדור של חלבוני היתוך עם החלבון של עניין, אלא גם מגוון של חלבוני היתוך ממוקדים ללום cytosol או אברון, ודורש ידע שבתאי קרומי החלבון של העניין מתגורר ב .

גישה חלופית פשוטה יותר לקביעת טופולוגיה חלבון הקרום תוארה ^12. Assay, הקרינה פרוטאז ההגנה (FPP) דורשת את הדור של חלבון היתוך בין GFP והגן של עניין. הגישה מבוססת על הנגישות היחסית של פרוטאזות שאינה ספציפית למחצית GFP; תלוי אם GFP מוגן מproteolysis על ידי המתגורר בלומן של אברונים תוך-תאיים או חשוף לproteolysis מעצם נוכחותו בcytosol. לכן, אם מחצית GFP על החלבון של עניין בפני ציטופלסמה, היא תהיה חשופה לפעילות פרוטאז ואותות הקרינה לאיבוד. לעומת זאת, אם מחצית GFP על החלבון של עניין בפני סביבה 'מוגנת' מפרוטאז (כגון לום Golgi) ולאחר מכן את אות הקרינה תתמיד.

כדי לאפשר פרוטאזות להיכנס לתא, אך לא להיכנס לתאי קרום תאיים digitonin תרופת הכולסטרול מחייב משמש. כולסטרול הוא סטרולים הדומיננטיים בבעלי חוליות, והוא מועשר באופן ספציפי בקרום הפלזמה ביחס לתאים תאיים. רעלן glycoside, digitonin, מופק אצבעונית הארגמנית צמח. יש digitonin זיקה לממברנות עשירות בכולסטרול, שבו היא מובילה לקרום בררני permeabiliztion ^14,16 (איור 1). בנוסף מאפשר יציאה של רכיבי cytosolic קטנים, permeabilization digitonin גם מאפשר הכניסה של מולקולות חיצוניות, כגון K proteinase או טריפסין. פרוטוקול FPP מנצל את fact שקרום הפלזמה מכיל עד 80% מכולסטרול סלולארי ^17, ואילו אברונים אחרים, כגון ER, Golgi, endosomes, מיטוכונדריה, שיש להם תוכן כולסטרול נמוך מאוד, נותרה על כנן ^14. ההתאגדות סלקטיבית של כולסטרול לתוך קרום הפלזמה נצפתה בתאים רבים אוקריוטים, המתירה את השימוש בpermeabilization קרום הפלזמה digitonin תלוי במינים האיקריוטים מגוונים כגון S. cerevisiae ^ל14,18 אנושיים. Assay FPP מספק דרך פשוטה, מהירה וחזקה למדי של קביעה (א) אם חלבון הוא קרום מחויב / קשורים או diffusible בחופשיות בcytosol ו- (ב) שהתחום של חלבון קרום פונה ללום cytosol או אברון. צריך חלבון קרום אוריינטציות מרובות, האות תנבע מהצורה הדומיננטית וצורות קטין לא תזוהה. אמנם יש יכול להיות קצת חששו כי התוספת של מחצית GFP לחלבון על ריבית עשויה להשפיע על תפקודה ו/ או לוקליזציה subcellular, זה בעצם יותר תיאורטי מאשר בפועל. ואכן מחקרים רבים הראו באופן ברור כי תג ה- GFP לא לשנות את המאפיינים של החלבון ^19,20.

פרוטוקול

1. דור ואישור של מפלצות חלבון פלואורסצנטי

1. צרף חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) לטרמיני אמינו או carboxyl של החלבון של עניין באמצעות אסטרטגיות DNA רקומביננטי סטנדרטיים ^13.
   הערה: למרות שיש לנו בשימוש נרחב GFP, גרסאות אחרות כגון חלבון ציאן ניאון (CFP), חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP), יכולים להיות מועסקות DsRed וmCherry. השיפורים בfluorophore מתקפל יעילות, בהירות וphotostability כל הזמן שנעשים, וחוקרים צריכים להיעזר בבונת הדור האחרונה.
   1. לאשר רצף ה- DNA נכון ולוודא שמחצית GFP היא במסגרת עם החלבון של עניין. לבצע רצף באמצעות אסטרטגיות DNA רקומביננטי סטנדרטיים ^21.
      הערה: יש מוסדות רבים מתקני DNA ליבה, שהחוקר מומלץ לפנות לקבלת מידע נוספת.
   2. לחלבוני קרום לעבור יחידים או כפולים, ליצורשני גרסאות מסוף amino- וcarboxyl של חלבוני היתוך ^19.
   3. לחלבונים פורש רב להכניס GFP בתוך לולאות extramembrane המשוערות, כמו גם טרמיני. קח טיפול מיוחד בעת יצירת מפלצות הטרנסממברני עם חלבון היתוך הניאון הצמוד לתחנה הסופית אמינו של חלבון המטרה כרצפי אות לעתים קרובות ביקעו ידי proteolysis פעם החלבון עבר דרך translocon ER.
   4. במקרה של רצפי אות קיימים, להכניס את דיסטלי חלבון היתוך הניאון לאתר המחשוף כדי ליצור חלבון בוגר המכיל חלבון פלואורסצנטי מתויג אמינו מסוף בשלמותה. להעסיק אסטרטגיות DNA רקומביננטי סטנדרטיים עבור הדור של מפלצות ^21.
2. לקבוע את הנוכחות של אות ניאון מקומי כראוי מספיק בשורת התאים של עניין.
   1. שים לב לתאים תחת מיקרוסקופ epifluorescence באמצעות הקרינה הפנימית של ה- GFP תחת נאות,אכלתי תנאי מסנן מוגדר. למערכות סינון GFP שיקיפו 510-560 ננומטר, לאשר כי המסננים הנכונים משמשים לfluorophore המועסק.
      הערה: אות מספיק מושגת כאשר הערכה לפי העין מספקת מספיק איתות חזקה שהמבנה התאי שבתוכה האות מתגוררת הוא בקלות לפתור מעל רקע. בנוסף דפוס ההכתמה של GFP החלבון צריך להיות בקנה אחד עם זו של סמנים לאברון המתאים, ורצוי זהה לזה של החלבון לא מתויג כשפה אם.
3. לקבוע אם גישת transfection יציבה או חולפת תשמש מבוססת על נבדק החלבון.
   הערה: transfectants יציב בדרך כלל להרשות לעצמם רמות נמוכות יותר של ביטוי מאשר מערכות חולפות. למרות שביטוי חולף מניב ביטוי ברמה הגבוהה של חלבונים ועוצמת אות גידול (~ לאחר transfection 5-24 שעות בהתאם לחלבון), זה גם יכול להוביל חפצי ביטוי יתר כגון aggr חלבוןegation או הרוויה של מסלולי חלבון מיקוד, שהוביל ללוקליזציה subcellular שגויה.

2. Transfection של תאים ותרבית תאים

הערה: מגוון רחב של תאי נוחות לניתוח FPP, כולל HEK293, הלה, COS-7 ותאי CHO ^14. התיאור שלהלן מבוסס על ביטוי חלבוני קרום בתאי HEK293.

1. לגדל תאים עובריים אנושיים בכליות (HEK293) כמו monolayers חסיד ב 6 מיליליטר של שינוי Dulbecco של נשרים בינוניים (DMEM), בתוספת סרום 5% שור עוברי (FBS), 1% פירובט נתרן, ו -250 מיקרוגרם / פניצילין / סטרפטומיצין מיליליטר ב 37 מעלות C עם 5% CO _2. לבצע את כל העבודה עם תאים בתרבית רקמת מכסה המנוע זרימה למינרית. לגדל תאים במדיום התרבות עד ~ 80% ומחוברות בבקבוק T-75.
2. תאי Transfect שימוש בכל יעילות גבוהה סטנדרטית, שיטת transfection רעילות נמוכה, כולל lipid-, טכנולוגיות viral- או מבוסס electroporation ליצור transient או ביטוי יציב. בדרך כלל 2 מיקרוגרם של ה- DNA פלסמיד לכל 1 x 10 ⁶ תאים נותן ביטוי חלבון לשחזור טוב. שמור על תאים ל5-48 שעות בתקשורת ותרבות רקמות המתאימות על 37 מעלות צלזיוס בתרבית רקמת חממה מסוגלת CO _2.
3. צג תאים לביטוי של חלבון ה- GFP-ההיתוך באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence, באמצעות אותות הקרינה הפנימיים של ה- GFP, באמצעות מערכות סינון מתאימות על פי הפרוטוקול של היצרן. אות הקרינה בדרך כלל מגיעה לשיא תוך 24-72 שעות הבאות transfection. השתמש בתאים כאשר אות הקרינה מגיעה לרמה המקסימלית. לעקוב אחר רמות ביטוי חלבון על ידי ניתוח immunoblot באמצעות נוגדנים מכוונים נגד שני החלבון של עניין או מחצית GFP.
4. לתאי צלחת ניתוח ניסיוניים על coverslips המצופה. צפה גם בתצורת תאי חיים או הקיבעון הבא והר בשקופיות מיקרוסקופ. תאי צלחת להשיג 60% מפגש -80% תוך 24-48 שעות.
   1. coverslips מעיל עם פתרון poly ליזין (0.1 מ"ג / מיליליטר), כך שכל פני השטח מכוסים. דגירה למשך 30 דקות תחת אור אולטרה סגול בטמפרטורת חדר, ואחריו 60 דקות בתרבית תאי חממה ב 37 מעלות צלזיוס. הסר פולי-ליזין העודף ולשטוף coverslips ב PBS 3 פעמים.
   2. לחלופין, צלחת התאים על כיסוי זכוכית לתאים בהיקף של צלחות תרבית תאים עם תחתית זכוכית אופטית, כדי לאפשר הדמיה ישירה עם מטרות נפט טבילה. התקנת מיקרוסקופיה בפועל תלויה בציוד העומד לרשות החוקרת, אבל צריך להיות מסוגלים שינויי פתרון מהירים. בהתאם לצורת סוג התא ותא, תאים צריכים להיות בסביבות 60-90% ומחוברות בזמן assay FPP.

התקנת 3. מיקרוסקופ פלואורסצנטי

1. השתמש במטרת נפט טבילה גבוהה צמצם מספרי (NA) לאיסוף מקסימאלי אות ורזולוציה מרחבית, כגון 60x, 1.42 אובייקטיבי טבילת שמן NA. השתמש הדואר הבא לייזרים כדי לעורר את fluorophores: גז ארגון 488 ננומטר (GFP וYFP) ודיודה 561 (RFP, mCherry).
2. לקבוע את שיעור חשיפה, רווח וללכוד האופטימלי של תמונות לכל מבנה. להתאים את עוצמת לייזר וזמן חשיפה ללמזער photobleaching (ראה שלב 7.1.2).
3. ללימודים באמצעות fluorophores מרובה (לדוגמא, סמן מסיס לpermeabilization קרום בתיאום עם סמן חלבון קרום), לבחור מסנן מתאים קובע למזער אות הצטלבות ומקסם את יחסי אות לרעש.

4. קביעת תנאים אופטימליים לפלזמה ממברנה permeabilization

1. הסר את מדיום תרבית תאים מהתאים לבטא רק חלבוני ניאון מסיסים (למשל EGFP, DsRed). שוטף את התאים 3 פעמים (1 דקות כל אחד) במאגר KHM (110 אצטט אשלגן מ"מ, 3 מ"מ MgCl _2, 20 מ"מ HEPES-NaOH, pH 7.2). לבצע ניסויים עם תאים וכל חומרים כימיים בטמפרטורת חדר.
2. תאי מקום on coverslips (ראה שלב 2.4) במאגר KHM על במה מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולאסוף את התמונה הראשונה, המייצגת את שליטת שלב '-permeabilized שאינה ".
3. באופן סלקטיבי לpermeabilize קרום הפלזמה, להוסיף digitonin (30 מיקרומטר) במאגר KHM לתאים. Perfuse תאים עם חיץ (חיץ + digitonin) בשיעור של 5 מיליליטר / דקה ל10-60 שניות.
4. קבע את ריכוז digitonin האופטימלי על ידי הגדלת הריכוז של digitonin בהדרגה. ריכוז digitonin האופטימלי מושגת כאשר יש אובדן מוחלט של אותות הקרינה מEGFP המסיס בתוך 10-60 שניות של יישום digitonin. לתאים רבים יישום של 10-50 digitonin מיקרומטר מספיק כדי permeabilize קרום התא.
   1. עבור כל היישומים להשתמש בריכוז הנמוך ביותר האפשרי של digitonin. לאסוף תמונות לאחר digitonin permeabilization לאות רקע permeabilized.
5. ודא שהכימרה GFP-החלבון של עניין הוא קרום בtegrated יאשר ההחזקה סלולרית של אות הקרינה הבאה permeabilization digitonin של קרום הפלזמה ^16.
   1. הגעה חלבון פלואורסצנטי אברון ספציפי ^23. חלבוני מיטוכונדריאלי לעבוד גם בעניין זה ^16, למשל, וקטור pDsRed2-מיטו. לקבוע תנאים אופטימליים ביטוי כמתואר בשלב 2.1.
   2. ודא שריכוז digitonin מתאים לסוג התא מועסק על ידי הבטחה כי המורפולוגיה של אברונים תוך-תאיים נשארה קבועה על חשיפה (עד 60 דקות) ממושכת לdigitonin.
      הערה: פרוטוקולים השתמשו במיקרוסקופ immunofluorescence הסטנדרטי באמצעות נוגדנים נגד תאים סלולריים שונים, כגון lysosomes (למשל, LAMP1), Golgi (למשל, TGN38), reticulum endoplasmic (למשל, calnexin), endosomes (למשל, Rab5), מיטוכונדריה (למשל, ציטוכרום ג). אם שינויי מורפולוגיה / שלמות אברון תוך-התאי אובה באופן דרמטיr 60 דקות, סביר להניח שריכוז digitonin היה גבוה מדי, ודורש הפחתה בריכוז digitonin ו / או זמן חשיפה.
      הערה: digitonin הוא רעיל על ידי שאיפה ומגע עם עור. ללבוש ציוד מתאים להגנה אישית (PPE).

5. פרוטאז טיפול בחלבוני ניאון

1. לשטוף את התאים במאגר KHM ולאחר מכן להוסיף פרוטאז (K proteinase; 50 מיקרוגרם / מיליליטר במאגר KHM) ישירות על גבי התאים. Perfuse תאים בקצב זרימה של 5 מיליליטר / דקה באמצעות מערכת זלוף הכבידה מוזן ברציפות להתרחץ ההכנה.
   1. פתרונות חנות ב 50 מיליליטר מזרקים וצינורות פוליאתילן מחוברים מאגרים עצמאיים לסעפת עם שקע יחיד באמבטיה (קצב זרימה 5 מיליליטר / דקה). מקם פיפטה יניקה כדי לשמור קבוע (0.5 מיליליטר) אמבטיה נפח ולהשיג תמורת פתרון על ידי מעבר ידני בין מאגרי זלוף.
2. לאסוף תמונות כדי לקבוע אם פלואורידאות escent נמשכת או משפילה. אובדן> 90% מעוצמת האות הראשונית על 30-60 שניות עולה בקנה אחד עם השפלה מפרקי חלבונים של הכימרה GFP-החלבון (ראה תוצאות נציג).
3. אם אין השפלה אות הוא ציין עם proteinase K, כאשר אובדן כזה צפוי, להחליף את פתרון K proteinase עם טריפסין (4-8 מ"מ) במאגר KHM. אם יש צורך, לנצל תערובת של proteinase K וטריפסין. אין צורך כדי להרוות את פעילות פרוטאז.

6. גישה חלופית לפלזמת החלבונים ממברנה עם תחומים חיצוניים

1. לחלבוני קרום פלזמה, לבצע את assay למפלצות לפני digitonin permeabilization חלבוני ניאון חיצוניים. לשטוף את התאים על coverslips במאגר KHM (5 מיליליטר / דקה x 3 דקות), ולקחת את תמונה לטיפול טרום-פרוטאז ולכמת אות הקרינה מראש פרוטאז כמו בשלב 7.
2. לחשוף תאים לפרוטאז (proteinase K; 50 מיקרוגרם / מיליליטר או טריפסין 4-8 מ"מ במאגר KHM) בtהוא היעדר digitonin ידי מרוסס התאים עם פרוטאז מדיה המכילה KHM (קצב זרימה 5 מיליליטר / דקה). לאסוף תמונות של חלבון פלואורסצנטי, כדי לקבוע כמה מהר את האות נעלמת או כמה זמן נמשכת האות.
3. לפני permeabilization digitonin, להרוות את כל פעילות פרוטאז, על ידי שטיפת התאים שלוש פעמים (1 דקות כל אחד) בתקשורת ותרבות תא המכילה סרום 10% (FBS).
4. לשטוף את התאים על ידי מרוסס עם חיץ KHM (קצב זרימה של 5 מיליליטר / min) למשך 2 דקות. לרכוש תמונה שלפני permeabilization. Permeabilize קרום התא, כמתואר בשלב 4.
5. לאסוף תמונות הבאות בנוסף פרוטאז, כמתואר בשלב 5.

ניתוח 7. תמונה

1. שימוש במיקרוסקופ הפוכה מסוגל להקליט "חי תא", שבו אובדן אות הקרינה יכול להיות במעקב בזמן אמת. לניטור רציף, להעסיק פרמטרים זהים (זמן חשיפה, רווח, עוצמת לייזר, וכו ').
   1. לקבוע experפרמטרים imental על ידי התבוננות אות הקרינה מGFP-החלבון של עניין בתנאי שליטה (כלומר, KBH חיץ לבד). התאם את ההגדרות להרוויח זמן, עוצמת לייזר וחשיפה על המיקרוסקופ מונחה מחשב כדי להבטיח שאין אובדן ניכר של עוצמת אות על פני תקופה 10-20 דקות.
      הערה: עוצמת האות אינה ערך מוחלט, אלא מבוססת על מערכת מיקרוסקופ והגדרות זמינה לכל צרכן. לעקוב אחר שינויים בעוצמת הקרינה היחסית.
2. לחלופין, טיפול בתאים בזמן נקודות סט בdigitonin אחרי פרוטאז, ולתקן את התאים לפני ההרכבה על coverslips להדמיה. לקבוע נקודות זמן אמפירית בעקבות הליכים בשלבים 4 ו -5 לחקירה הראשונית, להתחיל ב 0, 30, 60, 120 ו -300 שלאחר שניות תוספת של digitonin או פרוטאז.
   1. תקן תאים (20 דקות בטמפרטורת חדר) באמצעות כמות מספקת של מקבע (paraformaldehyde 3.7% בPBS) כדי להטביע ה מלאתאי דואר.
   2. להרוות paraformaldehyde שייר על ידי שטיפת תאים עם PBS המכיל 20 מ"מ גליצין (3 x 5 דקות).
   3. coverslips ההר על ידי הסרת נוזלי עודפים מcoverslip והיפוך coverslip על גבי מדיה הרכבה 50 μl על מיקרוסקופ זכוכית שקופיות הדמיה. לאפשר שקופיות לייבוש למשך לילה לפני ההדמיה.
3. לאסוף תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (תחת המסננים המתאימים קובע תואם בשימוש fluorophore) על ידי שימוש בפונקצית לכידת תמונת וידאו במיקרוסקופ פלואורסצנטי מחשב נשלט.
4. לכמת עוצמות אות ניאון כפונקציה של מצב דגירה. השג את העצמה הממוצעת פיקסל בתוך אזור של העניין (ROI) המקיפה תא בודד.

תוצאות

פלזמה ממברנה permeabilization

permeabilization קרום פלזמה יעיל נקבע על ידי השימוש בחלבונים מסיסים ניאון (למשל, GFP, DsRed) (שלב 4). חלבונים אלה, כאשר באו לידי ביטוי בתאים, חופשיים מפוזר בcytosol, והולכים לאיבוד כאשר קרום פלזמת permeabilized באמצעות digitonin (איור 2). היעלמות מוחלטת של אות ניאון צריכה להתרחש בתוך 10-60 שניות של יישום digitonin. אישור לכך שהחלבון של עניין קשור בא...

דיון

ההתמצאות וטופולוגיה הנכונות של חלבונים בממברנה היא חיוני לתפקוד התקין שלהם. למרות החשיבות של הבנת טופולוגיה חלבון קרום, יש חלבונים רבים שעבורם נתונים כאלה חסרים לחלוטין. FPP מספק דרך קלה ויעילה לקביעת טופולוגיה חלבון קרום, ואחד שיכול להתבצע על ידי רוב המעבדות. גישת FPP מעניקה יתרונות משמעותיים על פני שיטות קודמות לקביעת טופולוגיה חלבון. לדוגמא, אין צורך להיות פנל של נוגדנים מרובים המכוונים תחומים שוב שונים של החלבון של עניין ^31. במקרים רבים פנל כזה של נוגדנים אינו זמין;...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Digitonin	Calbiochem	300410
Proteinase K	Sigma	P2308
Trypsin	Sigma	T3924
Cav1-GFP	Addgene	44433
pAcGFP-1 Golgi	Clontech	632464
פוליליזין	סיגמא	P4707
מדיית הרכבה	Dako	cS704