מודל פציעת חוט עורק הירך העכבר של היצרות הוא מאתגר מבחינה טכנית. בפרוטוקול זה אנו מציגים את הפרטים הטכניים מפתח חיוניים לביצוע בהצלחה פציעת חוט כדי לגרום neointima העקבי למחקרים של היצרות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
דגם Murine של עורקי היצרות: היבטים טכניים של עצם הירך חוט פגיעה
במאמר זה
סיכום
תקציר
מחלת לב וכלי דם הנגרמת על ידי טרשת עורקים היא הגורם המוביל למוות בעולם המפותח. צמצום של לומן הכלי, בשל התפתחות רובד טרשתית או פקיעת הפלאק הוקם, קוטע את זרימת דם נורמלית מובילה לתחלואות שונות כגון אוטם שריר לב ושבץ. בנהלי מרפאת endovascular כגון אנגיופלסטיקה מבוצעים בדרך כלל לפתוח מחדש את לומן. עם זאת, טיפולים אלה באופן בלתי נמנע נזק קיר הכלי, כמו גם את האנדותל של כלי הדם, מפעילה תגובת ריפוי מוגזמת ופיתוח של לוחית neointimal המשתרעת לתוך הלום גורם היצרות כלי (מחדש היצרות). היצרות נשארה גורם עיקרי לכישלון של טיפולי endovascular לטרשת עורקת. לפיכך, מודלים של בעלי חיים פרה-קליניים של היצרות הם חשובים וחיוני לחקירת מנגנוני pathophysiological כמו גם translational גישות להתערבות של כלי דם. בין כמה experime העכברימודלים פתיחות opening סגירות closures, פגיעת חוט עורק הירך מקובלת כמתאים ביותר ללימודים של היצרות לאחר אנגיופלסטיקה כי זה דומה להליך הצנתור שפוגע גם האנדותל וקיר כלי מקרוב. עם זאת, יש לי חוקרים רבים קושי ניצול מודל זה בשל הרמה הגבוהה של קושי טכני. זה בעיקר בגלל חוט מתכת צריך להיות מוכנס לתוך עורק הירך, שהם כ שלוש פעמים דקות יותר מהחוט, כדי ליצור פגיעה מספיק כדי לגרום neointima הבולט. כאן, אנו מתארים את הפרטים הניתוחיים ההכרחיים כדי להתגבר ביעילות על הקשיים הטכניים העיקריים של מודל זה. על פי הנהלים שהוצגו, ביצוע פציעת חוט עורק הירך עכבר הופכת להיות יותר קלה. ברגע להכיר, ההליך כולו יכול להסתיים בתוך 20 דקות.
מבוא
בעידן היישום המורחב של טיפולים אנדווסקולריים למחלות לב וכלי דם שונות, רסטנוזיס לאחר אנגיופלסטיקה היא אחת הבעיות העיקריות עבור חולים העוברים טיפולים כאלה. פגיעה באנדותל כלי הדם בזמן אנגיופלסטיקה, בתיאום עם הרקע הטרשתי, גורמת לשגשוג יתר של תאי שריר חלק בשכבה המדיאלית, וכתוצאה מכך להיפרפלזיה ניאו-אינטימית. 1,2 מודל בעלי חיים בר-קיימא המסכם היפרפלזיה ניאו-אינטימית לאחר אנגיופלסטיקה חשוב, לפיכך, לא רק לחקירת מנגנוני המחלה אלא גם לפיתוח טיפולים יעילים לטיפול בפתולוגיה זו.
עכברים מייצגים חיית מודל מצוינת לסיכום היפרפלזיה ניאו-אינטימית מהסיבות הבאות: הרקע הגנטי של עכברי הניסוי מבוסס היטב; מגוון רחב של זנים מהונדסים גנטית זמין; 2 קל להשיג חברים מאותו רקע; ועלות בעלי החיים נמוכה יחסית. מודל קשירת עורקים ומודל פגיעת חוט הם שני דגמי העכברים הנפוצים ביותר של היפרפלזיה ניאו-אינטימית הנגרמת מכנית. מודל קשירת העורקים קל ליצירה, אך שונה מבחינה פיזיולוגית מהליך האנגיופלסטיקה בפועל. מודל פגיעת החוט מחקה מקרוב הליכי אנגיופלסטיקה בפועל, אך הוא קשה מבחינה טכנית בשל גודלם הקטן של עורקי העכבר. 2,3 Sata et al. תיארו לראשונה שיטת פגיעה בחוט לעורקי הירך של עכברים המבוססת על המבנה האנטומי של כלי הדם ושימוש בחוט גמיש בגודל מתאים. תוך שימוש בטכניקה זו, הם הצליחו לגרום באופן שחזורי להיפרפלזיה ניאו-אינטימית בזנים שונים של עכברים. 4
למרות שפגיעה בחוט הירך היא מודל מבוסס היטב, חלק מההיבטים הטכניים של הטכניקה מאתגרים מאוד בהשוואה למודלים אחרים כגון קשירה. 5 מטרת מאמר זה היא לתאר בפירוט את נהלי מודל פגיעת חוטי העכבר שלנו, שהוא גרסה שונה של השיטה המקורית של סאטה. ביצענו שני שינויים עיקריים: 1) לולאה רק בעורקים, ו-2) ללא שימוש בלידוקאין.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הצהרת אתיקה:: הערה כל הנהלים עומדים במדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה (אקדמיות העיתונות הארצית, המהדורה 8, 2011), ופרוטוקולים שאושר על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים באוניברסיטת ויסקונסין. כל הניתוחים בוצעו בהרדמה isoflurane (באמצעות שאיפה, לזרום 2 מיליליטר / דקת שיעור), וכל המאמצים שנעשו כדי למזער את הסבל. בעלי חיים היו מורדמים בחדר המלא בהדרגה עם CO 2.
1. אינדוקציה של הרדמה כללית וחתך בעור
- השתמש זכר C57BL / 6 עכברים עם גיל 12-16 שבועות ומשקל של 23-28 גרם. להרדים את החיה על ידי isoflurane באמצעות מנגנון הרדמה במעגל סגור. לאשר הרדמה תקינה על ידי צובט את הבוהן שלו. החל משחת דמעות מלאכותית על עיניים כדי למנוע יובש.
- מניחים את העכבר במצב שכיבה עם האיבר השמאלי האחורי מעט נחטף ומשותף sl הברךמכווץ ightly. לגלח את השיער סביב אזור הירך השמאלי העליון ולחטא את העור עם chlorhexidine, הוחל שלוש פעמים באמצעות החלת מכותנה שקצה סטרילי. השתמש מעקר חרוז חם כדי לשמור על המכשירים מעוקרים במהלך הניתוח.
- הנח וילון גזה מעוקרת על רגל השמאל. ביצוע חתך 1.5 סנטימטרים ישר, אורך עור על הירך המדיאלי השמאלית ממפרק הברך למפשעה (איור 1 א).
2. חשיפה של עורק הירך וסניפים
הערה: איור 1 מציג את האנטומיה כלי דם הגולמית בחלק העליון של הירך. עורק הירך השטחי (SFA) ניתן לצפות באמצעות מיקרוסקופ לנתח כאשר החתך בעור נעשה כראוי לאורך קו האמצע של הירך המדיאלי.
- פתח את fascia הדק מעל SFA עם פינצטה בסדר, ואז לולאת SFA עם 9-0 תפר ניילון.
הערה: בתהליך זה, עצב הירך הוא לשים בקלות כIDE, אבל וריד הירך הסמוך דורש תשומת לב משום שקירה הוא כל כך דק שבו בקלות perforates והמדמם. טכניקת המפתח היא להתמקד בעורק עצמו; כל עוד לנתיחה מתבצעת בסמוך לעורק, וריד כל נזק מקרי הוא מיותר. - ברגע שSFA סובב, להחזיק את התפר עם מלקחיים יתוש ולמשוך אותו מעט כלפי מטה. תמרון זה עושה נתיחה נוספת קל יותר, אבל כדי למנוע נזק לעורק לא למשוך יותר מדי בכוח.
- תמשיך לנתח את העורק proximally לחשוף ולולאת עורק הירך הנפוצה (CFA) עם 9-0 תפר ניילון.
הערה: בדרך כלל, looping CFA בדיסטלי הצבע על העורק ברום הבטן (איור 1) הוא מספיק להכנסת חוט. החזק את תפר לולאת CFA עם מלקחיים יתוש באותה הדרך. - משוך את תפר לולאת CFA כלפי מעלה וכלפי מטה תפר לולאת SFA לחשוף את הסתעפות של SFA ועורק הירך עמוק (DFA). DFA, הסניף המרכזי של CFA,הולך לכיוון שריר הירך (איור 1).
הערה: החוט יתווסף מDFA מאוחר יותר. - לולאת DFA במשנה זהירות בגלל הווריד הסמוך הוא סבוך מתחת לעורק. במקרה של דימום מהעורק, דחיסה פשוטה 30 עד 60 שניות עם גזה היא בדרך כלל מספיק כדי לייצר עצירת דימום.
- ברגע שDFA סובב עם 9-0 תפר ניילון, לוודא שכל שלוש לולאות התפר נמצאות בעמדות הנכונות שלהם (איור 2 א).
- להמשיך עם דיסקציה של DFA distally ולקשור את העורק בנקודה רחוקה ככל האפשר מההסתעפות. חותך תפר נוסף אך להשאיר באורך מסוים, כך שיכולים להיות מוחזקים שני הקצוות עם מלקחיים יתוש, שלייצב את DFA מה שהופך את הכנסת החוט קל יותר.
3. יצירת חוט פגיעה
- הכנס חוט באמצעות DFA
- מסננים את תפרי CFA, SFA, וDFA להקים hemostat זמני.
- לעשות חור קטן בDFעם microscissors. הכנס את הטיפים של microtweezers המעוקל כדי להרחיב את החור גדול מספיק עבור חוט בקוטר 0.015 אינץ '(איור 2 מדגים את ההבדל בגודל בין העורק והחוט).
- לפני ביצוע חור בDFA, לשחרר את תפר לולאת CFA ועדינות מהדקת / לסחוט את DFA מספר פעמים עם microtweezers שקצהו משעמם. התמרון הזה מרחיב את הקוטר העורק להפליא כדי להקל על החדרת התיל. מלחלח את החוט ביסודיות עם PBS חשוב גם להחדרה חלקה.
- בעת ביצוע חור בDFA, לא לחתוך את הדופן העורקת, אבל להפוך את צביטה בצורת V קטנה ולצבוט את הדש עם microtweezers המחודד למניפולציה.
- הכנס את החוט דרך החור כראוי-מורחב על DFA. בעדינות לקדם את החוט לכיוון עורק הכסל תוך התרופפות תפר הלולאה סביב CFA. 5-8 מ"מ זה מספיק כדי לכסות את כל אורך CFA ברוב המקרים (איור 2 ג ). אל תכניס את החוט בכוח כניקוב עורקים גורם בדרך כלל לאובדן של העכבר. קיצור החוט לכ 15 מ"מ באורך מסייע בטיפול.
- השאר חוט בתוך עבור 1 Min
- לאחר הכנסת החוט לאורך האופטימלי, להשאיר אותו לדקות 1 ללהתמתח יתר הדפנות העורקים. להרטיב את החוט ועורקים עם PBS כדי למנוע התייבשות. תפר 9-0 ניילון נוסף ניתן להציב סביב הפרוקסימלי DFA לנקודת תיל-ההכנסה בזמן ההמתנה הזה. תפר זה ישמש מאוחר יותר כדי לסגור את החור בDFA לאחר פינוי התיל.
- אחזר חוט ולחדש את זרימת הדם
- החזק את החוט עם מלקחיים cannulation הכלי, ולמשוך בחזרה אותו בעדינות; החוט צריך להאסף בצורה חלקה. כדי להתגבר על כל התנגדות, בדרך כלל נגרמת על ידי דבקות של החוט לדפנות העורקים, שהפיל את החוט עם סיבוב עדין מועיל. שוב, תמרון חזק יכול לגרום לאובדן של בעלי חיים.
- חרה אחזור התיל, לקשור DFA בנקודת הסתעפות עם תפר 9-0 ניילון. לא לקשור קרוב מדי להסתעפות, שיסכן את תזרים הדם לSFA.
- שחרר את לולאות תפר SFA וCFA לחדש את זרימת הדם הנורמלית. שים לב שCFA מורחב היטב על ידי החדרת תיל (איור 2 ד).
4. עור סגר ולאחר ניתוח טיפול
- שליטת מדמם. דליפה קטנה יכולה להיעצר על ידי דחיסה פשוטה; כמה דימומי עורקים גדולים ידרשו תפרים עם תפר 11-0 ניילון. עורקים נתפרו אלה סופו של דבר יגרמו לחסימת עורקים.
- סגור את עור פצע עם סיכות עור (בדרך כלל 3-4 סיכות). לשמור על אזור הפצע מעוקר על ידי יישום פתרון כירורגי chlorhexidine.
- החל טיפולים שלאחר ניתוח. לשלוט בכאב של העכבר עם זריקות תת עורית של עצירות. שמור את העכבר על כרית החימום עד שהוא חזר סוףficient תודעה לשמור כיבה sternal. הבית אותו בכלוב נקי בלי החברה של בעלי חיים אחרים, עד שהתאושש לחלוטין.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
ארבעה שבועות לאחר ניתוח, לקצור את עורק הירך-נפצע חוט ולעשות דגימת בלוק פרפין לנתח את היווצרות neointima. לגרום הרדמה כללית כפי שתואר לעיל. פתח את החזה באופן מיידי ולהכניס מחט פרפר 20-מד לחדר השמאלי. חבר את הקו לבקבוק עירוי. בצע קיבעון זלוף באמצעות עירוי טפטוף של PBS ואחריו 4% paraformaldehyde (בדרך כלל 10-20 מיליליטר, כל אחת). בקבוק העירוי ממוקם כ 140 סנטימטר גבוה יותר מרמת הלב כדי שבעל החיים הוא perfused בpressure.Wait הפיזיולוגי במשך 20 דקות ואז לקחת את CFA-נפצע התיל ול...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הליך פציעת החוט הוא ישים כל עוד המבנים אנטומיים שלהם דומים. 4 במאמר זה את כל הזנים של עכברים, שנהגנו C57BL / 6 עכברי זכרים עם גיל 12-16 שבועות. כפי שלמדנו מהמחקרים הראשוניים שלנו, עורקי הירך של עכברים צעירים מ -10 שבועות הם לעתים קרובות כל כך קטנים שהכנסת חוט היא די מאתגרת. מצד השני, הכנסת חוט בעכברים מבוגרים מ -16 שבועות היא מבחינה טכנית קלה יותר אבל נוטה לגרום להיפרפלזיה neointimal משתנה יותר. נקבות עכברים נוטים ליטול על עצמו פחות היווצרות neointimal מאשר גברים. למרות...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי פרס החוקר החדש של תוכנית השותפות של ויסקונסין (מזהה 2832), מענק R01 של מכון הלב, הריאות והדם הלאומי (HL-068673) ומענק הכשרה T32 (HL-110853). אנו מודים לקבוצה של ד"ר מלינה קיבה באוניברסיטת נורת'ווסטרן על מתן מידע מועיל.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מדריך חוט ליבה קבוע | טבח | G02426 | קוטר 0.015 אינץ ', |
| מלקחיים התרחבות | Roboz | RS-4927 | מעוקל, טיפים קהים |
| Dumont Tweesers #5 | World Precision Instruments | 14095 | קצות ישרים וחדים |
| מלקחיים לקנולציה של כלי דומונט | דיוק עולמיים | 503373 | |
| מספריים McPherson-Vannas | World Precision Instruments | 501234 | |
| מלקחיים נגד יתושים | מכשירים מדויקים בעולם 501291 | ||
| Ethilon ניילון תפר 9-0 | Ethicon | 7717G | 9-0, שחור ניילון מונופילמנט |
| מיקרו AROSuture, סטרילי 11-0, 70 מיקרומטר, MET Point | AROSurgical | VT4A00N07 | 11-0, שחור ניילון מונופילמנט |
| 3M מדויק Multi-Shot DS עור חד פעמי מהדק | 3M | DS-25 |
מקורות
- Dzau, V. J., Braun-Dullaeus, R. C., Sedding, D. G. Vascular proliferation and atherosclerosis: new perspectives and therapeutic strategies. Nat Med. 8 (11), 1249-1256 (2002).
- Hui, D. Y. Intimal hyperplasia in murine models. Curr Drug Targets. 9 (3), 251-260 (2008).
- Ferns, G. A., Avades, T. Y. The mechanisms of coronary restenosis: insights from experimental models. Int J Exp Pathol. 81 (2), 63-88 (2000).
- Sata, M., et al. A mouse model of vascular injury that induces rapid onset of medial cell apoptosis followed by reproducible neointimal hyperplasia. J Mol Cell Cardiol. 32 (11), 2097-2104 (2000).
- Xu, Q. Mouse models of arteriosclerosis: from arterial injuries to vascular grafts. Am J Pathol. 165 (1), 1-10 (2004).
- Lv, L., Meng, Q., Ye, M., Wang, P., Xue, G. STAT4 deficiency protects against neointima formation following arterial injury in mice. J Mol Cell Cardiol. 74C, 284-294 (2014).
- Zhu, B., Kuhel, D. G., Witte, D. P., Hui, D. Y. Apolipoprotein E inhibits neointimal hyperplasia after arterial injury in mice. Am J Pathol. 157 (6), 1839-1848 (2000).
- Fu, Y., Duru, E. A., Davies, M. G. Effect of metabolic syndrome on the response to arterial injury. J Surg Res. , (2014).
- Kuhel, D. G., Zhu, B., Witte, D. P., Hui, D. Y. Distinction in genetic determinants for injury-induced neointimal hyperplasia and diet-induced atherosclerosis in inbred mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 22 (6), 955-960 (2002).
- Cooley, B. C. Mouse strain differential neointimal response in vein grafts and wire-injured arteries. Circ J. 71 (10), 1649-1652 (2007).
- Ishigami, N., et al. Deficiency of CuZn superoxide dismutase promotes inflammation and alters medial structure following vascular injury. J Atheroscler Thromb. 18 (11), 1009-1017 (2011).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
