מאמר שיטה

אינדוקציה של Murine דלקת מעיים על ידי העברת המאמצת של מפעיל CD4 + CD45RB גבוה תאי T לעכברי immunodeficient

DOI:

10.3791/52533

⸱

21 באפריל 2015

 ,  , 
1Center for Gastrointestinal Biology and Disease, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Microbiology and Immunology, University of North Carolina at Chapel Hill, 3Department of Genetics, University of North Carolina at Chapel Hill, 4Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina at Chapel Hill

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להשראת דלקת במעי הגס בעכברים על ידי העברה מאמצת של תאי Tגבוהים CD4+CD45RB סינגניים לנמענים חסרי תאי T ו-B. מאפיינים קליניים והיסטופתולוגיים מחקים מחלות מעי דלקתיות אנושיות. שיטה זו מאפשרת לחקור את התחלת דלקת המעי הגס והתקדמות המחלה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש מודלים של בעלי חיים רבים ושונים זמינים ללימוד פתוגנזה של מחלות בבני אדם מעי דלקתיות (IBD), כל אחד עם יתרונות משלה וחסרונות. אנו מתארים כאן מודל קוליטיס ניסיוני שהוא ביוזמת העברת מאמצת של תאי טחול syngeneic CD4 + T CD45RB הגבוה לעכברי נמען חסרי T ו- B תא. אוכלוסיית תאי T מסוג CD4 + הגבוה CD45RB שמורכבת בעיקר של תאי מפעיל נאיביים היא מסוגלת גרימת דלקת מעיים כרונית, דומה מאוד להיבטים מרכזיים של IBD האנושי. שיטה זו ניתן להשפיע ללמוד היבטים של תחילת מחלה והתקדמות. בנוסף ניתן להשתמש בו כדי ללמוד את הפונקציה של מולדת, מסתגל, ואוכלוסיות תאים חיסוני רגולציה, ואת התפקיד של חשיפות סביבתיות, כלומר, החיידקים, בדלקת מעיים. במאמר זה אנו מדגימים את המתודולוגיה לגרימת דלקת המעי הגס עם פרוטוקול צעד-אחר-צעד. inc זהלרכב וידאו הדגמה של היבטים טכניים מפתח נדרשו לפתח מודל העכברי של קוליטיס הניסיוני למטרות מחקר בהצלחה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחלות המעי הדלקתיות (IBD) מחלת קרוהן וקוליטיס כיבית נובעות מאינטראקציה לא מוגדרת ומורכבת בין תגובות חיסוניות של המארח, רגישות גנטית, גורמים סביבתיים ותכולת הלומינל המעי1. מחקרי אסוציאציה אחרונים ברחבי הגנום מדווחים על קשרים בין גנים מווסתים של תאי חיסון ורגישות ל-IBD2,3. גנים פנימיים של תאי חיסון מולדים ונרכשים מיוצגים במחקרים אלה, מה שמצביע על תפקיד מרכזי לאוכלוסיות תאים אלה בפתוגנזה של IBD.

קיימים כיום יותר מ-50 מודלים של בעלי חיים של IBD אנושי. בעוד שאין מודל אחד של פנוקופיה מושלמת של מחלות מעי דלקתיות אנושיות, רבים מהם שימושיים לחקר היבטים שונים של מחלות אנושיות, כולל הופעת המחלה והתקדמותה ותגובת ריפוי הפצעים. בשיט....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: ודא שכל הפרוטוקולים של בעלי החיים שאושרו על ידי ובעמידה בבעלי חיים מוסדי טיפול ושימוש ועדת תקנות (IACUC) והמדריך של המועצה הלאומית למחקר לטיפול והשימוש בחי מעבדה. עכברי תורם יכולים להיות זכר או נקבה, אבל עכברי נמען צריכים להיות גבר. אם המקבלים נשיים הם לשמש, עכברי התורם חייבים להיות נקבה 5. לשמור על מושבות משתמשים במצעים רגילים, שאינם סטרילי ומים acidified עישון, כמו אלה עלולים להשפיע על חיידקי מעיים, ו, ובכך, את הפנוטיפ קוליטיס של העכברים 5,6.

1. ניסיוני הכנה

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    תוצאות

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    כ 10 x 10 6 תאי T מסוג CD4 + הגבוה CD45RB מ -10 טחולים ממבוגרי C57BL / 6 עכברים תורמים באופן מהימן מבודדים. מספר זה ישתנה בהתאם לגיל והמתח של עכבר התורם ומיומנותו של החוקר. כאשר 4 x 10 5 C57BL / 6 תאי T מסוג CD4 + הגבוה CD45RB מועברים לתוך C57BL Rag1 / 6 - / - עכברי נמען, סימנים קליניים של מחלה מופיעים ברחבי שבוע 5 הודעה גודש-או מוקדם יותר אם עכברים עם רגישות גנטית למחלה חמורה יותר ( איור 2, 3) 1.......

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    דיון

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    כאן אנו מתארים פרוטוקול צעד-אחר-צעד גרימת דלקת במעי הגס בעכברים על ידי העברת מאמצת של תאי CD4 + CD45RB + T לעכברי immunodeficient. אנחנו השתמשנו טחולי C57BL / 6 תורם וRag1 syngeneic - / - עכברי נמען, אם כי זנים אחרים (למשל, BALB / ג, 129S6 / SvEv, סוכרת שאינן סובל מהשמנת יתר (NOD)) מודלים וגנטיים של כשל חיסוני (לדוגמא, SCID, Rag2 - / - גם) עשוי לשמש 4,14-16. היא מבוססת היטב כי לחץ משפיע על ר.......

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    גילויים

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

    תודות

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    עבודה זו נתמכה על ידי אמריקאי Gastroenterological Association (AGA) מחקר חוקרי פרס וקרוהן וקוליטיס קרן של אמריקה (CCFA) פיתוח קריירה פרס (לSZS), DK089692 F30 NIH NIDDK (לECS), ואוניברסיטת צפון מרכז קרוליינה לביולוגיה במערכת העיכול וDK34987 P30 מחלת גרנט (היסטולוגיה Core). מתקן UNC cytometry זרימת Core נתמך בחלקו על ידי NCI מרכז Core תמיכת גרנט (P30CA016086) למרכז לסרטן UNC Lineberger. אנו מודים ללוק B. Borst מState College אוניברסיטת צפון קרוליינה לרפואת וטרינרית על עזרתו עם ניתוח ואימונוהיסטוכימיה histopathological.

    ....

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    חומרים

    רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
    שםחברהמספר קטלוגהערות
    שם המגיב / ציודמספרקטלוגישל החברה הערות/תיאור
    10x PBSGibco14200075
    12 מ"מ x 75 מ"מ צינור תחתון עגולפלקון
    15 מ"ל קורנינג חרוטי430790
    26 גרם x 3/8 מחטBD Biosciences305110
    50 מ"ל קורנינג חרוטי
    70 μ m מסננת תאיםFisherbrand22363548
    BD IMagnetBD Biosciences552311
    &-mercaptoethanolThermo Scientific35602
    CD4-FITC IgG2beBioscience11-0041
    CD45RB-PE IgG2aBD Pharminogen553101
    מדיהRPMI-1640, 1% עט/סטרפטוק, 10% FBS, 0.0004% β-ME
    צינור FACS + מסננתBD פלקון352235
    זכוכית מיקרוסקופ שקופיותפישרברנד12550A3
    Gemini100-106
    מאגרמושבת בחום 1x PBS, 0.5% BSA, 2 מ"מ EDTA
    מאגר0.08% NH4Cl, 0.1% KHCO3, 1 מ"מ EDTA
    MoFlo XDPBeckman Coulter
    Mouse CD4 T סט העשרת לימפוציטים - DMBD Biosciences558131
    עכבר IgG2a-PEBD Pharminogen553457
    עכבר IgG2b-FITCeBioscience11-4732
    פסטר פיפטפישרברנד13-678-20D
    תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין, 100XCorning Cellgro30-002-CI
    [header]
    Petri DishFisherbrand875713
    אתנול טהור 200 ProofDecon Labs2705-HC
    RPMI-1640Gibco11-875-093
    מזרקBD Biosciences309597
    טריפן כחולקורנינג Cellgro25-900-CI
    Wash MediaRPMI-1640, 1% עט/סטרפטוק, 0.0004% β-ME
    352052 430828 מלאה FBS תיוג ליזה

    מקורות

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Xavier, R. J., Podolsky, D. K. Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature. 448 (7152), 427-434 (2007).
    2. Cho, J. H., Brant, S. R. Recent insights into the genetics of inflammatory bowel disease. Gastroenterology. 140 (6), 1704-1712 (2011).
      3. <....

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    הדפסות חוזרות והרשאות

    בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

    בקש הרשאה

    תגיות

    TFACSperitonium

    מאמרים קשורים