אינדוקציה של Murine דלקת מעיים על ידי העברת המאמצת של מפעיל CD4 + CD45RB גבוה תאי T לעכברי immunodeficient

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להשראת דלקת במעי הגס בעכברים על ידי העברה מאמצת של תאי T^גבוהים CD4⁺CD45RB סינגניים לנמענים חסרי תאי T ו-B. מאפיינים קליניים והיסטופתולוגיים מחקים מחלות מעי דלקתיות אנושיות. שיטה זו מאפשרת לחקור את התחלת דלקת המעי הגס והתקדמות המחלה.

תקציר

יש מודלים של בעלי חיים רבים ושונים זמינים ללימוד פתוגנזה של מחלות בבני אדם מעי דלקתיות (IBD), כל אחד עם יתרונות משלה וחסרונות. אנו מתארים כאן מודל קוליטיס ניסיוני שהוא ביוזמת העברת מאמצת של תאי טחול syngeneic CD4 ⁺ T CD45RB ^הגבוה לעכברי נמען חסרי T ו- B תא. אוכלוסיית תאי T מסוג CD4 ^{+ הגבוה} CD45RB שמורכבת בעיקר של תאי מפעיל נאיביים היא מסוגלת גרימת דלקת מעיים כרונית, דומה מאוד להיבטים מרכזיים של IBD האנושי. שיטה זו ניתן להשפיע ללמוד היבטים של תחילת מחלה והתקדמות. בנוסף ניתן להשתמש בו כדי ללמוד את הפונקציה של מולדת, מסתגל, ואוכלוסיות תאים חיסוני רגולציה, ואת התפקיד של חשיפות סביבתיות, כלומר, החיידקים, בדלקת מעיים. במאמר זה אנו מדגימים את המתודולוגיה לגרימת דלקת המעי הגס עם פרוטוקול צעד-אחר-צעד. inc זהלרכב וידאו הדגמה של היבטים טכניים מפתח נדרשו לפתח מודל העכברי של קוליטיס הניסיוני למטרות מחקר בהצלחה.

מבוא

מחלות המעי הדלקתיות (IBD) מחלת קרוהן וקוליטיס כיבית נובעות מאינטראקציה לא מוגדרת ומורכבת בין תגובות חיסוניות של המארח, רגישות גנטית, גורמים סביבתיים ותכולת הלומינל המעי¹. מחקרי אסוציאציה אחרונים ברחבי הגנום מדווחים על קשרים בין גנים מווסתים של תאי חיסון ורגישות ל-IBD^2,3. גנים פנימיים של תאי חיסון מולדים ונרכשים מיוצגים במחקרים אלה, מה שמצביע על תפקיד מרכזי לאוכלוסיות תאים אלה בפתוגנזה של IBD.

קיימים כיום יותר מ-50 מודלים של בעלי חיים של IBD אנושי. בעוד שאין מודל אחד של פנוקופיה מושלמת של מחלות מעי דלקתיות אנושיות, רבים מהם שימושיים לחקר היבטים שונים של מחלות אנושיות, כולל הופעת המחלה והתקדמותה ותגובת ריפוי הפצעים. בשיטה המתוארת כאן, דלקת מעיים מתחילה עם העברה מאמצת של תאי T^גבוהים CD4⁺CD45RB של טחול סינגני לעכברים נמענים חסרי תאי T ו-B⁴. אוכלוסיית תאי ה-T^{הגבוהים CD4+}CD45RB מכילה בעיקר תאי T נאיביים המוכנים להפעלה המסוגלים לגרום לדלקת כרונית במעי הדק ובמעי הגס. שיטה זו מאפשרת לחוקר לשנות משתני ניסוי מרכזיים, כולל אוכלוסיות תאי חיסון מולדים ונרכשים, כדי לענות על שאלות רלוונטיות מבחינה ביולוגית הנוגעות לפתוגנזה של מחלה. בנוסף, שיטה זו מספקת התחלה מדויקת של הופעת המחלה ומהלך זמן ניסיוני מאופיין היטב. זה מאפשר מחקר קינטי של מאפיינים קליניים של התקדמות מחלה בעכברים. דלקת מעיים הנגרמת על ידי שיטה זו חולקת מאפיינים רבים עם IBD אנושי, כולל דלקת כרונית במעי הגס והדק, פתוגנזה המונעת על ידי ציטוקינים כגון TNF ו-IL-12, ותסמינים מערכתיים כגון אובדן⁵. לפיכך, זוהי מערכת מודל אידיאלית לחקר הפתוגנזה של IBD אנושי.

השיטה כאן מתארת בפירוט את הפרוטוקול להשראת קוליטיס ניסיונית על ידי העברה מאמצת של תאי T^גבוהים CD4⁺CD45RB לעכברי Rag1^-/-. אנו דנים בשלבים טכניים מרכזיים, תוצאות צפויות, אופטימיזציה ופתרון בעיות. אנו מתייחסים לאלמנטים הנדרשים לפיתוח מוצלח של מודל עכברי זה של דלקת מעיים למטרות מחקר.

פרוטוקול

הערה: ודא שכל הפרוטוקולים של בעלי החיים שאושרו על ידי ובעמידה בבעלי חיים מוסדי טיפול ושימוש ועדת תקנות (IACUC) והמדריך של המועצה הלאומית למחקר לטיפול והשימוש בחי מעבדה. עכברי תורם יכולים להיות זכר או נקבה, אבל עכברי נמען צריכים להיות גבר. אם המקבלים נשיים הם לשמש, עכברי התורם חייבים להיות נקבה ^5. לשמור על מושבות משתמשים במצעים רגילים, שאינם סטרילי ומים acidified עישון, כמו אלה עלולים להשפיע על חיידקי מעיים, ו, ובכך, את הפנוטיפ קוליטיס של העכברים ^5,6.

1. ניסיוני הכנה

1. להשתמש במדיה קרים כקרח ומאגרים. שמור את התאים על קרח לאורך כל הניסוי.
2. לבצע את הניסוי במכסת מנוע Biohazard סטרילי באמצעות טכניקה סטרילית.

2. בידוד של תאי הטחול T

1. להרדים עכבר תורם / עכברים בתא CO ₂ ואחריו dislocatio צוואר הרחםn. תרסיס בטן עם אתנול 70%.
2. לעשות חתך אופקי בבטן ולקלף את העור לחשוף הצפק. החזק הצפק מהאיברים הפנימיים עם המלקחיים ולעשות חתך בבטן השמאלי הצפק לחשוף ולהסיר את הטחול.
3. מניחים את הטחול ב 10 מיליליטר של מדיה מלאה בצלחת פטרי. להסיר ולסלק רקמה עודפת מטחול.
4. השתמש 2 שקופיות זכוכית מעוקרות למחוץ ולהפריד טחול להשעית תא בודד. תא מסנן השעיה דרך מסננת 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל ולשטוף מסננת עם 5 מיליליטר של מדיה מלאה. הנח עד 5 טחולים בצינור אחד 50 מיליליטר חרוטי.
5. תאי צנטריפוגה ב 450 XG במשך 7 דקות. בטל supernatant על ידי שפיכה כבויה או על ידי שאיבת אבק למכל פסולת.
6. בעדינות resuspend תאים ב5 מיליליטר לטחול של תמוגה הצפת לlyse תאי דם אדומים במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר. הוסף נפח שווה של מדיה מלאה (5 מיליליטר לטחול) לצינור.
8. בעדינות resuspend תאים ב 10 מיליליטר של תיוג הצפת.
9. ספירת תאים על ידי הרחקה הכחולה trypan.
   1. הסר 20 μl של השעיה תא ולהוסיף לtrypan כחול 180 μl לצינור microfuge ומערבבים היטב. אחרי 5 דקות, להוסיף 10 μl שכותרתו תאים לhemocytometer ולספור תאים שאינם כחולים-מתחת למיקרוסקופ. לקבוע את מספר כולל של תאי קיימא. מחק תא / trypan תערובת כחולה.
10. תאי צנטריפוגה ב 10 מיליליטר של תיוג הצפת ב 450 XG במשך 7 דקות. בטל supernatant על ידי שפיכה כבויה או על ידי שאיבת אבק למכל פסולת.

3. העשרה של תאי CD4 ⁺ T

הערה: בצע את ההוראות של היצרן למוצרים ספציפיים בשימוש בסעיף זה.

1. בעדינות resuspend תאים להשעית תא בודד של 20 x 10 ⁶ תאים / מיליליטר בתווית קרהing מאגר.
2. הוסף 5 μl לכל 1 x 10 ⁶ תאים של נוגדני העשרת תאי CD4 T biotinylated. דגירה תאים על קרח במשך 15 דקות.
3. להוסיף 10x נפח של תיוג הצפת. תאי צנטריפוגה בg × 450 במשך 7 דקות. בזהירות לשאוב את כל supernatant באמצעות שאיבת ואקום למכל פסולת.
4. ביסודיות מערבולת חלקיקים מגנטיים streptavidin מצומדות. הוסף 5 μl של חלקיקים לכל 1 x 10 ⁶ תאים.
5. מערבבים היטב אך בעדינות. שמור תערובת ב6-12 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
6. הוספת תיוג הצפת לריכוז של 20-80 x 10 ⁶ תאים / מיליליטר. להעביר עד 1.0 מיליליטר שכותרתו תאים לכל 12 x 75 מ"מ מבחנה מסביב לתחתית (המכונה "הצינור חיובי-חלק").
7. מניחים כל צינור חיובי-שבריר על מגנט במשך 6-8 דקות.
8. עם הצינורות החיובי-שבריר עדיין על המגנט, בזהירות להעביר supernatant מצינור חיובי-חלק עם pipet פסטר זכוכית לצינור חרוטי 50 מיליליטר סטרילי חדש (referreד כל" שבריר המועשר "). חלק מועשר זה מכיל תאי CD4 ⁺ T. היזהר שלא לשבש את התאים שכותרתו נמשכים אל המגנט.
9. תאי Resuspend נותרו בצינורות החיובי-החלק באותו הנפח של תיוג הצפת כמו בשלב 3.6 ידי pipetting למעלה ולמטה במרץ. מניחים צינור חיובי-חלק אחורי על מגנט במשך 6-8 דקות.
10. עם צינורות חיובי-שבריר עדיין על המגנט, בזהירות להעביר supernatant (מועשרת שבריר, CD4 ⁺⁾ מצינור חיובי-חלק עם pipet פסטר זכוכית לסטרילי 50 מיליליטר צינור חרוטי מצעד 3.8 מבלי לשבש תאים מצורפים למגנט.
11. חזור על שלבים 3.9-3.10 להגדיל את התשואה של תאי CD4 ⁺ T שהושגו. המשך פרוטוקול באמצעות שבריר מועשר (CD4 ⁺ תאים).

4. תאי תיוג ומיון ⁷

1. צנטריפוגה מועשרת תאים ב 450 XG במשך 7 דקות. בטל supernatant על ידי שפיכה כבויה או suct ואקוםיון למכל פסולת.
2. תאי Resuspend ב 1 מיליליטר של תיוג הצפת. הסר aliquot של תאים לספור ולהעריך כדאיויות תא על ידי הרחקה הכחולה trypan כמו בשלב 2.9.
3. הוספת נפח של תיוג הצפת עד 10 x 10 ⁶ תאים / מיליליטר; אם תאים כבר <10 x 10 ^6, צנטריפוגות ב 450 XG במשך 7 דקות, להשליך supernatant על ​​ידי שפיכה כבויה או שאיבת אבק למכל פסולת, ולהוסיף נפח של תיוג הצפת עד 10 x 10 ⁶ תאים / מיליליטר.
   1. הגדר את aliquots הנפרד של × 10 ⁵ תאים כ 5-10 כל לתאי שליטה בלא כתם, מוכתם אלוטיפ, ומוכתם יחידים בצינורות microfuge.
4. הוסף 5 מיקרוגרם CD4-FITC ו1 מיקרוגרם / מיליליטר CD45RB-PE / מיליליטר לתאים. להוסיף כתמי שליטת אלוטיפ וכתמים בודדים באותו הריכוז לנכס aliquots בצינורות microfuge. מערבבים היטב אך בעדינות ולדגור על הקרח המוגן מפני אור למשך 30 דקות.
5. להוסיף 10x נפח של תיוג מאגר לתאים ובקרהs. צנטריפוגה XG 450 במשך 7 דקות. בטל supernatant על ידי שאיבת אבק למכל פסולת.
6. Resuspend בתיוג הצפת הנפח בשלב 4.5. צנטריפוגה XG 450 במשך 7 דקות. בטל supernatant על ידי שאיבת אבק למכל פסולת.
7. Resuspend בתיוג הצפת עד 10 x 10 ⁶ תאים / מיליליטר. עובר תאים דרך מסננת 70 מיקרומטר לתוך צינור FACS. שמור על הקרח המוגן מפני אור עד מוכן לFACS.
8. להגדיר ולקבוע פיצוי הולם על סדרן התא עם תאים בלא כתם ובקרות מוכתמים יחידים.
9. אל תכלול תאי nonviable עם gating צופה וצד-פיזור (איור 1 א). הגדרת gating לCD4 ⁺ וCD45RB ⁺ תאים עם פקדים מוכתמים אלוטיפ. תאי שער בCD4 ⁺ אוכלוסייה.
10. מיין CD4 ⁺ תאים לאוכלוסיות ^נמוכות CD45RB ^הגבוה וCD45RB באמצעות היסטוגרמה פשוטה לתאים מוכתמים PE לתוך צינורות עם 2 מיליליטר של מדיה מלאה. CD45RB ^הגבוה + CD45RB ⁺ תאים (CD45RB ^הגבוה), והאוכלוסייה ^הנמוכה CD45RB היא 20% הנמוכים ביותר של CD4 ⁺ CD45RB ⁺ תאים (CD45RB ^הנמוך; איור 1).

איור 1: תזרים נציג cytometry חלקות של אוכלוסיות תאי CD4 ⁺ T CD45RB במהלך ניתוח FACS (- C) FITC CD4- וPE CD45RB מוכתם splenocytes מהתורם C57BL / 6 עכברים מסודרים על ידי FACS ^{ל+ גבוה} וCD4 CD4 ⁺ CD45RB. אוכלוסיות תאי T ^הנמוך CD45RB. אירועים () כפיל לא נכללו בעלילת הפיזור קדימה. (ב) לימפוציטים היו מגודר בעלילה קדימה וצד פיזור. (C) CD4 ⁺ (D) CD4 ⁺ CD45RB ⁺ T היו זממו על היסטוגרמה אירועי PE לעומת. תאי CD4 ^{+ נמוכים} CD45RB נחשבו 20% הנמוכים ביותר של CD45RB ⁺ תאים. תאי CD4 ^{+ גבוהים} CD45RB הוגדרו כ-40% הגבוהים ביותר של CD45RB ⁺ תאים.

11. הפעל aliquot של כל אוכלוסיית תאים במכונה FACS להעריך טוהר של אוכלוסיות.
12. צנטריפוגה מסודרים תאים ב 450 XG במשך 7 דקות. Resuspend ב 1 מיליליטר PBS. הסר aliquot של תאים לספור ולהעריך כדאיויות תא על ידי הרחקה הכחולה trypan כמו בשלב 2.9.

5. הזרקה של תאים לתוך מקבלי

1. Resuspend מסודרים תאים עד 4 x 10 ⁶ תאים / מיליליטר (CD45RB ^גבוה) או 2 x 10 ⁶ תאים / מיליליטר (CD45RB ^הנמוך) בPBS.
2. העבר את תאים ^גבוהים CD45RB 100 μl למקבל לצינור סטרילי החדש. הוספה של כל PBS 100 μlנמען לצינור זה. לפיכך, הזרקה הכולל לבעלי חי נפח הוא 200 μl, וסכום כולל של תאים לכל נמען הוא 4 תאים נאיביים ^גבוהים x 10 ⁵ CD4 ⁺ T CD45RB.
3. אם קבוצת ניסוי שקיבלה תאי T רגולטורים היא רצויה, להעביר תאים ^גבוהים CD45RB 100 μl למקבל לצינור סטרילי החדש. הוספה של תאים ^נמוכים CD45RB למקבל 100 μl לאותו צינור. הזרקה הכולל לבעלי חי נפח הוא 200 μl; יחס ^הגבוה CD45RB: התאים ^נמוכים CD45RB הוא 2: 1.
4. הזרק של CD45RB ^גבוה או CD45RB 100 μl CD4 ^הגבוה / ^הנמוך CD45RB ⁺ תאים intraperitoneally לימין וצד שמאל של הבטן (הכוללת של 200 μl) של כל אחד מנמענים.

6. ניטור של מחלת התקדמות בבעלי חיים נמען

1. על מנת להעריך את המצב הקליני של בעלי החיים הנמען, להקצות עשרות קליניים מצטברים לparamete הבאrs ⁸ ביום ההזרקה, שבועי לאחר מכן, ובזמן של הקרבה:
   1. לקבוע מבזבז על ידי מדידת ירידה במשקל: 0 - אין ירידה במשקל; הפסד 0.1-10% ממשקל גוף ראשוני - 1; 2 - אובדן יותר מ -10% ממשקל גוף ראשוני (איור 2 א).

איור 2: סימנים פתולוגיים קליניים וגולמיים של דלקת להתרחש לאחר העברת סוג בר תאי T מסוג CD4 ^{+ הגבוה} CD45RB לRag1 ^{- / -} ועכברים נמען NRDKO ¹¹ () מקבלי NRDKO איבדו בממוצע 10% ממשקל הגוף הראשוני שלהם על ידי 5. שבועות לאחר העברה-, ואילו Rag1- / - המקבלים לא מפגינים סימנים קליניים של מחלה בשלב זה. כל נקודה מייצגת את האחוז הממוצע של משקל גוף ראשוני למחזור ± SEM. ** P <0.005. (ב) עכברי חלק פיתחו דלקת מעיים חמורה, כפי שהודגם על ידי הנוכחות של צניחה של פי הטבעת. זוהי תמונה מייצגת של צניחה של פי הטבעת בעכבר נמען NRDKO. (C) באופן בוטה, נקודותיים משני Rag1 ^{- / -} ועכברים נמען NRDKO מעובה וקצרו בהשוואה למתיישבי Rag1 ^{- / -} והעכברים NRDKO ללא העברת מאמצת תא T. מתיישבי עכברי נמען NRDKO להראות דלקת חמורה ומשקולות מעי גס מוגברות (מידע לא מוצג). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

1. 2. לקבוע את האיכות של צואה על ידי הצבת בעלי חיים במכל נקי עד שעברשרפרף: 0 - אין; 1 - צואה רכה; 2 - שרפרף מימי ו / או דמים.
   3. לקבוע בריאות כללית של בעלי חיים על ידי נוכחות של הסימנים של המחלה הבאה: 0 - אין יציבה כפופה, זיפי פרווה, עור או נגעים; 1 - כל אחד מהנוכחים הבאים: היציבה כפופה, זיפי פרווה, או נגעים בעור.
   4. לקבוע נוכחות של צניחה של פי הטבעת: 0 - נעדר; 1 - הווה (איור 2).
2. להקריב בעלי חיים משאיפת CO ₂ ואחריו נקע בצוואר הרחם, כאשר הם איבדו 20% ממשקל גופם ההתחלתי או בנקודת זמן רצויה, לפי המוקדם מביניהם. מחלה קלינית היא בדרך כלל לכאורה מתחילה בשבוע 5 לאחר הגודש.
3. להעריך את חומרת מחלה כפי שתואר בעבר ^5,7.
   1. להקצות עשרות קליניים כמו בשלב 6.1 ^8.
   2. למדוד אורך מעי גס ומשקל (איור 2 ג).
   3. לבצע ניתוח היסטולוגית של דלקת5.
   4. לקבוע ביטוי ציטוקינים ספונטני בתרבויות explant רקמת מעי ^9, הלימפה mesenteric צומת ^10, ו / או בסרום ^11.
      1. בקצרה, לתרבויות explant ^9, להסיר נקודותיים לאחר הקרבה, פתוח לאורך הזמן, ונקי עם PBS. דגירה נקודותיים בייקר מסלולית נקבע על 250 סל"ד במדיה שלמה למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר.
      2. קוצצים רקמה לחתיכות קטנות וטופחו על 37 מעלות צלזיוס במדיה שלמה עבור 24 שעות. לאסוף את supernatant ולהשתמש כדי לכמת את ציטוקינים לכל 100 מ"ג רקמה על ידי ELISA.
   5. בצע vivo לשעבר אפיון של פנוטיפים תאי T ו / או פונקציה ^10.

תוצאות

כ 10 x 10 ⁶ תאי T מסוג CD4 ^{+ הגבוה} CD45RB מ -10 טחולים ממבוגרי C57BL / 6 עכברים תורמים באופן מהימן מבודדים. מספר זה ישתנה בהתאם לגיל והמתח של עכבר התורם ומיומנותו של החוקר. כאשר 4 x 10 ⁵ C57BL / 6 תאי T מסוג CD4 ^{+ הגבוה} CD45RB מועברים לתוך C57BL Rag1 / 6 ^{- / -} עכברי נמען, סימנים קליניים של מחלה מופיעים ברחבי שבוע 5 הודעה גודש-או מוקדם יותר אם עכברים עם רגישות גנטית למחלה חמורה יותר ( איור 2, 3) ^1...

דיון

כאן אנו מתארים פרוטוקול צעד-אחר-צעד גרימת דלקת במעי הגס בעכברים על ידי העברת מאמצת של תאי CD4 ⁺ CD45RB ⁺ T לעכברי immunodeficient. אנחנו השתמשנו טחולי C57BL / 6 תורם וRag1 syngeneic ^{- / -} עכברי נמען, אם כי זנים אחרים (למשל, BALB / ג, 129S6 / SvEv, סוכרת שאינן סובל מהשמנת יתר (NOD)) מודלים וגנטיים של כשל חיסוני (לדוגמא, SCID, Rag2 ^{- / -} גם) עשוי לשמש ^4,14-16. היא מבוססת היטב כי לחץ משפיע על ר...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שם המגיב / ציוד	מספר	קטלוגי	של החברה הערות/תיאור
10x PBS	Gibco	14200075
12 מ"מ x 75 מ"מ צינור תחתון עגול	פלקון
15 מ"ל קורנינג חרוטי		430790
26 גרם x 3/8 מחט	BD Biosciences	305110
50 מ"ל קורנינג חרוטי
70 μ m מסננת תאים	Fisherbrand	22363548
BD IMagnet	BD Biosciences	552311
&-mercaptoethanol	Thermo Scientific	35602
CD4-FITC IgG2b	eBioscience	11-0041
CD45RB-PE IgG2a	BD Pharminogen	553101
מדיה			RPMI-1640, 1% עט/סטרפטוק, 10% FBS, 0.0004% β-ME
צינור FACS + מסננת	BD פלקון	352235
זכוכית מיקרוסקופ שקופיות	פישרברנד	12550A3
Gemini	100-106
מאגר			מושבת בחום 1x PBS, 0.5% BSA, 2 מ"מ EDTA
מאגר			0.08% NH4Cl, 0.1% KHCO3, 1 מ"מ EDTA
MoFlo XDP	Beckman Coulter
Mouse CD4 T סט העשרת לימפוציטים - DM	BD Biosciences	558131
עכבר IgG2a-PE	BD Pharminogen	553457
עכבר IgG2b-FITC	eBioscience	11-4732
פסטר פיפט	פישרברנד	13-678-20D
תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין, 100X	Corning Cellgro	30-002-CI
[header]
Petri Dish	Fisherbrand	875713
אתנול טהור 200 Proof	Decon Labs	2705-HC
RPMI-1640	Gibco	11-875-093
מזרק	BD Biosciences	309597
טריפן כחול	קורנינג Cellgro	25-900-CI
Wash Media			RPMI-1640, 1% עט/סטרפטוק, 0.0004% β-ME