הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

דור יעיל של כתבים במכות ספציפיים Lineage hiPSC עצבי באמצעות CRISPR / Cas9 ומערכת Nickase זוגי Cas9

10.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/52539

⸱

28 במאי 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery, The University of Texas Health Science Center at Houston, 2Center for Stem Cell and Regenerative Medicine, Brown Foundation Institute of Molecular Medicine, The University of Texas Health Science Center at Houston, 3The Senator Lloyd & B. A. Bentsen Center for Stroke Research, Brown Foundation Institute of Molecular Medicine, The University of Texas Health Science Center at Houston, 4Summer Research Program, Office of Educational Programs, The University of Texas Health Science Center at Houston, 5Department of Anesthesiology, Shengjing Hospital, China Medical University, 6Department of Oncology, Renji Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, 7Biology Department, University of West Georgia

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כלי עריכת גנום כגון מערכת CRISPR (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) שיפרו מאוד את יעילות מיקוד הגנים בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים (hiPSCs). כתב יד זה מתאר פרוטוקול ליצירת מדווח hiPSC ספציפי לשושלת באמצעות רקומבינציה הומולוגית בסיוע מערכת CRISPR/Cas.

תקציר

מיקוד גן הוא גישה ביקורתית לאפיון פונקציות גן במחקר הביו-רפואי מודרני. עם זאת, היעילות של גן המיקוד בתאים אנושיים הייתה נמוכה, המונעת את הדור של שורות תאים אנושיות בקצב רצוי. בשנתיים האחרונות היינו עדים להתקדמות מהירה בשיפור היעילות של מניפולציה גנטית על ידי כלי עריכת הגנום כגון מערכת / קאש (הקשורים CRISPR) CRISPR (אשכולות באופן קבוע Interspaced חזרות Palindromic קצרה). כתב יד זה מתאר פרוטוקול להפקת כתבי שושלת ספציפיים בתאי גזע אנושיים pluripotent מושרה (hiPSC) באמצעות מערכת CRISPR / קאש סייעה רקומבינציה ההומולוגית. הליכים לקבלת רכיבים דרושים להכנת קווי כתב שושלת עצביים באמצעות CRISPR / מערכת קאש, תוך התמקדות בבנייה של וקטורי מיקוד וRNAs מדריך היחיד, מתוארים. פרוטוקול זה יכול להתארך עד הקמת פלטפורמה ותיקון מוטציה בhiPSCs.

מבוא

CRISPR (אשכולות באופן קבוע Interspaced חזרות Palindromic קצרה) / קאש מערכת (הקשורים CRISPR), יחד עם כלי עריכת הגנום אחרים, יש מהפכה במניפולצית הגנום האנושית בשנים האחרונות 1-7. מרכיבים עיקריים במערכת / Cas9 CRISPR הם RNA מדריך יחיד (sgRNA) וCas9. Cas9 הוא הסוג השני endonuclease DNA מודרך RNA. יש לו שני תחומים nuclease, האמפ וRuvC, אשר אחראים על ביצוע הפסקות גדילי דנ"א כפולים (DSBs) באזור גנומי ספציפי ליד מוטיב סמוך protospacer יש (PAM) 7-10 .An sgRNA פונקציה משולבת של זה של crRNA וtracrRNA, שתי מולקולות RNA הסתגלות חסינות שזוהו בחיידקים (כגון סטרפטוקוקוס pyogenes) וחיידקים קדומים להילחם נגד פלישת DNA של מקורות אקסוגניים 9-11. כאשר תוכנן כראוי ושיתוף הציג לתאי יונקים, sgRNA מכיר את רצף PAM, בסיס-זוגות עם הגדיל המשלים של ה- DNA היעד, ומדריכים וtransactivates Cas9 לדבוקבשני גדילי הדנ"א באופן מיידי במעלה הזרם של 7 PAM. בהמשך לכך, בבימויו הומולוגי רקומבינציה (HDR, בנוכחותו של וקטור מיקוד) או בסוף שאינו הומולוגי שהצטרף (NHEJ) יתרחש לתקן DSBs. Transgenes כגון cDNAs, קלטות כתב, או שברים עמידים לאנטיביוטיקה יכול להיות משולב, וקווים מהונדסים או להתרפק עשו.

למרות שהמערכה / Cas9 CRISPR היא יעילה ביותר ויחסית ספציפית, לא רצויה דווחו פעילויות מחוץ יעד 12-15. כדי למזער את האירועים מחוץ היעד, nickases Cas9 (Cas9n) יש גם מהונדס 9,10,14,16,17. Cas9n (D10A Cas9 או Cas9 H840A) הוא אנזים Cas9 עם מוטציות באחד משני תחומים nuclease, שמעורר רק ניק בגדיל אחד של DNA. כדי להשיג מחשוף בשני הגדילים, שתי sgRNAs נועד להדריך את זוג nickases, אשר חותך בנפרד בלוקוסים סמוכים של שני גדילי דנ"א שונים. האסטרטגיה "nicking הכפול" דורשת מורעיצוב דואר מחמיר יותר מאשר פלטפורמת Cas9 הקונבנציונלית, ומציע גם יעילות גבוהה וסגוליים גבוהות לניסויי עריכת גן.

כתב יד זה מתאר פרוטוקול להפקת כתב שושלת ספציפי בתאי גזע אנושיים pluripotent מושרה (hiPSC) באמצעות מערכת CRISPR / קאש סייעה רקומבינציה ההומולוגית. צעדים להשגת הרכיבים הדרושים להכנת קווי כתב שושלת עצבית באמצעות CRISPR / עריכת הגנום מערכת תיווך קאש מתוארות, עם דגש על הבנייה של וקטורי מיקוד וsgRNAs. פרוטוקול זה כבר חזר בהצלחה בשורות hiPSC מרובות כוללים אלה נגזרים מאנשים בריאים ומחולים במחלות של מערכת העצבים המרכזית. גנים ממוקדים במעבדה שלנו כוללים OLIG2, HB9 (MNX1), NEUROG2, SOX1, ALDH1L1 וSOD1. מיקוד יעילות מCRISPR מערכת / קאש בתיווך רקומבינציה ההומולוגית בhiPSCs נע בין 20-40%, אשר עולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים 1,18,19. בהשוואה לtypicaיעילות l של 1-2% בניסויי גן המיקוד קונבנציונליים, יעילות המיקוד משופרת באופן משמעותי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. תכנון ובנייה וקטורית עבור וקטורים ממוקדים

  1. לאחר קביעת הסמן הספציפי לשושלת, אתר את הרצף הגנומי של הגן ותכנן את זרועות ההומולוגיה בהתאם. אורך זרוע ההומולוגיה 5' הוא ~1 kb ושל זרוע ההומולוגיה 3' הוא ~1.5 kb (איור 1).
  2. תייג את קלטת המדווח ברצף במורד הזרם של הרצף הגנומי ממש לפני קודון העצירה, על ידי תת-שיבוט, כך שהביטוי האנדוגני לא ישתנה או יופרע. קשר את המדווח, או קלטת המדווח הכפולה, עם רצפי פפטידים 2A הדבקה עצמית (F2A, E2A או T2A) 20,21, או אתר כניסת ריבוזום פנימי (IRES).
    הערה: המדווחים עשויים לכלול חלבונים פלואורסצנטיים כגון GFP, tdTomato, tagRFP, YFP, לוציפראז או קלטת עמידות לאנטיביוטיקה, שילוב של חלבון פלואורסצנטי וקלטת עמידות לאנטיביוטיקה. דוגמה מוצגת באיור 1 לבניית וקטור מיקוד לגן ALDH1L1 אנושי, המתויג על ידי EGFP וקלטת עמידות לניאו-מיצין.
  3. הוסף קלטת בחירה חיובית במורד הזרם של המדווח. הברירה החיובית היא קלטת עמידה לאנטיביוטיקה שנכרת מה-iPSCs הממוקדים לאחר בחירת השיבוטים החיוביים ובידודם.
  4. כלול קלטת בחירה שלילית מחוץ לזרוע ההומולוגיה של 3'. קלטות ברירה שליליות נפוצות הן תימידין קינאז, TK ורעלן דיפתריה A (DTA) 22.
  5. השג שיבוט BAC אנושי המכיל את רצף סמן השושלת ואמת את השיבוט על ידי הגברת PCR. בנה את וקטור המיקוד ב-pKD46 המכיל -DH5α באמצעות רקומבינר כדי למשוך את אתר המיקוד 23. החל שער מרובה אתרים, אסטרטגיות שער הזהב23,24 בעת הצורך.

2. תכנון ובנייה וקטורית של sgRNAs עבור מערכת CRISPR/Cas9.

  1. קבע את הסמן הספציפי לשושלת שיכוון ליצירת המדווח. העתק את רצף ה-cDNA ממסד הנתונים של NCBI. עבור לחיפוש BLAT אנושי כדי לקבל יישור DNA גנומי.
  2. לחץ על הכרטיסייה "דפדפן" כדי להציג את הרכבת הגן. תחת הכרטיסייה "תצוגה", לחץ על "DNA" כדי לקבל את רצף ה-DNA הגנומי המלא בפורמט FASTA.
  3. אתר את קודון העצירה בתוך רצף ה-DNA, שם יתויגו רצף 2A וקלטת המדווח.
  4. חפש את המוטיב הסמוך לפרוטוספייסר (PAM, כלומר, NGG) בתוך הוויניסיטי (~100 bp אזור האגף) של קודון העצירה. סרוק את שני הגדילים כדי לאתר את רצף ה-NGG המתאים. שקול את הספציפיות של הרצפים במעלה הזרם כדי למנוע אירועים פוטנציאליים מחוץ ליעד. השתמש בכלי קוד פתוח כגון BLAST ו- CasOT (ראה שלב 5 לפרטים).
  5. העתק את הרצף של 20 בסיסים מיד במעלה הזרם של NGG והדבק אותו בכלי עיצוב האינטרנט ZiFit כדי לעצב אוליגואים עם תלויים התואמים לווקטור ביטוי אנושי-gRNA (עם מקדם U6) MLM3636.
  6. סינתזה של אוליגוס קדימה ואחורה 7.
  7. כדי ליצור sgRNA דו-גדילי, יש לפרק את שני האוליגו ב-70 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ולהתקרר בהדרגה ל-RT. לתגובה של 50 מיקרוליטר, הוסף 22.5 מיקרוליטר של אוליגוס קדימה ואחורה (ריכוז המלאי הוא 0.1 מ"מ) בהתאמה, ו-5 מיקרוליטר של מאגר חישול (100 מ"מ Tris-HCl, 10 מ"מ EDTA, 1.5 מ"מ NaCl, pH 8.0).
  8. מערבבים וקושרים את האוליגו שהתקבלו משלב 2.7 עם וקטור ביטוי gRNA אנושי מעוכל BsmBI (עם מקדם U6) MLM3636. לתגובה של 20 מיקרוליטר, הוסף 1 מיקרוליטר של אוליגוס משלב 2.7, 100 ננוגרם של MLM3636 ו-1 מיקרוליטר (400 U) של T4 ליגאז. דגירה ב-RT O/N.
  9. הפוך תאים מוכשרים DH5α עם תוצר הקשירה על ידי הלם חום ב-42 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות. גדל את החיידקים בצלחת LB אגר אמפיצילין (100 מיקרוגרם/מ"ל) ב-37 מעלות צלזיוס O/N. בחר 3 ~ 5 מושבות למיני-הכנה של פלסמיד על פי פרוטוקול היצרן. רצף את ה-DNA של הפלסמיד כדי לאשר באמצעות ספקים מסחריים. מקסימום את הפלסמיד הנכון על פי פרוטוקול היצרן.
  10. הערך sgRNA על ידי בדיקת T7 endonuclease 1 (T7E1) (ראה שלב 4 לפרטים). Transfect hiPSC עם הפלסמיד וה-sgRNA יבוא לידי ביטוי תחת מקדם ה-U6 המובנה בעמוד השדרה MLM3636 (ראה שלב 6 לפרטים).

3. תכנון ובנייה של Cas9n Double Nickase sgRNA

  1. השג וקטור ניקאז כפול Cas9n D10A pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n (D10A).
  2. עצב זוג אוליגואים קדימה ואחורה עבור כל מוקד מטרה. העתק את הרצף של 20 בסיסים מיד במעלה הזרם של NGG כמתואר בשלב 2 והדבק אותו בכלי עיצוב האתרים ZiFit
  3. כדי להשיג אוליגואים עם תלויים התואמים ל-pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n (D10A), הסר את הבסיס הראשון והאחרון של אוליגואים קדימה ואחורה המוצגים על ידי כלי העיצוב ZiFit.
  4. לסנתז אוליגוס קדימה ואחורה7. תן שם לאוליגו אלה כ-f(n)-F, f(n)-R עבור PAMs בצד אחד של אתר היעד, r(n)-F, r(n)-R עבור PAMs בצד השני של אתר היעד. מבין אלה, n הוא המספר לציון PAMs שונים, האותיות הקטנות f ו-r מייצגות את המיקום של ה-PAMs בגדיל ה-sense (f) או ב-antisense (r), F ו-R מייצגים אוליגואים קדימה ואחורה.
    1. בדוק זוגות מרובים (למשל, r5 ו-f2) באמצעות מבחן T7E1 (מפורט בשלב 4) כדי לזהות את זוג ה-sgRNAs האופטימלי שישמש עבור Cas9n.
  5. כדי ליצור sgRNA דו-גדילי, יש לפרק את שני האוליגו ב-70 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ולהתקרר בהדרגה ל-RT. לתגובה של 50 מיקרוליטר, הוסף 22.5 מיקרוליטר של אוליגוס קדימה והפוך (ריכוז המלאי הוא 0.1 מ"מ) בהתאמה, ו-5 מיקרוליטר של מאגר חישול (100 מ"מ Tris-HCl, 10 מ"מ EDTA, 1.5 מ"מ NaCl, pH 8.0).
  6. מערבבים וקושרים את האוליגו שהתקבלו משלב 3.5 עם pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n (D10A) המעוכל ב-BbsI. לתגובה של 20 מיקרוליטר, הוסף 1 מיקרוליטר של sgRNA משלב 3.5, 100 ננוגרם של Cas9n (D10A), 1 מיקרוליטר (400 U) של T4 ליגאז. דגירה ב-RT O/N.
  7. הפוך תאים מוכשרים DH5α עם תוצר הקשירה על ידי הלם חום ב-42 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות. גדל את החיידקים בצלחת אמפיצילין LB אגר (100 מיקרוגרם/מ"ל) ב-37 מעלות צלזיוס O/N. בחר 3 ~ 5 מושבות עבור מיני-הכנה של פלסמיד בהתאם לפרוטוקול היצרן. רצף את ה-DNA של הפלסמיד כדי לאשר באמצעות ספקים מסחריים. מקסימום את הפלסמיד הנכון על פי פרוטוקול היצרן.
  8. הערך את sgRNA על ידי בדיקת T7E1 (ראה שלב 4 לפרטים). Transfect hiPSC עם הפלסמיד וה-sgRNA יבוא לידי ביטוי תחת מקדם ה-U6 המובנה בעמוד השדרה Cas9n (D10A) (ראה שלב 6 לפרטים).

4. הערכת sgRNAs על ידי בדיקת T7 Endonuclease1 (T7E1)

  1. עבור צלחת אחת של 24 בארות, צלחת 2 x 105 293FT תאים לבאר יום לפני (יום -1).
  2. ביום הטרנספקציה (יום 0), טרנספקט משותף של תאי 293FT עם פלסמיד sgRNA וקטור ביטוי Cas9. הוסף 0.5 מיקרוגרם של וקטור sgRNA, 0.5 מיקרוגרם של וקטור ביטוי Cas9 JDS246 (Cas9-003), ו-1.5 מיקרוליטר של ליפופקטמין 2000.
    1. לבקרה שלילית, הוסף 0.5 מיקרוגרם של וקטור ביטוי GFP (למשל, GFP מונע על ידי מקדם CMV בעמוד שדרה של pcDNA3) במקום וקטורי sgRNA.
  3. לאחר 72 שעות (יום 3), קצרו תאים על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של מאגר מיצוי מהיר של DNA וטריטורציה נמרצת.
  4. דוגרים את התערובת בחום של 68 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ולאחר מכן 95 מעלות צלזיוס למשך 8 דקות. זוהי התבנית לניסויי ה-PCR הבאים.
  5. תכנן פריימרים PCR קדימה ואחורה כדי להגביר את הרצף המאגף את ה-PAM. בדרך כלל תוצר ה-PCR המכוון הוא באורך של כ-400-500 bp. סנתז את האוליגו7.
  6. לתגובת PCR של 50 מיקרוליטר, הוסף 1 מיקרוליטר של תבנית משלב 4.5, 0.5 מיקרוליטר של הרקולאז II, 0.5 מיקרוליטר של DMSO, 10 מיקרוליטר של חוצץ 5x, 0.5 מיקרוליטר של תערובת dNTP ו-1 מיקרוליטר של תערובת פריימר קדימה ואחורה.
  7. השתמש בפרמטרים הבאים של PCR: 98 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, 35 מחזורים של 98 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות, 59 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות, 72 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת, עם הארכה סופית ב-72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות><. הערה: פרמטרי ה-PCR המתוארים כאן מניבים תוצרים ספציפיים למספר גנים שנבדקו. עם זאת, מצבים אלה תלויים בגנים מעניינים שנבחרו על ידי המשתמש. PCRs המשתמשים ב-DNA גנומי כתבנית דורשים לעתים קרובות אופטימיזציה כדי להבטיח שלא יופיעו רצועות נוספות. ניתן לבלבל את הרצועות הנוספות הללו עם מוצרי מחשוף לאחר בדיקת T7E1.
  8. מדוד את ריכוז ה-DNA של מוצרי ה-PCR באמצעות ספקטרומטר ב-A260.
  9. הוסף 400 ננוגרם של מוצרי PCR ל-2 מיקרוליטר של מאגר עיכול 2. הוסף ddH2O לנפח תגובה סופי של 19 מיקרוליטר. דוגרים במים רותחים למשך 5 דקות. תנו לתגובה לשבת על הספסל ולהתקרר באופן טבעי ל-RT (45-60 דקות).
  10. הוסף 1 מיקרוליטר (10 יחידות/מיקרוליטר) של T7E1, דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. עצור את התגובה על ידי הוספת 2 מיקרוליטר של 0.25 M EDTA מעורבב עם צבע טעינת DNA פי 6.
  11. ממיסים 2.5 גרם אבקת אגרוז ל-100 מ"ל של 1xTAE. מיקרוגל את התערובת ויוצקים ג'ל על קופסת ג'ל. כאשר נוצר ג'ל, טען את כל תגובת 20 מיקרוליטר לג'ל אגרוז 2.5%. הפעל את הג'ל ב 100-150 וולט למשך 30 דקות.
  12. בדוק את הג'ל תחת אור UV (איור 3). T7E1 חותך באתרים שאינם תואמים. עבור sgRNAs שגרמו לחיבור קצה לא הומולוגי, מוצרי ה-PCR יציגו רצועות נדידה מהירות נוספות (קטנות יותר בגודלן) בהשוואה לבקרה שלילית (המתואר בשלב 4.3).
  13. הערכה ודירוג של יעילות חיתוך sgRNA ואחוז הכנסה ומחיקה (indel%) על ידי השוואת צפיפות הפס באמצעות תוכנת Image J.
    1. עבור כל דגימה שפועלת על הג'ל, ייעד את רצועות הג'ל כרצועה לא חתוכה, חתוך את הרצועה 1 וחתוך את הרצועה 2.
    2. מדוד את הצפיפות של כל פס באמצעות ImageJ בהתאם למדריך התוכנה.
    3. חשב fחתך באמצעות הנוסחה הבאה: fcut = (רצועה חתוכה 1 + רצועה חתוכה 2) / (רצועה לא חתוכה + רצועה חתוכה 1 + רצועה חתוכה 2)
    4. חשב את Indel% באמצעות הנוסחה הבאה: Indel=1- √(חיתוך 1-f).

5. חיזוי בסיליקו של אתרים פוטנציאליים מחוץ למטרה

הערה: ניתן לחזות אתרים פוטנציאליים מחוץ ליעד באמצעות כלי קוד פתוח מקוון בשם CasOT17, שהוא תוכנה מבוססת Perl.

  1. עבור מערכת Windows, הורד את תוכנית CasOT ואת קבצי מסד הנתונים של הגנום האנושי לכונן הקשיח המקומי.
  2. הכן את קובץ היעד של ה-sgRNA המעוצב בפורמט FASTA.
  3. פתח את הקובץ בשם "casot". מופיע חלון פקודה. תשאיר את זה כמו שהוא לעת עתה.
  4. פתח את הקובץ בשם "opt-generator" כדי ליצור מחרוזת אפשרויות. הדבק את הנתיב והשם של קובץ היעד בתיבת הדו-שיח של האפשרות "-t" או "-target".
  5. הדבק את הנתיב של קובץ רצף הגנום בתיבת הדו-שיח של האפשרות "-g" או "-genome".
  6. ערכי קלט של –s או –seed (ערך ברירת המחדל הוא 2) ו- –n או -nonseed (ערך ברירת המחדל הוא 255). מחרוזת האפשרויות נוצרת ותופיע בתיבה בראש הדף.
  7. העתק את מחרוזת האפשרויות והדבק אותה בחלון הפקודה CasOT המתואר בשלב 5.3.
    הערה: ייתכן שיידרשו 30-90 דקות להפעלת תוכנית CasOT בהתאם לאפשרויות ולמחשב בו נעשה שימוש. לאחר השלמתו, תיווצר תיקיה בשם '--'. בתיקייה ייכללו שני קבצים, קובץ ".stat" המתאר את הסטטיסטיקה וקובץ .csv (ערכים מופרדים בפסיקים) המכיל את תוצאות החיפוש המפורטות.
  8. פתח את קובץ .csv באמצעות תוכנית גיליון אלקטרוני. המידע הבא מסופק בקובץ עבור כל אתר מחוץ ליעד: מיקום כרומוזומלי וגנומי, רצף האתר, סוג אי התאמה (מ"מ), המספר הכולל של בסיסים לא תואמים ומידע אקסוני הקשור לאתר מחוץ ליעד.
  9. תכנן פריימרים PCR לאתרים שיש בהם <2 מ"מ ברצף הזרע או ברצף שאינו זרע.
  10. בצע PCR עבור שיבוט hiPSC חיובי שנבחר באמצעות התנאים הבאים: 98°C למשך 2 דקות, 35 מחזורים של 98°C למשך 20 שניות, 59°C למשך 20 שניות, 72°C למשך דקה אחת, עם הארכה סופית ב-72°C למשך 5 דקות
    הערה: פרמטרי ה-PCR המתוארים כאן מניבים תוצרים ספציפיים למספר גנים שנבדקו במעבדה שלנו. עם זאת, מצבים אלה תלויים בגנים מעניינים שנבחרו על ידי המשתמש. PCRs המשתמשים ב-DNA גנומי כתבנית דורשים לעתים קרובות אופטימיזציה כדי להבטיח שלא יופיעו רצועות נוספות.
  11. רצף את תוצרי ה-PCR, יישר את תוצאות הריצוף עם רצפים חזויים וחפש מוטציות. אם קיימות מוטציות, אזי מזוהים אירועים מחוץ למטרה.

6. אלקטרופורציה של hiPSCs כדי ליצור מדווחי שושלת עצבית

  1. תרבית hiPSCs במדיום TeSR-E8 על כלים מצופים ג'לטרקס. שנה את המדיום ל-MEF-CM (מדיום מותנה של פיברובלסטים עובריים של עכבר) יומיים לפני האלקטרופורציה. דגירה ב -2 מ"ל Accutase למשך 5 דקות ואיסוף תאים.
  2. אלקטרופוראט hiPSCs עם וקטור מטרה ליניארי, וקטור ביטוי Cas9-003 ווקטור sgRNA תוך שימוש בתנאים הבאים: 1 x 107 hiPSCs, 2.5 מיקרוגרם של sgRNA, 2.5 מיקרוגרם של Cas9 ו-50 מיקרוגרם של וקטור מטרה. לאסטרטגיית ניקאז כפול, הוסף 50 מיקרוגרם של וקטור מטרה, 2.5 מיקרוגרם מכל sgRNA (עם Cas9n מבוטא במשותף על ידי הווקטור).
  3. בחר שיבוטים לפי בחירות חיוביות ושליליות כמתואר24,25.
  4. זהה שיבוטים חיוביים על ידי ניתוח כתמים דרומיים או PCR גנומי ארוך טווח24,25.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

וקטורי תקיפה עם כל הרכיבים הדרושים, כולל זרועות הומולוגיה, קסטת דיווח (reporter cassette), וקסטות לברירה חיובית ושלילית, נבנים (איור 1). בהתבסס על הלוקוס הגנומי האנדוגני, מעצבים מספר (2 עד 3) sgRNAs (במידה ומשתמשים במערכת Cas9) או זוגות של sgRNA (במידה ומשתמשים באסטרטגיית double nickase של Cas9n) המוטמעים בתוך וקטורי ביטוי של human-gRNA מסוג MLM3636 או בבסיסי pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n (D10A) (איור 2). לפני ביצוע הטרנספקציה לתאי hiPSCs, ה-sgRNAs מוערכים בתאי 293FT באמצעות בדיקת T7...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מיקוד גנים הוא כלי חיוני באפיון תפקודי הגנים. עם זאת, היעילות הנמוכה יחסית דורשת עבודה עתירת עבודה וגוזלת זמן. לאחרונה התפתחות של כלי עריכת גנום כגון מערכת CRISPR (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) שיפרה מאוד את יעילות המטרה. כתב יד זה מתאר פרוטוקול ליצירת מדווח תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים (hiPSC) ספציפיים לשושלת באמצעות רקומבינציה הומולוגית בסיוע מערכת CRISPR/Cas. מתוארים שלבים להשגת רכיבים נחוצים ליצירת קווי דיווח שושלת עצבית באמצעות עריכת גנום מתווכת של מערכת CRISPR/Cas, תוך התמקדות ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי המחלקה לנוירוכירורגיה, קרן ממוריאל הרמן Staman Ogilvie, מרכז בנטסן לשבץ מוחי במרכז מדעי הבריאות של אוניברסיטת טקסס ביוסטון, וקרן Mission Connect TIRR.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
pStart-KAddgene20346
pWS-TK6 Addgene20350
pKD3 Addgene45604
pKD46מרכז המלאי הגנטי של קולי, CGSC7634
רצף PGK-neo-bpA Addgene13442
שיבוטי BAC אנושיים של גני מטרה 
JDS246 (Cas9-003), סטרפטוקוקוס פיוגנס מותאם לקודון יונקים Cas9-3XFlag Addgene43861
MLM3636, Human-gRNA-ExpressionVector עם מקדם U6 Addgene43860
pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n(D10A)Addgene42335
עיצוב sgRNA,
Off CasOThttp://eendb.zfgenetics.org/casot/download.php
Perlhttp://www.perl.org/get.html
NCBIhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/
BLAThttps://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start
sgRNA סינתזת פריימרסיגמא
זריקה אחת Top10 Electrocomp E. Coli תאים מוכשריםLife TechnologiesC4040-50
AccuPrime Pfx SupperMixLife Technologies12344-040
אנזימי הגבלהNEB ו-Life Technologies
ערכת שחזור DNA ג'ל ZymocleanZymo ResearechD4007
מאגר מיצוי מהיר DNA EpicentreQE0905T
Herculase II Fusion DNA PolymerasesAgilent Technologies600675
מאגר עיכול 2ניו אינגלנד Biolab
6X DNA טעינת צבעThermo ScientificR0611
ערכת TeSR-E8 לטכנולוגיות תאי גזע תחזוקה hESC/hiPSC05940
UltraPure Agarose לייף טכנולוג'יז16500-100
50xTAEלייף טכנולוג'יזB49
חיוני 8 בינוני Life TechnologiesA1517001
Dulbecco' s תמיסת מלח חוצצת פוספט ללא סידן ומגנזיום Life TechnologiesA12856-01
D-MEM/F12 עם Glutamax Life Technologies10565018
D-MEM עם Glutamax Life Technologies10566040
סרום בקר עוברי מוסמך לתאי ES Life Technologies10439
החלפת סרום נוק-אאוט Life Technologies10828010
2-מרקפטואתנול 1000X Life Technologies21985023
חומצות אמינו לא חיוניות Life Technologies11140050
Stempro Accutase טכנולוגיות חייםA1110501
Dispase לייף טכנולוגיות17105-041
0.25% טריפסין-פתרון EDTA לייף טכנולוגיות25200-056
גלטרקס טכנולוגיות חיים     12760-013
מעכב ROCK Y-27632Millipore    מגיב SCM075
SMC4 BD354357
עמיד לניאו-מיצין MEF MilliporePMEF-NL
Hygromycin עמיד MEF MilliporePMEF-HL
G418 (גנטיצין)LifeTechnologies11811
Hygromycin B Life Technologies10687010
FIAU (Fialuridine, 1-2-Deoxy-2-fluoro-ß-D-arabinofuranosyl-5-iodouracil  מורבק ביוכימיקלים ורדיוכימיה    אלקטרופורטור M251
: Gene Pulser Xcell קובטת ביו-ראד
0.4 ס"מ אלקטרופורציה Bio-Rad165-2088
DIG-ערכת התחלה לתיוג וזיהוי DNA ראשוני גבוה II רוש11585614910
פתרון היברידיזציה לטבע VWR82021-478
ערכת סינתזת בדיקה PCR DIG 
DIG Roche11585762001
Anti-Digoxigenin (DIG-AP)של Roche
CSPD סט
DIG רוש11585762001
מאגר 50X TAE Life Technologies24710030
בופר ספיגה (25 מ"מ Tris pH 7.4,  0.15 מ' NaCl,  0.1% Tween20)
Hoefer Ultraviolet Crosslinker פישר סיינטיפיק03-500-308
ספרמידין פישרAC13274-0010
Tris HCl 2M (pH 7.5)VWR    200064-506
דנוויל סיינטיפיק סרט ביוגרפי כחול 8x10 פישרnc9550782
סמן משקל מולקולרי DNA II ( מסומן DIG )Roche11218590910
קרום אמרשם ספוג Hybond-N+ מגש95038-400
פיירקס פישר15-242A
מגבות נייר קימברלי-קלארק קיפול C פישר06-666-32B
ווטמן נייר 3 מ"מ (26X41)פישר    05-713-336
תיק הכלאה רוש11666649001
צינורות הכלאה פישר13-247-300
תנור היברידיזציה רוטיסרי Shake 'n' Stack FisherHBMSOV14110
https://bacpac.chori.org כלי חיזוי יעד ZiFit http://zifit.partners.org/ZiFiT/ סט כביסה Roche 11636090910 מערכת כימילומינסנציה 11093274910 חיץ שטיפה ובלוק של Roche 11755633001 ייבוש זכוכית רוש

מקורות

  1. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153, 910-918 (2013).
  2. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
  3. Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature. 31, 227-229 (2013).
  4. Friedland, A. E., et al. Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system. Nat Methods. , (2013).
  5. DiCarlo, J. E., et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Res. 41, 4336-4343 (2013).
  6. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339, 819-823 (2013).
  7. Anders, C., Niewoehner, O., Duerst, A., Jinek, M. Structural basis of PAM-dependent target DNA recognition by the Cas9 endonuclease. Nature. 513, 569-573 (2014).
  8. Deltcheva, E., et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature. 471, 602-607 (2011).
  9. Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, E2579-E2586 (2012).
  10. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
  11. Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife. 2, e00471(2013).
  12. Fu, Y., et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nature Biotechnology. 31, 822-826 (2013).
  13. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31, 827-832 (2013).
  14. Mali, P., et al. CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering. Nature Biotechnology. 31, 833-838 (2013).
  15. Pattanayak, V., et al. High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9 nuclease specificity. Nature Biotechnology. 31, 839-843 (2013).
  16. Shen, B., et al. Efficient genome modification by CRISPR-Cas9 nickase with minimal off-target effects. Nature Methods. 11, 399-402 (2014).
  17. Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154, 1380-1389 (2013).
  18. Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nature Protocols. 9, 1956-1968 (2014).
  19. Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154, 1370-1379 (2013).
  20. Szymczak, A. L., et al. Correction of multi-gene deficiency in vivo using a single 'self-cleaving' 2A peptide-based retroviral vector. Nature Biotechnology. 22, 589-594 (2004).
  21. Carey, B. W., et al. Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 157-162 (2009).
  22. Yagi, T., et al. A novel negative selection for homologous recombinants using diphtheria toxin A fragment gene. Analytical Biochemistry. 214, 77-86 (1993).
  23. Wu, S., Ying, G., Wu, Q., Capecchi, M. R. A protocol for constructing gene targeting vectors: generating knockout mice for the cadherin family and beyond. Nature Protocols. 3, 1056-1076 (2008).
  24. Xue, H., et al. A targeted neuroglial reporter line generated by homologous recombination in human embryonic stem cells. Stem Cells. 27, 1836-1846 (2009).
  25. Liu, Y., Jiang, P., Deng, W. OLIG gene targeting in human pluripotent stem cells for motor neuron and oligodendrocyte differentiation. Nature Protocols. 6, 640-655 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

KnockinargetingRNA sgRNAT7 EndonucleaseOff Target
דור יעיל של כתבים במכות ספציפיים Lineage hiPSC עצבי באמצעות CRISPR / Cas9 ומערכת Nickase זוגי Cas9
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.