כאן, אנו מציגים פרוטוקול להזריק סוכני אולטרסאונד ניגוד microbubble לחיים, עוברים עכברי שלב מאוחר-הריון מבודד. שיטה זו מאפשרת הלימוד של פרמטרים זלוף ושל סמנים מולקולריים של כלי דם בתוך העובר באמצעות הדמיה אולטרסאונד בתדר גבוה חומר ניגוד.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הדמיה ניגודיות בעכבר עוברים באמצעות תדר גבוהים אולטראסאונד
במאמר זה
סיכום
תקציר
הדמיה משופרת בניגודיות אולטרסאונד יכולה להעביר מידע כמותי חיוני לגבי כלי דם וזלוף של רקמות, וביישומים ממוקדים, להקל על איתור ומדידה של סמנים ביולוגיים של כלי הדם ברמה המולקולרית. בתוך עובר העכבר, טכניקה לא פולשנית זו עשויה לשמש כדי לחשוף מנגנונים בסיסיים העומדים בבסיס התפתחות כלי הדם במערכת הדם המוקדמת של העכבר ובמודלים גנטיים של מחלות לב וכלי דם. עובר העכבר מוצג גם כמודל מצוין לחקר הידבקות של מיקרו-בועות למטרות אנגיוגניות (כולל קולטן גורם גדילה אנדותל כלי דם 2 (VEGFR2) או αvβ3) ולהערכת האופי הכמותי של אולטרסאונד מולקולרי. לכן פיתחנו שיטה להחדרת חומרי ניגוד אולטרסאונד לכלי הדם של עוברים חיים ומבודדים. זה מאפשר חופש במונחים של בקרת הזרקה ומיקום, שחזור של מישור ההדמיה ללא חסימה ותנועה, וניתוח וכימות תמונה פשוטים. בשלב ההריון המאוחר (יום עוברי (E)16.6 ו-E17.5) בודדו עוברי עכברים מהרחם, הוצאו בעדינות משק החלמון וחומרי ניגוד מיקרו-בועות הוזרקו לוורידים הנגישים על פני השטח הכוריוני של דיסק השליה. לאחר מכן נעשה שימוש בהדמיית אולטרסאונד ניגודיות לא ליניארית כדי לאסוף מספר פרמטרים בסיסיים של זלוף (שיפור שיא, קצב שטיפה וזמן לשיא) ולכמת קשירת מיקרו-בועות ממוקדת במודל עכבר אנדוגלין. אנו מראים את המחזור המוצלח של מיקרו-בועות בתוך עוברים חיים ואת התועלת של גישה זו באפיון כלי דם עובריים והתנהגות מיקרו-בועות.
מבוא
ההדמיה אולטרסאונד contrast-enhanced עושה שימוש בחומרי ניגוד microbubble לדמיין ולאפיין את הסביבה של כלי הדם. סוכנים אלה מאפשרים הערכה לא פולשנית של זרימת הדם, כלי הדם ותפקוד לב וכלי דם. בנוסף, שינוי של פני השטח הבועה יכול לגרום microbubble ממוקד מחייב סמנים ביולוגיים אנדותל, כפי שהודגם ביישומים פרה-קליניים של אנגיוגנזה, טרשת עורקים ודלקת 1,2 עושים הדמיה אולטרסאונד מולקולרית של אירועי לב וכלי דם אפשריים. אולטרסאונד חומר ניגוד ולכן יכול לשמש כדי לזהות את הסביבות המורכבות ומגוונות המשפיעות על כלי דם בריאים ומדינות נגועות 3-5.
במספר האחרון של....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: הפרוצדורות שבוצעו במחקר זה אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים בSunnybrook מכון מחקר (טורונטו, אונטריו, קנדה). נהלים לטיפול ההומני לבעלי החיים חייבים להיות נצפו בכל העת. הנחה היא שהחוקר מיומן בפעולה הבסיסית של מערכת הדמיה אולטרסאונד. פרוטוקול זה עובד הכי טוב עם שני אנשים.
1. מודלים בבעלי חיים
- זכר CD-1 Mate ומאסכאלאס נקבה להשיג עוברי סוג בר ללימודי זלוף.
- לבדיקות הדמיה מולקולריות, ליצור עכברי +/- Eng ידי רקומ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
ההזרקה של חומר הניגוד אולטרסאונד לעוברי עכבר לשעבר הרחם תלויה בבידוד המוצלח של חיים, עובר שלב מאוחר של הריון מהרחם והתחזוקה של כדאיות במהלך ההזרקה וההדמיה אולטרסאונד בנושא. ברגע שהעובר כבר exteriorized ואת מיקומו, כפי שמוצג באיור 1, הזרקה זהירה של חומר ניגוד לתוך כלי הדם העובריים היא אפשרית. תמונת אולטרסאונד B-מצב אופיינית לעובר עכבר E17.5 מוצגת באיור 2 א. לשטוף בשל microbubbles ושיפור מקביל בווריד הנבוב הנחות, הלב, המוח, ובכל בעל החיים י.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הסוכנים בניגוד אולטראסאונד הוזרקו לעוברי עכבר הריון בשלב מאוחר ותמונות עם ניגודיות קוי נרכשו למדוד פרמטרים זלוף וממוקד microbubble מחייב. הדמיה מוצלחת של microbubbles בתוך כלי דם עובריים הייתה תלויה במספר גורמים, את כדאיות העובר להיות הראשונה. כל הציוד ומכשירים הוכנו מראש כדי למזער את הזמן הנדרש לבידודה של עוברים מהרחם לתחילת הזרקה. מאז את ההשפעות של חשיפה בודדת או חוזרת ונשנית להרדמה על עכברים עובריים לא נחקרו בפירוט, השימוש בהרדמה באם נמנעה לפני להקריב 16. במהלך בידוד.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
פוסטר מכיר בתפקידו כיועץ ל-VisualSonics Inc.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית טרי פוקס של המכון הלאומי לסרטן של קנדה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>ריאגנטים | |||
| <חזק>נוגדנים (ביוטינילציה, eBioscience) — בחירת הנוגדנים תלויה בניסוי | |||
| eBioscience | 13-4321-85 | שילוב זה של נוגדנים/מיקרו-בועות נדרש לעתים קרובות כבקרה ניסיונית |
| eBioscience | 13-5821-85 | |
| נוגדן ביוטינילציה של חולדה MJ 7/18 לאנדוגלין עכבר | בהיברידומה | נוגדנים חיצוניים עשויים להיות גם מתאימים: השתמשנו בעבר ב-eBioscience (13-1051-85) במים | |
| <חזק>מדיה עוברית | |||
| Sigma | D5796 | |
| ATCC | 30-2020 | פריט # 7592456 |
| Gibco | 15630 | 5 מ"ל, 1 M |
| Gibco | 15140-122 | 5 מ"ל, 10,000 יחידות Pen., 10,000 μ גרם סטרפטוקוס |
| אתנול, 70% | |||
| קרח | |||
| פרפורמלדהיד | סיגמא | 76240 | 4% |
| פוספט בופר מלח [1x] | Sigma | D8537 | 1x, ללא סידן כלורי ומגנזיום כלוריד |
| עכבר בהריון, CD-1 | Charles River Laboratories Inc. | ||
| 0.9% נתרן כלורי (מי מלח) | Hospira | 0409-7984-11 | |
| חומר ניגוד אולטרסאונד, MicroMarker מוכן למטרה ולא ממוקד | ; ויז'ואלסוניקס בע"מ | ||
| ג'ל אולטרסאונד (Aquasonic 100, חסר צבע) | CSP Medical | 133-1009 | |
| <חזק>ציוד | |||
| צלחות תרבית תאים חזקות (4): 100 x 20 מ"מ | פישר סיינטיפיק | 08-772-22 | |
| צלחות תרבית תאים (12) : 60 x 15 מ"מ | Sigma | D8054 | |
| צנטריפוגה | Sorvall Legend RT צנטריפוגה | ||
| צינורות חרוטיים, 50 מ"ל BD Falcon | VWR | 21008-938 | |
| מדלל | בקמן קולטר | איזוטון II מדלל, | |
| (וגנר) | כלי מדע עדינים | Wagner 14068-12 | |
| מלקחיים (2), Dumont SS (0.10 x 0.06 מ"מ) | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| מלקחיים, רסיס | VWR | 25601-134 | |
| זכוכית, 2 ליטר (גריפין)VWR | 89000-216 | ||
| נימי זכוכית, 1 x 90 מ"מ GD-1 עם נימה | Narishige | GD-1 | |
| חולץ מחט זכוכית | Narishige | PN-30 | |
| כפפות | Ansell | 4002 | |
| בדיקת אנטומיה ברוטו | Fine Science Tools | 10088-15 | |
| פלטה חמה | VWR | 89090-994 | |
| דלי קרח | קול פארמר | RK 06274-01 | |
| הדמיה פלטפורמה: | VisualSonics Inc. | מסילה משולבת | |
| מקור אור, סיבים אופטיים | פישר סיינטיפיק | 12-562-36 | באופן אידיאלי יש זרועות מתכווננות |
| לורס (12), פוליפרופילן דוקרני נקבה ¼-28 חוט UNF | קול פארמר | 45500-30 | |
| מערכת מיקרו-אולטרסאונד, תדר גבוה | VisualSonics Inc. | מחטי Vevo2100 | |
| מד 21 (1 אינץ') | מנתח גודל חלקיקים VWR | 305165 | |
| בקמן קולטר | Multisizer 3 כף מחוררת נגד | ||
| (מוריה) | כלי מדע עדינים | MC 17 10373-17 | |
| פינים (6), מינוטיין אנודייז שחור 0.15 מ"מ | Fine Science Tools | 26002-15 | |
| פיפטורים [2-20 & #956; l, 20-200 μ l, 100-1,000 μ l] | Eppendorf | Research Plus 3120000038 מתכוונן; 3120000054; | |
| 3120000062 טיפים לפיפטורים [2-200 μ l, 50-1,000 μ l] | Eppendorf | epT.I.P.S. 22491334; | |
| 022491351 מספריים | |||
| Sylgard 184 ערכת אלסטומר סיליקון | צינורות דאו קורנינג | ||
| , מעבדת טיגון 1/32 אינץ' x 3/32 אינץ' | VWR | 63010-007 | |
| מקל מוליך עץ (ספוגית, ראש כותנה) | VWR | CA89031-270 | |
| מיקרוסקופ כירורגי 5-8 הגדלה פישר | סיינטיפיק | סטרומאסטר | |
| , 1 מ"ל מזרקי Normject | Fisher | 14-817-25 | |
| (10), 30 מ"ל | VWR | CA64000-041 | |
| משאבת עירוי מזרק | ביו-לינקס | מדחום NE-1000 | |
| , -20-110 ° C | VWR | 89095-598 | |
| טיימר | VWR | 33501-418 | |
| צינורות, Eppendorf | VWR | 20170-577 | |
| מתלי צינורות (3) | VWR | 82024-462 | |
| מתמר אולטרסאונד, 20 מגה-הרץ | VisualSonics Inc. | MS250 | |
| Vannas-Tubingen, זווית כלפי מעלה | כלי מדע עדינים | 15005-08 | |
מקורות
- Voigt, J. U. Ultrasound molecular imaging. Methods. 48 (2), 92-97 (2009).
- Klibanov, A. Preparation of targeted microbubbles: Ultrasound contrast agents for molecular imaging. Medical Biological Engineering Computing. 47 (8), 875-882 (2009).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
