הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הדמיה ניגודיות בעכבר עוברים באמצעות תדר גבוהים אולטראסאונד

14.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/52520

⸱

4 במרץ 2015

 ,  ,  , 
1Department of Medical Biophysics, University of Toronto, 2Sunnybrook Research Institute, 3Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, Toronto

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להזריק סוכני אולטרסאונד ניגוד microbubble לחיים, עוברים עכברי שלב מאוחר-הריון מבודד. שיטה זו מאפשרת הלימוד של פרמטרים זלוף ושל סמנים מולקולריים של כלי דם בתוך העובר באמצעות הדמיה אולטרסאונד בתדר גבוה חומר ניגוד.

תקציר

הדמיה משופרת בניגודיות אולטרסאונד יכולה להעביר מידע כמותי חיוני לגבי כלי דם וזלוף של רקמות, וביישומים ממוקדים, להקל על איתור ומדידה של סמנים ביולוגיים של כלי הדם ברמה המולקולרית. בתוך עובר העכבר, טכניקה לא פולשנית זו עשויה לשמש כדי לחשוף מנגנונים בסיסיים העומדים בבסיס התפתחות כלי הדם במערכת הדם המוקדמת של העכבר ובמודלים גנטיים של מחלות לב וכלי דם. עובר העכבר מוצג גם כמודל מצוין לחקר הידבקות של מיקרו-בועות למטרות אנגיוגניות (כולל קולטן גורם גדילה אנדותל כלי דם 2 (VEGFR2) או αvβ3) ולהערכת האופי הכמותי של אולטרסאונד מולקולרי. לכן פיתחנו שיטה להחדרת חומרי ניגוד אולטרסאונד לכלי הדם של עוברים חיים ומבודדים. זה מאפשר חופש במונחים של בקרת הזרקה ומיקום, שחזור של מישור ההדמיה ללא חסימה ותנועה, וניתוח וכימות תמונה פשוטים. בשלב ההריון המאוחר (יום עוברי (E)16.6 ו-E17.5) בודדו עוברי עכברים מהרחם, הוצאו בעדינות משק החלמון וחומרי ניגוד מיקרו-בועות הוזרקו לוורידים הנגישים על פני השטח הכוריוני של דיסק השליה. לאחר מכן נעשה שימוש בהדמיית אולטרסאונד ניגודיות לא ליניארית כדי לאסוף מספר פרמטרים בסיסיים של זלוף (שיפור שיא, קצב שטיפה וזמן לשיא) ולכמת קשירת מיקרו-בועות ממוקדת במודל עכבר אנדוגלין. אנו מראים את המחזור המוצלח של מיקרו-בועות בתוך עוברים חיים ואת התועלת של גישה זו באפיון כלי דם עובריים והתנהגות מיקרו-בועות.

מבוא

ההדמיה אולטרסאונד contrast-enhanced עושה שימוש בחומרי ניגוד microbubble לדמיין ולאפיין את הסביבה של כלי הדם. סוכנים אלה מאפשרים הערכה לא פולשנית של זרימת הדם, כלי הדם ותפקוד לב וכלי דם. בנוסף, שינוי של פני השטח הבועה יכול לגרום microbubble ממוקד מחייב סמנים ביולוגיים אנדותל, כפי שהודגם ביישומים פרה-קליניים של אנגיוגנזה, טרשת עורקים ודלקת 1,2 עושים הדמיה אולטרסאונד מולקולרית של אירועי לב וכלי דם אפשריים. אולטרסאונד חומר ניגוד ולכן יכול לשמש כדי לזהות את הסביבות המורכבות ומגוונות המשפיעות על כלי דם בריאים ומדינות נגועות 3-5.

במספר האחרון של שנה, עניין בשירות של ההדמיה microbubble האריך למודל עובר עכבר תכליתי. כמודל להתפתחות יונקים, כניסתה של microbubbles לכלי הדם העוברי משפרת פיזיולוגית מחקר של מערכת הדם המתפתחת (זרימה למשל, דם, תפוקת לב) ובמקרים של מהונדס ומודלים של עכברים שעברו מוטציה ממוקדת של מחלות לב 6,7, עשוי להניב תובנות כיצד גנטי לשנות את תפקוד לב וכלי דם גורמים. למעשה, 2D כמותיים ואיכותי ניתוחים של כלי דם במוח עובריים כבר הושג 8. יתר על כן, את עובר העכבר מציג כמודל מצוין לבחינת המחייבת של microbubbles ממוקדת לסמני כלי דם in vivo. Bartelle et al. 9, למשל, הציג microbubbles avidin לתוך חדרי לב עובר להעריך ממוקדים מחייב בעוברים מהונדסים Biotag-בירה ולבחון האנטומיה של כלי דם. הדור של דגמי עכבר הטרוזיגוטיים והומוזיגוטים ניתן לשמש גם כתחליף ללימודי מודל גידול במטרה להגדיר את האופי הכמותי של אולטרסאונד המולקולרי - אמת מידה חשובה בתרגום בטכניקה זו למרפאת.

התחת = "jove_content"> microbubbles בתדירות הגבוהה ביותר הציג למחזור העוברי באמצעות זריקות תוך-לב לעוברי בודדים נחשפו דרך laparotomy 8-10. בזריקות ברחם, לעומת זאת, מתמודד עם מספר האתגרים. אלה כוללים הדרכת הזרקה, צורך לפעול נגד תנועה באמא ועובר exteriorized, תחזוקה של כדאיות hemodynamic באמא ועוברי exteriorized, פונים השפעות ארוכות הטווח של הרדמה וסיבוכים עקב דימום 11. לכן, המטרה של החקירה הייתה לפתח טכניקה להזרקת microbubbles לעוברי בשלב מאוחר חיים מבודדים 12. אפשרות זו מציעה יותר חופש במונחים של שליטת הזרקה ומיצוב, שחזור של מטוס ההדמיה ללא חסימה, וניתוח תמונה פשוט וכימות.

במחקר הנוכחי, אנו מתארים הליך חדשני להזרקה של microbubbles לעוברי עכבריים חיים for המטרות של לימוד התנהגות הקינטית microbubble ולימוד ממוקד microbubble מחייב סמני משטח אנדותל אנדוגני. הדמיה אולטרסאונד שאינו ליניארי ניגוד ספציפי משמשת למדידה של מספר הפרמטרים זלוף הבסיסיים כוללים שיפור שיא (PE), לשטוף-בשיעור ובזמן השיא (TTP) בעוברי E17.5 מבודדים. אנחנו גם מדגימים את תוקפו של מודל העובר להערכה כמותית של טבע אולטרסאונד המולקולרי באובדן endoglin עוברי של מודל עכבר מהונדס פונקציה, שבו endoglin הוא יעד רלוונטי מבחינה קלינית בשל הביטוי הגבוה שלה בתאי האנדותל של כלי דם באתרים של אנגיוגנזה הפעילה 13 . ההידבקות של שליטה (MB E), ממוקד endoglin אלוטיפ עכברוש IgG 2 (MB C) וmicrobubbles לא ממוקדת (MB U) מוערכת בendoglin הטרוזיגוטיים (Eng +/-) וendoglin הומוזיגוטים (Eng + / +) להביע עוברים. ניתוח של בינדי הממוקדng מגלה כי אולטרסאונד המולקולרי הוא מסוגל להבדיל בין גנוטיפים endoglin ונוגעים צפיפות קולטני לרמות אולטרסאונד מולקולריות לכימות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: הפרוצדורות שבוצעו במחקר זה אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים בSunnybrook מכון מחקר (טורונטו, אונטריו, קנדה). נהלים לטיפול ההומני לבעלי החיים חייבים להיות נצפו בכל העת. הנחה היא שהחוקר מיומן בפעולה הבסיסית של מערכת הדמיה אולטרסאונד. פרוטוקול זה עובד הכי טוב עם שני אנשים.

1. מודלים בבעלי חיים

  1. זכר CD-1 Mate ומאסכאלאס נקבה להשיג עוברי סוג בר ללימודי זלוף.
  2. לבדיקות הדמיה מולקולריות, ליצור עכברי +/- Eng ידי רקומבינציה ההומולוגית באמצעות תאי גזע עובריים של 129 המוצא / Ola כפי שתואר על ידי et al Bourdeau. 14.
    1. עכברי ההכלאה לאחור B6- +/- אנג, שנרכשו באדיבותו של ד"ר מישל Letarte, על הרקע CD-1. CD-1 +/- השימוש Eng עוברי backcrossed, כמו גם Eng + / + שיתוף littermatentrols. Mate העכברים לייצר עוברים מבוימים.

2. ניסיוני הכנה

  1. ליזום הזדווגות של עכברים ולבדוק תקעים יומיים. יום עוברי 0.5 מוגדר כבצהרים ביום תוסף נרתיק הוא ציין.
  2. הכן תקשורת עובר על ידי הוספת 50 מיליליטר של סרום שור עוברי, 5 מיליליטר של 1 M HEPES ו -5 מיליליטר של פניצילין, סטרפטומיצין (פניצילין 10,000 יחידות, 10,000 מיקרוגרם סטרפטומיצין) 500 מיליליטר הבינוני של הנשר (DMEM) עם גלוקוז גבוה שונה Dulbecco (4,500 מ"ג / L). לעטוף את הבקבוק בנייר כסף ולשמור צוננים על 4 מעלות צלזיוס.
  3. ג'ל צנטריפוגה ברור אולטרסאונד בצינורות חרוטי 50 מיליליטר ב 140 XG במשך 20 דקות. צייר ג 'עד ל -30 מיליליטר מזרקים. מלא 30 מיליליטר מזרקים עם ופר פוספט (PBS) ומניחים בצד (מסומנים) נוספים. המלטה אחת של עוברים בדרך כלל תדרוש בין 2-3 מזרקים של ג'ל אולטרסאונד ו- 4 מזרקים של PBS.
  4. משוך כ -30 מחטי זכוכית ובעדינות להדק לרצועה של פלסטלינהבצלחת תרבית תאי 100 x 20 מ"מ. הדבר מבטיח כי המחטים מופרדות ובטוחה במהלך טיפול. באמצעות חולץ זכוכית, השתמש בהגדרות הבאות על 1 x 90 מ"מ זכוכית נימים עם נימה: דוד 77, מגנט Sub 55, מגנט ראשי 70.
  5. הכן 11:50 צלחות דיסקציה (מספיק כדי להבטיח שכל עובר בהמלטה תקבל מנה משלו), באמצעות יחס של 1: 8 נפח של סוכן ריפוי לבסיס. יוצקים 40 מיליליטר של בסיס לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר. הוסף סוכן ריפוי 5-6 מ"ל ומערבבים עם מקל עץ.
    1. יוצקים לתוך 60 x 15 מנות תרבות מ"מ, מילוי כל כלמחצית. בואו O הדוכן / N להגדיר.
  6. צרף luers הנשי לחתיכות ארוכות 400 מ"מ של פוליוויניל כלוריד (PVC) צינור (קוטר פנימי: 0.79 מ"מ). צינורות חייבים להגיע ממשאבת המזרק לבמה אולטרסאונד בנוחות.

3. ניסיוני Set-up

  1. מסדרים את פלטפורמת ההדמיה תחת מיקרוסקופ הניתוחי עם מנוע 3D ומערך ליניארי 21 MHמתמר z.
    1. אוריינט הפלטפורמה, כך שרכבת הר הוא בצד השמאל, עם הבמה ממוקמת ישירות מתחת למיקרוסקופ.
    2. צרף את מנוע 3D לכדור המשותף של זרוע הארכה של הפלטפורמה. לדפוק את ההודעה השחרור מהירה של המהדק מתמר לשחרור מהיר לעלות על הרכב, פונה קדימה, ומקם את הראש מתמר במהדק, מהדק את התפס.
    3. לאבטח את המחבר מתמר בנמל הפעיל בלוח הקדמי של העגלה. הדלק את המכשיר.
  2. ליזום מתמר אולטרסאונד 21 MHz, בחירת ההגדרה 'קרדיולוגיה' לבדיקות הדמיה מולקולריות, ו'כללי 'ללימודי זלוף. להעביר את כל המחוונים בזמן עלייה-פיצוי למצב האמצעי המדויק. עבור 'מצב ניגודיות', להגדיר את הפרמטרים הבאים: התדירות: 18 MHz, לשדר עוצמה: 4%, (0.39 MPA), השוו את רווח: 30 dB, מוקדים: 6 & 10 מ"מ, השווה מצב: לא לינארית זמן פרץ,: 100% 0.1רוחב שניות, Beam: Wide.
  3. תקשורת Aliquot 40 מיליליטר עובר כל לארבעה 50 מיליליטר צינורות חרוטי. מניחים על קרח.
  4. מחממים 1 ליטר של מים בכוס 2 L על פלטה חשמלית. לשמור על 45 מעלות צלזיוס. להוסיף מזרק אחד ג'ל אולטרסאונד וPBS לכוס למחממת. לשמור על טמפרטורה זו על ידי ניטור עם מדחום בכל העת.
  5. מניח בצד 11:50 1 מיליליטר מזרקים ו11:50 21 מחטי G לזריקה של microbubbles.

4. נוהל כירורגי

הערה: יש לך עוזר להכין את הבועות (שלב 5) ואילו המנתח מתחיל את ההליך כירורגי. הפרוטוקול המתואר כאן הותאם מויטלי et al. 15

  1. לאסוף E16.5 או E17.5 עובר מנקבת העכבר בהריון הבא נקע בצוואר הרחם.
    הערה: ההשפעות של הרדמה על עוברים עדיין לא נחקרו בפירוט 16. שיטות נוספות, כוללים עריפת ראש, עשויות להיות op המתאיםמשא ולהקרבה של העכברים בהריון.
    1. גזור לפתוח את הבטן כדי לחשוף את הרחם ועוברים. בזהירות ובמהירות להסיר את הרחם על ידי חיתוך בטיפים של קרן הרחם (ניתוק כלי השחלות ורחם) וניתוק בנרתיק ובשלפוחית ​​השתן.
    2. בעזרת מלקחיים קיסם, להעביר את הרחם לצינור של 40 מיליליטר של תקשורת עובר קר כקרח מהר ככל האפשר מבלי לפגוע בעוברים. מחק את פגר העכבר.
  2. לעבור למיקרוסקופ ושלב. להפקיד את הרחם לתוך צלחת תרבית תאי 100 x 20 מ"מ. העבר את הרחם לתוך צלחת חדשה מלאות ב50 מיליליטר תקשורת עובר טרי.
  3. באמצעות מעוקר (70% תרסיס אתנול) מלקחיים עדינים, בעדינות לקרוע ולמשוך משם הקרומים החיצוניים של הרחם מתחיל בקצה אחד. לחשוף את decidua השליה, שק חלמון הקודקודית והקרום של רייכרט להפריד ולהסיר מצק החלמון הקרביים הבסיסי.
  4. לנתח את העוברים אחד אחד, שמירה על y הקרבייםשקי olk שלמים וטיפול בשליה בעדינות ככל האפשר 17. תשמור על עצמך, כדי למנוע קרע של שק החלמון כעוברים קופצים החוצה מייד.
    1. השתמש בכף המחוררת להעביר את העוברים למנה אחרת שמרה על קרח עם תקשורת עובר טרי. שמור את העוברים מקוררים עד צורך. לשנות את התקשורת בצלחת העובר כל שעה 1-1.5. בתנאים אלה הם עוברים קיימא עבור עד 4 שעות לאחר ניתוח.

5. Microbubble הכנה

הערה: בצע הדמיה מולקולרית עם אולטרסאונד בשתי microbubbles ממוקדת ולא ממוקד. ניסוי בודד יכול לדרוש כמה שרק 3 בקבוקונים נפרדים של microbubbles: microbubbles i) microbubbles נוגדן ממוקד, ii) נוגדן אלוטיפ שליטה ממוקדת וiii) microbubbles לא ממוקדת. חומר הניגוד מגיע כאבקה יבשה-הקפאה וחייב לעבור תהליך עם מי מלח לפני ההזרקה. יש ~ 2 x 10 9 microbubbles בכל microb לא ממוקדבקבוקון ubble ו~ 8.8 x 10 8 microbubbles בבקבוקונים מוכנים היעד. Microbubbles יציבה לתקופה של עד 3 שעות לאחר הכינון מחדש.

  1. כינונה מחדש של בקבוקים מוכנים יעד
    הערה: דוגמאות להכנות מוכנות יעד: microbubbles endoglin ממוקדת (MB E, עם עכברוש biotinylated MJ נוגדן 7/18 לendoglin עכבר; במתקן hybridoma בית); קולט כלי דם פקטור הגדילה של אנדותל 2 (VEGFR2) microbubbles ממוקדת (MB V, עם אנטי עכבר CD309 ביוטין); microbubbles ממוקדת נוגדני IgG שליטת 2 אלוטיפ חולדה (MB C, אלוטיפ עכברוש ביוטין IgG 2 שליטת מיקוד IgG2a עכבר).
    1. לדלל את פתרון הנוגדן (20 מיקרוגרם) לתוך 1 מיליליטר (נפח סופי) של תמיסת מלח. שמור על קרח.
    2. מלא מזרק עם מי מלח 1 מיליליטר, הסרת כל בועות האוויר. חיבור מחט G 21, להזריק את הפתרון באיטיות לתוך בקבוקון microbubble.
    3. לאט לאט למשוך את הבוכנה, הסרת 1 מיליליטר של אוויר, ולמשוך את המחט. בעדינותלהתסיס. לתת לעמוד 5 דקות על קרח.
      הערה: ניתן להשמיד microbubbles אולטראסאונד תחת סביבות בלחץ גבוה.
    4. אחרי הזמן שחלף, למלא מזרק חדש עם דילול הנוגדן ולהוסיף לבקבוקון המתאים. בעדינות להתסיס. תן לתערובת (2 עכשיו מיליליטר) לעמוד במשך 10 דקות. שמור על קרח. בהנחת נטיית משטח מלאה, מספר יגנד הכרוך הממוצע לmicrobubbles הוא כ 18 7,600 ligands / מיקרומטר 2.
  2. כינונה מחדש של בקבוקים לא ממוקדים
    1. מלא מזרק עם מי מלח 1 מיליליטר, הסרת כל בועות האוויר. חיבור מחט G 21, להזריק את הפתרון באיטיות לתוך בקבוקון microbubble.
    2. לאט לאט למשוך את הבוכנה, הסרת 1 מיליליטר של אוויר, ולמשוך את המחט. בעדינות להתסיס. בואו לעמוד 5 דקות. להוסיף מלח 1 מיליליטר נוסף, כפי שתואר לעיל. בעדינות להתסיס ולתת לעמוד 10 דקות על קרח.
  3. ספירת קולטר
    1. בעדינות להתסיס את בקבוקון microbubble הרצוי ולצייר ~50 μl של הפתרון לתוך מזרק 1 מיליליטר באמצעות מחט 21 G. להזריק את microbubbles לתוך צינור microcentrifuge 2 מיליליטר ריק.
    2. פיפטה מדגם 10 μl של פתרון מניות microbubble לתוך 10 מיליליטר של מדלל.
    3. לאחר ערבוב עדין, להעריך את הפצות ריכוז וגודל אוכלוסיית microbubble באמצעות ספירת קולטר (ראה רשימה של חומרים). רוזן מינימום של שלוש 50 מדידות μl (לדגימה בקבוקון) באמצעות צמצם 30 מיקרומטר.
  4. Microbubbles מתכוננת להזרקה
    הערה: העוזר מבצע צעד זה כאשר "הזרקה של microbubbles לעוברי" (שלב 6) החלה. כל עובר מוזרק פעם אחת, עם הסוג של microbubble נבחר לכל זריקה שנבחר באופן אקראי על ידי העוזר כך שכל סוגי microbubble מופצים באופן שווה לאורך כל ההליך אבל בהתחשב בסדר אקראי. ודא המנתח הוא עיוור לסוג של בועה שהוזרק.
    1. לקבוע הדואר נפח של פתרון בועת המניות הנדרשים כדי לייצר ריכוז סופי של 1 x 10 8 MB ​​/ מיליליטר בנפח של 400 μl (לחשב את עוצמת הקול באמצעות הריכוזים שנמדדו בבורסת 5.3.3). Aliquot הנפח המתאים של תמיסת מלח לתוך צינור microcentrifuge ריק.
    2. בעדינות להתסיס את בקבוקון microbubble נבחר ולצייר נפח עודף (~ 50 μl גדול יותר מזה שחושב לעיל) של הפתרון לתוך מזרק 1 מיליליטר באמצעות מחט 21 G. להזריק את microbubbles לתוך צינור microcentrifuge ריק.
    3. פיפטה הנפח ההכרחי של פתרון מניות microbubble ולהוסיף לaliquot של תמיסת מלח. מערבבים על ידי ערבוב בעדינות עם הקצה של פיפטה.
    4. צייר את פתרון microbubble המדולל לתוך מזרק נקי באמצעות מחט 21 G. הסרת המחט, לחסל את כל בועות אוויר מהמזרק ולצרף luer וצינורות. לאט לאט לדחוף את הפתרון לסוף עשיית צינורות בטוח שלא ליצור בועות אוויר.
    5. הכנס את syringe למשאבת עירוי מזרק מוגדר לוותר microbubbles בשיעור של 20 μl / min להיקף כולל של 20 μl. צרף מחט זכוכית משך לסוף הצינור. הזז את המשאבה הקרובה לבמה ההזרקה.

6. הזרקה של microbubbles לעוברי

  1. באופן אקראי לבחור ולהסיר (עם כף מחוררת) עובר אחד מצלחת התקשורת מצוננת. מניחים בצלחת לנתיחה ממוקמת על הבמה אולטרסאונד תחת stereoscope ולהסיר את שק החלמון וקרומים מי שפיר עם המלקחיים העדינים, חיתוך / קורע מהצד שמופיע לפחות כלי דם (צד antimesometrial). זו מושגת בקלות על ידי פירסינג אזור סמוך לאזור הראש.
    1. לחתוך מספיק כדי להסיר את העובר מבפנים, אך לא יותר. לייצב את המנות לנתיחה באמצעות חתיכות קטנות של פלסטלינה.
  2. בעדינות לתמרן את השק מסביב העובר. מקם את העובר בצד שלה, עם השליה וכלי טבור בחזית. באמצעות סיכות חרקים, להצמיד את שק החלמון (4 סיכות מומלצת) וקצוות של השליה כנדרשת כדי להדביק במקום. הימנע מכולים גדולים.
  3. לשטוף את העובר עם מראש חימם 45 ° C PBS עד העובר מחיה. זהה את וריד הטבור ורשת כלי הדם הקשורים אליו. מקם את הצלחת כך שההזרקה ניתן לעשות בנוחות.
    הערה: ברגע שחמם, דם בעובר יתחיל לזרום, בעליל שאיבה בעורק הטבור. כאשר הזרימה מתחילה ראשונה, הוורידים יהיו בצבע אדום בוהק, עם הדם בשני כלי המופיעים במהירות זהה. הסניפים הנובעים מוריד הטבור בדרך כלל כיסוי אלה מעורק הטבור על פני השטח השליה.
  4. ברגע שהעובר שהחיה, לכסות אותו (אך לא את השליה) עם ג'ל ארה"ב המחומם מראש, להיות בטוח כדי להסיר בעדינות את כל בועות אוויר (באמצעות המלקחיים העדינים) מסביב העובר. למעלה מעלה את המנה עם PBS המחומם מראש.
    הערה: שים עין על הרמה של solutiבמזרקי PBS וג'ל ולהוסיף מזרקים גיבוי לכוס החימום בהתאם לצורך.
  5. הר מחט הזכוכית על כדור גדול של פלסטלינה בקצה הצלחת לנתיחה והכנס את קצה המחט לתוך PBS. בחירת וריד על פני השטח כוריוני של דיסק השליה, כרחוק מהסניף הראשי סביר, חתוך את הקצה לגודל באמצעות מספריים. הזרקה היא הקלה ביותר אם הקצה הוא לחתוך בזווית קלה. הסר את כל קצוות משוננים של הזכוכית באמצעות הקצה של המספריים באביב.
  6. באמצעות משאבת המזרק, להזריק לאט פתרון microbubble ב 20 μl / min לתוך מחט הזכוכית עד שכל האוויר שגורש מקצה המחט וניתן לראות microbubbles לזרום בחופשיות לתוך PBS. עצור את המשאבה ולאפס עבור נפח הזרקה של 20 μl. אל תאפשר לאוויר להיכנס למערכת כלי הדם של העובר במהלך הזרקה.
  7. הכנס את קצה מחט זכוכית בעדינות לתוך אחד הוורידים בשליה ולהבטיח שהוא נייח. תחבוט stereראש oscope ומיקום מתמר מעל העובר. ליזום הדמיה.

7. אולטראסאונד הדמיה מולקולרית

הערה: שימוש בתנאי ההדמיה קוי הניגוד שנקבעו בעבר, מקם את המתמר כדי שהעובר נמצא באופן שווה בין המוקדים בשעה 6 ו 10 מ"מ. ברגע שהמיקום, להתחיל את הזרקת בולוס של microbubbles. כאשר ההזרקה היא מלאה, להפעיל את הטיימר.

  1. זלוף הדמיה
    1. ודא שהמספר המרבי של מסגרות למצב ניגוד ליניארית נבחר על ידי לחיצה על הכפתור "ניהול מחקר 'ולחיצה על הכרטיסייה' Prefs 'בחלק העליון של דפדפן המחקר. סמן את התיבה המתאימה בחלון 'העדפות'.
    2. התאם את הגדרות הדמיה על ידי ייזום הדמיה קוי. לחץ על הכפתור 'מצב ניגודיות' בלוח הבקרה. לחדד את רווח 2D על ידי התאמת הרווח & #8217; החיוג ל -30 dB, להפחית את הכח 4% באמצעות 'הכח' לחייג, להקטין את התדירות להרץ 1 באמצעות "התדר" לחייג ולהגדיר את רוחב האלומה (פינה השמאלית תחתונה) לרחב באמצעות גלגלת הכדור / העכבר.
      הערה: כל הפקדים נמצאים בלוח הבקרה של מערכת אולטרסאונד.
    3. ללכוד את כל שטיפה-ובפיזור של בולוס microbubble על ידי הקלטת cine לולאת 20 דקות בקצב פריימים של 1 הרץ. סריקה / הקפאה לחץ כדי להתחיל את רכישת נתונים.
    4. ברגע שהרצף המלא של תמונות כבר נתפס, לחץ על הכפתור 'חנות cine' ממוקם בלוח הבקרה לשמירת הרצף של תמונות במאגר המערכת. המערכת יוצרת לולאת cine-חותמת תאריך של נתוני מודל הניגוד ליניארית רכשו.
  2. ההדמיה Microbubble ממוקדת
    1. תחת 'Prefs', קבע את זמן פרץ 0.1 שניות. הגדר את הפרמטרים ההדמיה המתאימים באמצעות הפקדים described לעיל (7.1.2.).
    2. ליזום הדמיה ניגוד ליניארית על ידי לחיצה על הכפתור "מצב ניגודיות 'בלוח הבקרה. להבטיח את העובר ממוקם כראוי תחת מתמר ושזרימת חומר ניגוד microbubble של דרך את העובר נראית בתמונה מצב ניגודיות קוי.
    3. כדי להעריך microbubble ממוקד מחייב במהלך בדיקות הדמיה מולקולריות עוברית, לאפשר microbubbles לזרום באין מפריעה במשך 3 דקות ו -40 שניות לאחר השלמת ההזרקה. הפעם הוא לאפשר שמירה של microbubbles במחזור. 'הסריקה / הקפאה "לחץ כדי לעצור הדמיה בתקופה זו.
    4. בדקות 3 ו -40 שניות, הדמיה קורות חיים כדי לוודא שהעובר עדיין גלוי, מכוסה כראוי עם PBS, ושmicrobubbles תמשיך לזרום. 'הסריקה / הקפאה "לחץ כדי ליזום הדמיה.
    5. לרכוש את רצף שיבוש / חידוש שבלאחר הזרקה 3 דקות ו -50 שניות על ידי הקלטה מראש בהרס 'רצף 'tion אקוסטית תגובה ב -29 הרץ. 'הסריקה / הקפאה "כדי להתחיל ברכישת נתונים. בהודעת הזרקת 4 דקות 18,19, ליזום פרץ אקוסטי בתדירות גבוהה 0.1 שניות. לחץ על כפתור 'הפרץ "ליישם פרץ.
    6. תמשיך להקליט מסגרות לשארית הרצף (עד קו החיץ מלא) ולשמור את cine הלולאה על ידי לחיצה על "חנות cine".
    7. לאסוף cine לולאה נוספת של מחזור microbubbles. רצף זה שלאחר מכן "לאחר ההרס" הדמיה הנחה הוא להכיל אותות בועה במחזור רק שמלאו את הקורה. 'הסריקה / הקפאה "לחץ כדי ליזום הדמיה ו'חנות cine' כדי לאסוף את התמונות.
    8. תווית לולאות cine לאחר ההדמיה כל עובר. "ניהול המחקר 'לחץ, סמן את הקובץ באמצעות מכבש הכדור ו'בחר' כפתור," תווית תמונה "עיתונות ושם כראוי.

8. טיפול בעוברים לאחר הזרקה

  1. הדמיה הודעה, להעביר את המתמר, להוציא סיכת העובר ולהרדים (באמצעות עריפת ראש, נקע בצוואר הרחם, מחנק פחמן דו חמצני, או הרדמה ואחרי הקפאה או קיבעון מהיר) כרצוי.
  2. לכל זריקת עובר לאחר מכן יש להשתמש בקטע צלחת לנתיחה, מחט, מזרק וצינורות טרי, עם הכנה של המנה הבאה של מקום לקיחת פתרון הזרקת microbubble במהלך נתיחה ותחייה.
  3. להציל את דגימות רקמה (למשל, זנב, מוח) לניתוחים נוספים (למשל, גנוטיפ נקבע על ידי ניתוח PCR של DNA המבודד זנב, מכתים lacZ, או אמצעים חצי כמותית של ביטוי סמן ביולוגי באמצעות כתמים מערביים 21).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ההזרקה של חומר הניגוד אולטרסאונד לעוברי עכבר לשעבר הרחם תלויה בבידוד המוצלח של חיים, עובר שלב מאוחר של הריון מהרחם והתחזוקה של כדאיות במהלך ההזרקה וההדמיה אולטרסאונד בנושא. ברגע שהעובר כבר exteriorized ואת מיקומו, כפי שמוצג באיור 1, הזרקה זהירה של חומר ניגוד לתוך כלי הדם העובריים היא אפשרית. תמונת אולטרסאונד B-מצב אופיינית לעובר עכבר E17.5 מוצגת באיור 2 א. לשטוף בשל microbubbles ושיפור מקביל בווריד הנבוב הנחות, הלב, המוח, ובכל בעל החיים י...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הסוכנים בניגוד אולטראסאונד הוזרקו לעוברי עכבר הריון בשלב מאוחר ותמונות עם ניגודיות קוי נרכשו למדוד פרמטרים זלוף וממוקד microbubble מחייב. הדמיה מוצלחת של microbubbles בתוך כלי דם עובריים הייתה תלויה במספר גורמים, את כדאיות העובר להיות הראשונה. כל הציוד ומכשירים הוכנו מראש כדי למזער את הזמן הנדרש לבידודה של עוברים מהרחם לתחילת הזרקה. מאז את ההשפעות של חשיפה בודדת או חוזרת ונשנית להרדמה על עכברים עובריים לא נחקרו בפירוט, השימוש בהרדמה באם נמנעה לפני להקריב 16. במהלך בידוד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

פוסטר מכיר בתפקידו כיועץ ל-VisualSonics Inc.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית טרי פוקס של המכון הלאומי לסרטן של קנדה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ריאגנטים
<חזק>נוגדנים (ביוטינילציה, eBioscience) — בחירת הנוגדנים תלויה בניסוי
  • rat isotype IgG2 control
eBioscience13-4321-85שילוב זה של נוגדנים/מיקרו-בועות נדרש לעתים קרובות כבקרה ניסיונית 
  • biotin anti-mouse CD309
eBioscience13-5821-85
נוגדן ביוטינילציה של חולדה MJ 7/18 לאנדוגלין עכברבהיברידומהנוגדנים חיצוניים עשויים להיות גם מתאימים: השתמשנו בעבר ב-eBioscience (13-1051-85) במים
<חזק>מדיה עוברית
  • 500 מ"ל Dulbecco' s Modified Eagle' s בינוני עם גלוקוז גבוה
SigmaD5796
  • 50 מ"ל סרום בקר עוברי
ATCC30-2020פריט # 7592456
  • Hepes
Gibco156305 מ"ל, 1 M
  • Penicillin-Streptomycin
Gibco15140-1225 מ"ל, 10,000 יחידות Pen., 10,000 μ גרם סטרפטוקוס
אתנול, 70%
קרח
פרפורמלדהידסיגמא762404%
פוספט בופר מלח [1x] SigmaD85371x, ללא סידן כלורי ומגנזיום כלוריד
עכבר בהריון, CD-1Charles River Laboratories Inc. 
0.9% נתרן כלורי (מי מלח)Hospira0409-7984-11
חומר ניגוד אולטרסאונד, MicroMarker מוכן למטרה ולא ממוקד; ויז'ואלסוניקס בע"מ
ג'ל אולטרסאונד (Aquasonic 100, חסר צבע)CSP Medical133-1009
<חזק>ציוד
צלחות תרבית תאים חזקות (4):   100  x  20  מ"מפישר סיינטיפיק08-772-22
צלחות תרבית תאים (12) : 60  x  15  מ"מSigmaD8054
צנטריפוגהSorvall Legend RT צנטריפוגה 
צינורות חרוטיים, 50 מ"ל BD FalconVWR21008-938
מדללבקמן קולטראיזוטון II מדלל,
(וגנר)כלי מדע עדיניםWagner 14068-12
מלקחיים (2), Dumont SS (0.10 x 0.06 מ"מ)Fine Science Tools11200-33
מלקחיים, רסיסVWR25601-134
זכוכית, 2 ליטר (גריפין)VWR89000-216
נימי זכוכית, 1 x 90  מ"מ GD-1 עם נימהNarishigeGD-1
חולץ מחט זכוכיתNarishigePN-30
כפפותAnsell4002
בדיקת אנטומיה ברוטוFine Science Tools10088-15
פלטה חמהVWR89090-994
דלי קרחקול פארמרRK 06274-01
הדמיה פלטפורמה:VisualSonics Inc.מסילה משולבת
מקור אור, סיבים אופטייםפישר סיינטיפיק12-562-36באופן אידיאלי יש זרועות מתכווננות
לורס (12), פוליפרופילן דוקרני נקבה ¼-28 חוט UNFקול פארמר45500-30
מערכת מיקרו-אולטרסאונד, תדר גבוהVisualSonics Inc.מחטי Vevo2100
מד 21  (1 אינץ')מנתח גודל חלקיקים VWR305165
בקמן קולטרMultisizer 3 כף מחוררת נגד
(מוריה)כלי מדע עדיניםMC 17 10373-17
פינים (6), מינוטיין אנודייז שחור 0.15 מ"מFine Science Tools26002-15
פיפטורים [2-20 & #956; l, 20-200 μ l, 100-1,000 μ l]EppendorfResearch Plus  3120000038 מתכוונן;             3120000054;            
3120000062 טיפים לפיפטורים [2-200  μ l, 50-1,000  μ l]EppendorfepT.I.P.S.                                    22491334;                        
022491351 מספריים
Sylgard 184 ערכת אלסטומר סיליקוןצינורות דאו קורנינג
, מעבדת טיגון 1/32 אינץ' x 3/32 אינץ'VWR63010-007
מקל מוליך עץ (ספוגית, ראש כותנה)VWRCA89031-270
מיקרוסקופ כירורגי 5-8 הגדלה פישרסיינטיפיקסטרומאסטר
, 1 מ"ל מזרקי NormjectFisher14-817-25
(10), 30 מ"לVWRCA64000-041
משאבת עירוי מזרק ביו-לינקס מדחום NE-1000
, -20-110  ° CVWR89095-598
טיימרVWR33501-418
צינורות, EppendorfVWR20170-577
מתלי צינורות (3)VWR82024-462
מתמר אולטרסאונד, 20 מגה-הרץVisualSonics Inc.MS250
Vannas-Tubingen, זווית כלפי מעלהכלי מדע עדינים15005-08
ביתית מזוקקים מספריים לדיסקציה 8448011 מערכת , קולטר

מקורות

  1. Voigt, J. U. Ultrasound molecular imaging. Methods. 48 (2), 92-97 (2009).
  2. Klibanov, A. Preparation of targeted microbubbles: Ultrasound contrast agents for molecular imaging. Medical Biological Engineering Computing. 47 (8), 875-882 (2009).
  3. Cosgrove, D., Lassau, N. Imaging of perfusion using ultrasound. European Journal Of Nuclear Medicine And Molecular Imaging. 37 (S1), 65(2010).
  4. Williams, R., et al. Dynamic microbubble contrast-enhanced US to measure tumor response to targeted therapy: A proposed clinical protocol with results from renal cell carcinoma patients receiving antiangiogenic therapy. Radiology. 260 (2), 581(2011).
  5. Burns, P. N., Wilson, S. R. Focal liver masses: Enhancement patterns on contrast-enhanced Images - Concordance of US scans with CT scans and MR images. Radiology. 242 (1), 162(2006).
  6. Phoon, C. K. L., Aristizabal, O., Turnbull, D. H. 40 MHz doppler characterization of umbilical and dorsal aortic Blood flow in the early mouse embryo. Ultrasound. In Medicine And Biology. 26 (8), 1275-1283 (2000).
  7. Phoon, C. K. L., Aristizabal, O., Turnbull, D. H. Spatial velocity profile in mouse embryonic aorta and doppler-derived volumetric flow: A preliminary model. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283, H908-H916 (2002).
  8. Aristizábal, O., Williamson, R., Turnbull, D. H. 12A-4 in vivo 3D contrast-enhanced imaging of the embryonic mouse vasculature. Paper presented at Ultrasonics Symposium. , IEEE. New York, NY. (2007).
  9. Bartelle, B. B., et al. Novel genetic approach for in vivo vascular imaging in mice. Circ.Res. 110 (7), 938-947 (2012).
  10. Endoh, M., et al. Fetal gene transfer by intrauterine injection with microbubble-enhanced ultrasound. Molecular Therapy. 5 (5), 501-508 (2002).
  11. Yamada, M., Hatta, T., Otani, H. Mouse exo utero development system: Protocol and troubleshooting. Congenital Anomalies. 48 (4), 183-187 (2008).
  12. Denbeigh, J. M., Nixon, B. A., Hudson, J. M., Purin, M. C., Foster, F. S. VEGFR2-targeted molecular imaging in the mouse embryo: An alternative to the tumor model. Ultrasound in medicine and biology. 40 (2), 389-399 (2014).
  13. Paauwe, M., Dijke, ten, P,, Hawinkels, L. J. A. C. Endoglin for tumor imaging and targeted cancer therapy. Expert Opinion On Therapeutic Targets. 17 (4), 421-435 (2013).
  14. Bourdeau, A., Faughnan, M. E., Letarte, M. Endoglin-deficient mice, a unique model to study hereditary hemorrhagic telangiectasia. Trends Cardiovasc. Med. 10 (7), 279-285 (2000).
  15. Whiteley, K. J., Adamson, S. L., Pfarrer, C. D. Vascular corrosion casting of the uteroplacental and fetoplacental vasculature in mice. Placenta And Trophoblast: Methods And Protocols. 121 (121), Humana Press. Totowa, NJ. 371-392 (2006).
  16. Kulandavelu, S., et al. Embryonic and neonatal phenotyping of genetically engineered mice. ILAR Journal. 47 (2), 103-10 (2006).
  17. Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. Journal of Visualized Experiments. 85, (2014).
  18. Willmann, J. K., et al. Targeted contrast-enhanced ultrasound imaging of tumor angiogenesis with contrast microbubbles conjugated to integrin-binding knottin peptides. The Journal of Nuclear Medicine. 51 (3), 433-440 (2010).
  19. Deshpande, N., Ren, Y., Foygel, K., Rosenberg, J., Willmann, J. K. Tumor angiogenic marker expression levels during tumor growth: Longitudinal assessment with molecularly targeted microbubbles and US imaging. Radiology. 258 (3), 804-811 (2011).
  20. Lyshchik, A., et al. Molecular imaging of vascular endothelial growth factor receptor 2 expression using targeted contrast-enhanced high-frequency ultrasonography. Journal Of Ultrasound In Medicine. 26 (11), 1575-1586 (2007).
  21. Jerkic, M., et al. Endoglin regulates nitric oxide-dependent vasodilatation. The FASEB Journal. 18 (3), 609-611 (2004).
  22. Denbeigh, J. M., Nixon, B. A., Lee, J. J. Y., et al. Contrast-Enhanced Molecular Ultrasound Differentiates Endoglin Genotypes in Mouse Embryos. , Angiogenesis. Press. (2014).
  23. Adamson, S. L., Lu, Y., Whiteley, K. J., et al. Interactions between trophoblast cells and the maternal and fetal circulation in the mouse placenta. Dev Biol. 250, 358-35 (2002).
  24. Needles, A., et al. Nonlinear contrast imaging with an array-based micro-ultrasound system. Ultrasound. Medicine Biology. 36 (12), 2097(2010).
  25. Watson, E. D., Cross, J. C. Development of structures and transport functions in the mouse placenta. Physiology. 20 (3), 180-193 (2005).
  26. Shalaby, F., Rossant, J., Yamaguchi, T. P., et al. Failure of blood-island formation and vasculogenesis in Flk-1-deficient mice. Nature. 376, 62-66 (1995).
  27. Kwee, L., Baldwin, H. S., Shen, H. M., et al. Defective development of the embryonic and extraembryonic circulatory systems in vascular cell adhesion molecule (VCAM-1) deficient mice. Development. 121, (1995).
  28. Mercurio, A. M. Lessons from the α2 integrin knockout mouse. The American journal of pathology. , 161-163 (2002).
  29. Hodivala-Dilke, K. αvβ3 integrin and angiogenesis: a moody integrin in a changing environment. Curr Opin Cell Biol. 20, 514-519 (2008).
  30. Pysz, M. A., Gambhir, S. S., Willmann, J. K. Molecular imaging: current status and emerging strategies. Clinical radiology. 65, 500-516 (2010).
  31. Cybulsky, M. I., Iiyama, K., Li, H., et al. A major role for VCAM-1, but not ICAM-1, in early atherosclerosis. J Clin Invest. 107, 1255-1262 (2001).
  32. Xu, H., Gonzalo, J. A., St Pierre,, Y,, et al. Leukocytosis and resistance to septic shock in intercellular adhesion molecule 1-deficient mice. J Exp Med. 180, 95-109 (1994).
  33. Gerwin, N., Gonzalo, J. A., Lloyd, C., et al. Prolonged eosinophil accumulation in allergic lung interstitium of ICAM-2-deficient mice results in extended hyperresponsiveness. Immunity. 10, 9-19 (1999).
  34. Johnson, R. C., Mayadas, T. N., Frenette, P. S., et al. Blood cell dynamics in P-selectin-deficient mice. Blood. 86, 1106-1114 (1995).
  35. Corrigan, N., Brazil, D., McAuliffe, F. High-frequency ultrasound assessment of the murine heart from embryo through to juvenile. Reproductive Sciences. 17 (2), 147-14 (2010).
  36. Turnbull, D. H., Bloomfield, T. S., Baldwin, H. S., Foster, F. S., Joyner, A. L. Ultrasound backscatter microscope analysis of early mouse embryonic brain development. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 2239-2243 (1995).
  37. Greco, A., Mancini, M. L., Gargiulo, S., et al. Ultrasound Biomicroscopy in Small Animal Research: Applications in Molecular and Preclinical Imaging. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, (2012).
  38. Pysz, M. A., Guracar, I., Foygel, K., Tian, L., Willmann, J. K. Quantitative assessment of tumor angiogenesis using real-time motion-compensated contrast-enhanced ultrasound imaging. Angiogenesis. 15, 433-442 (2012).
  39. Larina, I. V., et al. Live imaging of blood flow in mammalian embryos using doppler swept-source optical coherence tomography. J.Biomed.Opt. 13 (6), 060506-06 (2008).
  40. Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Live imaging of mouse embryos. 4 (4), Cold Spring Harbor. 104-10 (2011).
  41. Teichert, A., et al. Endothelial nitric oxide synthase gene expression during murine embryogenesis. Commencement of expression in the embryo occurs with the establishment of a unidirectional circulatory system. Circulation Research. 103 (1), 24-33 (2008).
  42. Walls, J. R., Coultas, L., Rossant, J., Henkelman, R. M. Three-dimensional analysis of vascular development in the mouse embryo. PLoS One. 3 (8), (2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Endoglin
הדמיה ניגודיות בעכבר עוברים באמצעות תדר גבוהים אולטראסאונד
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.