הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

דור והארכת כלי רקמות מהונדסות במודל עכבר

11.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/52565

⸱

18 במרץ 2015

 ,  ,  ,  , 
1Cardiovascular Division, King's College London BHF Centre

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצר שתלי כלי רקמה מהונדסת, כי הם פונקציונליים להשתלה לעכברים על ידי זריעה כפולה תאי גזע pluripotent מושרה באופן חלקי (PiPSC) - נגזר תאי שריר חלק וPiPSC - תאי האנדותל נגזרו על bioreactor פיגום כלי decellularized.

תקציר

בניית צינורות כלי דם היא אסטרטגיה בסיסית לתיקון כירורגי של כלי דם פגומים ופגועים כתוצאה ממחלות לב וכלי דם. הפרוטוקול הנוכחי מציג אסטרטגיה יעילה וניתנת לשחזור שבה ניתן ליצור שתלי כלי דם מהונדסים רקמות פונקציונליות באמצעות תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים חלקית (PiPSC) מפיברובלסטים אנושיים. עיצבנו ביו-ריאקטור פיגום כלי דם נטול תאים, המחקה מקרוב את מבנה חלבון המטריצה וזרימת הדם הקיימת בתוך כלי טבעי, לזריעה של תאי אנדותל PiPSC או תאי שריר חלק לפני השתלה בעכברים. גישה זו הוכחה כמועילה מכיוון שעכברים חסרי חיסון שהושתלו בשתלים שמקורם ב-PiPSC הציגו שיעור הישרדות מוגבר באופן ניכר 3 שבועות לאחר הניתוח. פרוטוקול זה מייצג כלי רב ערך לרפואה רגנרטיבית, הנדסת רקמות וטיפול תאי ספציפי למטופל בעתיד הקרוב.

מבוא

הבנייה של צינורות כלי דם היא אסטרטגיה בסיסית לתיקון כירורגי של כלי נפגעו ונפצעו כתוצאה ממחל לב וכלי דם. עד כה, חומרי שתל המשמשים בניתוחים כוללים ביולוגית פולימרים סינטטיים (polytetrafluoroethylene [טפלון], polytetrafluoroethylene המורחב [ePTFE; גור-Tex] או terephthalate פוליאתילן [דקרון]), allografts, רקמת אוטולוגי (קרום הלב או וריד saphenous) וxenografts 1. בעוד שתלי מלאכותיים (למשל, גורטקס ודקרון) הם נפוצים ביותר, חומרים אלה עלולים לגרום לסיבוכים לטווח קצר וארוך רבים הכוללים היצרות, בתצהיר סידן, thrombo-אמבוליזציה וזיהומים. למרות שמטופלים עם שתלים ביולוגיים נוכחי עם ירידה באירועי thrombo-תסחיפים, הם עדיין נתקלים במגבלות כגון אי ספיקה משנית שתל ועמידות מקוצרת בשל הסתיידות השפלה 2. לכן, למרות שיפור המשמעותי בt כירורגיתechniques במשך השנים, החוקרים וקלינאים עדיין עמוס עם הצורך בזיהוי הצינור האידיאלי למחלות לב וכלי דם. לאחרונה, תחום המחקר של הנדסת רקמות כלי דם יצר מושג שבו תאים משולבים פיגומים מתכלים, במטרה ליצור סביבת biomimetic שמגלמת כלי פונקציונלי להשתלה מוצלחת 1. ביסודו, הצלחתו של בונה כלי הדם תלויה בשלושה מרכיבים חיוניים; תאים המרכיבים את הפיגום, כלומר, שכבה פנימית של תאי האנדותל ושכבת תאי שריר חלק, פיגום המכיל המטריצה ​​תאית המתאימה כדי לספק תכונות מכאניות דומות לכלי הדם המקומיים, ואיתות המולקולרית / סלולרית שנדרש לייזום / ויסות תיקון.

patency שתל לטווח ארוך ופיתוח מתמשך של הניאו-רקמות תלויים מאוד בזריעת תאים יעילה של פיגומים, הereby טיוח ההחלטה של ​​סוג תא חשיבות קריטית. מספר דיווחים להדגים את השימוש באנדותל הבוגר ותאי שריר חלק ממקורות שונים לפתח צינורות בקוטר קטן 3-6. למרות מבטיח, חוסר כלי אוטולוגי מספיק כדי להשיג אנדותל הבוגר ותאי שריר חלק יישארו נטל ניכר. לאחרונה, תאי גזע ממקורות שונים שנוצלו עבור יישומי הנדסת רקמות וכלי דם. תאים אכן, תאי גזע pluripotent מגוון של סוגי תאי גזע כוללים תאי גזע עובריים 7, מושרה (iPSCs) 8,9, PiPSC 10,11, נגזר מח עצם mononuclear 12, בתאי גזע mesenchymal 13, ותאי האנדותל וקיר כלי למבוגרים -derived תאי גזע אנטיגן-1 (SCA-1) + תאי גזע / אב 14,15 כולם הודגמו להיות מסוגל בידול לתאי האנדותל או פונקציונלי או שריר חלק בתגובה לתקשורת מוגדרת ותנאי תרבות. יתר על כן, יכולת התחדשות עצמית בלתי מוגבלת של תאי הגזע להפוך אותם מועמדים טובים יותר בניגוד לאנדותל הבוגר ותאי שריר חלק שיכול רק לחלק למספר מוגבל של פעמים לפני שעברו למעצר צמיחה והזדקנות.

הבחירה של חומר פיגום כדי ליצור כלי רקמות מהונדס מוצלחות להשתלה תלויה במספר גורמים כגון biocompatibility, תכונות ביו-מכאניות, ושיעור ההתכלות. ביסודו, חומרים המשמשים ליצור פיגומים לשתלים צריכים להיות מתכלה ולא הר תגובות חיסוני נמען מיותר. בנוסף, הוא חייב להקיף נקבוביות מתאים ומייקרו עבור קובץ מצורף תא והישרדות שלאחר מכן. עד כה, החומרים הנפוצים ביותר בשימוש לפיגומים בהנדסת רקמות וכלי דם כוללים פולימרים של חומצות polyglycolic, חומצת polylactic, וε-caprolactone פולי 16. לאחרונה, יש לי חומרים ביולוגיים decellularizedגם יושם בהצלחה מסוימת. מספר מעבדות הראו כי זריעה אנושית decellularized, כלבים או כלי החזיריים עם תאי אוטולוגי סיפקה שתל ביולוגי שהתנגד קרישה והיפרפלזיה intimal 17-19. אסטרטגיות אחרות בהנדסת רקמות וכלי דם כוללות שתלים תאיים כלי דם המבוססים על חלבוני מטריצה ​​למשל, זריעת תאים בג'ל הפיברין 13 וגיליונות תא יצירה ללא תמיכת פיגום 20, 21.

הפרוטוקול הנוכחי מדגים את הבידול של PiPSC האנושי לאנדותל הפונקציונלי ותאי שריר חלק, הדור של bioreactor המורכב מפיגום כלי decellularized נמל תאי כלי דם נגזר PiPSC פונקציונליים, והשתלה של כלי הרקמה מהונדסות לכשל חיסוני משולב חמור (SCID עכברים). PiPSC הוא סוג תא אופטימלי לשימוש עבור הנדסת רקמות של שתלי כלי משום שתאים אלה לא יוצרים גידולים בעכברים או להעלות אתי ותגובות allo-חיסונית. יתר על כן, יש לנו הראינו כי האסטרטגיה ליצירת פיפס-אנדותל תאים ופיפס חלק תאי שריר היא יעילה והשחזור 10,11. לאחר מכן, מתכננים כלי decellularized לזריעה של תאי כלי דם נגזר PiPSC לחקות באופן הדוק חלבוני מטריצה ​​שקיים בתוך כלי ילידים, וכך לשפר את יעילות השתלה והישרדות. יתר על כן, decellularization של כלי לפני זריעת PiPSC מונע ההתרחשות של תגובות דלקתיות רכובים על ידי סוגי תאים חיסוניים כגון מקרופאגים. יותר מכך, פרוטוקול זה לא רק מייצג מתודולוגיה כדי ליצור מבטיח צינורות כלי דם לתרגום לבני אדם, אלא גם מספק אמצעי רב ערך של לימוד והבנת המנגנונים המולקולריים השולטים בהתחדשות רקמת כלי דם באמצעות מודלים עכבר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

לבצע את כל הניסויים בבעלי החיים על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לשימוש וטיפול בחי מעבדה.

1. הכנת תרבות מדיה

  1. הפוך תקשורת ותרבות לשורת תאי פיברובלסטים אנושית CCL-153: F-12K בינוני, 10% בסרום שור עוברי (FBS) ו -100 U / ml פניצילין וסטרפטומיצין.
  2. הפוך תכנות מחדש מדיה עבור דור PiPSC: בינוני הנשר שונה של Knockout Dulbecco (DMEM) המכיל 20% החלפת סרום Knockout, 0.1 מ"מ β-mercaptoethanol, 0.1 מ"מ המינימלי בינוני (MEM) שאינו חיוני חומצות אמינו, 10 ng Essential / בסיסי פיברובלסטים Growth Factor מיליליטר 2 / פניצילין (bFGF-2) ו- 100 מיליליטר U וסטרפטומיצין. להוסיף bFGF-2 טרי בכל פעם לפני השימוש באמצעי התקשורת.
  3. בידול לעשות בידול מדיה (DM) כדי לעורר תאי שריר חלק (SMC): α-ממ מדיה המכילה 10% FBS, גורם גדילה 0.1 מ"מ β-mercaptoethanol, 100 U / ng פניצילין וסטרפטומיצין ו -25 מיליליטר / מיליליטר נגזר טסיות הדם(PDGF-ββ).
  4. הפוך האנדותל בידול מדיה (EC-DM) כדי לעורר תאי אנדותל בידול (EC): צמיחת האנדותל תקשורת-2 (EGM-2) מדיה המכילה 50 ng / ml כלי דם האנדותל Growth Factor (VEGF) ו- 100 U / ml פניצילין וסטרפטומיצין.

2. Fibroblasts תכנות מחדש האנושי לתאי גזע pluripotent חלקית מושרים (PiPSC)

  1. שורת תאי פיברובלסטים אנושית תרבות CCL-153 בצלוחיות מצופים פתרון ג'לטין 0.04% במדיום התרבות.
  2. תאי מעבר כל 3 ימים ביחס של 1: 6. השתמש בתאים לפני המעבר 9 ליעילות אופטימלית של דור PiPSC. תאים מוכנים transfection עם הגיע 80 - confluency 90%.
  3. Linearize pCAG2LMKOSimO פלסמיד polycistronic המכיל 4 גורמי תכנות מחדש גורם שעתוק 4 (Oct4) מחייב octamer, Sox2, גורם כמו-Kruppel 4 (KLF4) ו- C-MYC (pCAG-OSKM). לעכל 5 מיקרוגרם של פלסמיד עם 5 יחידות של אנזים הגבלת PvuI במשך 3 שעות על 37 מעלות צלזיוס. לטהרפלסמיד עם ערכה מסחרית על פי הפרוטוקול של היצרן.
  4. Transfect 2 x 10 6 fibroblasts אדם עם 4 מיקרוגרם של פלסמיד pCAG-OSKM לינארית על ידי electroporation עם ערכת פיברובלסטים עור האנושיים nucleofection (NHDF) על פי הפרוטוקול של היצרן. בעדינות תאי זרע transfected על 0.04% בקבוק T25 מראש ג'לטין מצופה המכיל 5 מיליליטר של תכנות מחדש Media מראש חימם.
  5. לאחר 24 שעות, לשנות בינוני עם תוספים של 25 מיקרוגרם / מיליליטר נאומיצין כדי לבחור אוכלוסייה טהורה של תאי transfected.
  6. שנה בינונית בכל יום אחר, עד שיום 4.
    הערה: fibroblasts אדם הפך PiPSC לאחר 4 ימים של תכנות מחדש.

3. בידול של PiPSC להאנדותל ותאי שריר חלק

  1. PiPSC זרע על מנות מצופים מראש IV קולגן המכילות DM במשך 4 ימים כדי לגרום להתמיינות לSMCs. שנה בינונית בכל יום אחר, עד שיום 4.
  2. PiPSC זרע על קולגן IV ג מנות מצופים מראשontaining אנדותל-DM במשך 6 ימים כדי לגרום להתמיינות לתאי אנדותל. שנה בינונית בכל יום אחר, עד שיום 6.

4. decellularized אב העורקים שתל הכנה

הערה: כל הפתרונות והציוד צריכים להיות סטרילי.

  1. להקריב את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם ולתקן את העכבר במצב שכיבה תחת מיקרוסקופ לנתיחה.
  2. לחתוך את עצם החזה וסביב כלוב הצלעות כדי לפתוח את חלל בית החזה. הסר את הלב, ריאות והוושט כדי לחשוף את אב העורקים. הוצא בעדינות את שומן פרי אב העורקים עם מלקחיים.
  3. חותך את אב העורקים מהקצה הקדמי עם מספריים ובעדינות להחזיק את הקצה עם מלקחיים בוטים. לנתק את אב העורקים מעמודת עמוד השדרה מאחור על ידי נתיחה בוטה. לסגור היטב את כל העורקים מסתעפים מאב העורקים על ידי קשירה עם electrocoagulator דו קוטבי וחיתוך מהקצה הרחוק של קשירה עם מספריים.
  4. השתמש במזרק 5 מיליליטר לשטוף את לומן אב העורקים עם 3 מ 'l של תמיסת מלח המכילה של הפרין 100 U כדי למנוע היווצרות קרישי דם.
  5. חותך את הקצה האחורי של אב העורקים לפני שהסניפים לכליות. שמירה על השלמות של אב העורקים היא מאוד חשובה במהלך ההליך כולו.
  6. לשטוף את לומן אב העורקים עם 5 מיליליטר של תמיסת 0.075% סולפט dodecyl נתרן (SDS) בדילול מלא בופר פוספט (PBS).
  7. משרים את אב העורקים החזי ב0.075% SDS פתרון בצלחת פטרי 10 סנטימטרים. מניחים את צלחת פטרי על שייקר מסלולית לשעה 2 ב 150 סל"ד ב RT.
  8. לשטוף את לומן אב העורקים עם 5 מיליליטר של PBS.
  9. משרים את אב העורקים בPBS בצלחת פטרי 10 סנטימטרים. מניחים את צלחת פטרי בייקר מסלולית לשעה 2 ב 150 סל"ד ב RT. רענן PBS כל 20 דקות.
  10. לשטוף את לומן אב העורקים עם 5 מיליליטר של PBS.
  11. שמור שתל אב העורקים decellularized PBS ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע.

5. Dual זריעה של PiPSC וBioreactor אוויר

הערה: כל הפתרוןים וציוד צריך להיות סטרילי. לבצע את כל הפעולות בברדס בתרבית רקמה.

  1. להרכיב את זרימת bioreactor המעגל כפי שמודגם באיור 1. חבר תא דגירה, מאגר המדיה, משאבת peristaltic וקאמרית עמידה בצינורות. נפח מינימאלי של המדיום הדרוש למחזור הוא 40 מיליליטר.
  2. תנאי מוקדם כלי decellularized עם מדיום תרבות על ידי שריה באב העורקים הבינוני DM בצלחת פטרי 10 סנטימטרים. מניחים את צלחת פטרי בייקר מסלולית עבור שעה 1 ב 50 סל"ד ב RT.
  3. הכנס צינורות ניילון אורך 1 סנטימטר (0.9 מ"מ OD, מ"מ ID 0.75) לשני הקצוות של כלי השיט decellularized תחת מיקרוסקופ. לקשור את הכלי וצינורות עם 8-0 תפרי משי.
  4. להרכיב שתל אב העורקים decellularized בתא הדגירה על ידי חיבור צינורות ניילון עם יציאות כניסה ויציאה (1/32 "צינורות) מקיר התא. לשמור על תא דגירה עם 5mls של מדיום בכל פעם.
  5. Trypsinize PiPSC על ידי הוספה מראש התחממתיטריפסין כדי לכסות את המנה התרבות ונער בעדינות את הצלחת 10 פעמים. מחק את טריפסין ולהשאיר את הצלחת בחממה במשך 2-3 דקות. הוסף בינוני תרבות המחוממת מראש בצלחת ומערבבים בינוניים עם התאים.
  6. ספירת מספר תאים באמצעות hemocytometer. צנטריפוגה שני aliquots של השעיות תא המכילות 5 x 10 5 תאים כל אחד במשך 5 דקות ב 300 x גרם. לשאוב supernatant לחלוטין.
  7. לאחר aspirating supernatant לחלוטין, resuspend גלולה 1 של כדורי תא פיפס ב -50 μl של DM. להזריק השעיה תא זה ללומן כלי decellularized.
  8. לאחר מכן, resuspend תא גלולה פיפס האחר בMatrigel של 100 μl. בזהירות פיפטה את התערובת על שתל אב העורקים decellularized.
  9. חכה במשך 10 - 15 דקות עד שהתערובת הופכת למדינה כמו ג'ל ובאופן שווה עוטף את פני השטח החיצוניים הכלי. למלא את תא הדגירה עם DM.
  10. מניחים את כל bioreactor הגדרה ב5% CO 2 באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס. באופן ידני לסובב את שתל decellularized 90 ° סביב ציר האורך כל חצי שעה בשעה 2 הראשונה.
  11. שמור תרבות סטטית עבור 12 שעות כדי לאפשר הידבקות תא.
  12. לספק DM באמצעות לומן על ידי משאבת peristaltic לגרום להתמיינות תאי שריר חלק. התחל קצב זרימה ראשוני בשעה 5 מיליליטר / דקה ועלייה בשלבים עד 20 מיליליטר / דקה מעל 24 שעות.
  13. שמור את קצב זרימה הבינוני במחזור של 20 מיליליטר / דקה למשך 24 שעות.
  14. עצור את הזרימה בינונית ולהעביר את bioreactor יציאה של החממה.
  15. Re-זרע לומן של השתל עם PiPSC. Trypsinize, לספור ו צנטריפוגות 1 x 10 6 PiPSC כמו בשלבים 5.5-5.6. Resuspend התאים 50 μl של EGM-2 בינוניים מכיל 50 ng / ml VEGF. להזריק את תערובת התאים לתוך לומן של השתל.
  16. לשנות את המדיום בתא הדגירה וכל מחזור לEGM-2 בינוניות מכיל 50 מיליליטר VEGF / ng לגרום להתמיינות אנדותל.
  17. הזז את bioreactor שוב את הגדרת החממת דואר. באופן ידני לסובב את השתל 90 ° כל 30 דקות בשעה 2 הראשונה ולאחר מכן לשמור על תרבות סטטית עבור 12 שעות.
  18. התחל במחזור הזרימה בין 5 מיליליטר / דקה ועלייה בשלבים ל -35 מיליליטר / דקה. שמור את קצב הזרימה ב 35 מיליליטר / דקה במשך 5 ימים. שינוי במחזור והתא בינוני בכל יום אחר.
  19. לקצור את השתל המהונדס להשתלה נוספת לעכבר.

6. הארכת כפול זרע PiPSC השתל לתוך עכברים

  1. SCID השימוש NOD.CB17-Prkdc / עכברי זכרי NcrCrl כמקבלי שתל כלי. תמיד להבטיח שהעכברים כ -10 שבועות, שוקלים בערך 25 - 35 גרם, ונמצאים במצבים בריאותיים טובים.
  2. הרדימי עכבר נמען על ידי מתן שילוב של Hypnorm (25 מ"ג / קילוגרם) וHypnovel (25 מ"ג / קילוגרם) intraperitoneally. החל משחת עיני וזלין על עיניים כדי למנוע יובש ואילו בהרדמה. לאשר הרדמה יעילה על ידי הבטחה שיש לי עכברים שרירים רגועים ונושמים בהתמדה.
    1. תקן את העכבר במצב שכיבה עם צווארה המגולח ומורחב. לנהל סולפט אטרופין (1.7 מ"ג / קילוגרם) בשילוב עם חומרי ההרדמה על מנת להבטיח כי בדרכי הנשימה העכבר נשארה ברורות.
  3. הכן חתך קו האמצע מהלסת התחתונה לעצם החזה של העכבר. תחת מיקרוסקופ לנתח עם 5 להגברה של פי 10, להרים את בלוטות רוק תקין רוחבית ולהסיר את השרירים cleidomastoid זכות לחשוף את עורק התרדמה המשותף תקין.
  4. בעדינות להסיר רקמות המצורפות לגייס את עורק התרדמה המשותף הימני מהקצה הדיסטלי לקראת הסוף הפרוקסימלי. ולקשור את החלק האמצעי של עורק התרדמה המשותף פעמיים עם תפר משי 8-0 ולנתח בין שני הקשרים.
  5. עובר דרך שרוול עשוי מצינור ניילון autoclavable בכל קצה ספינה ולתקן כל קצה עם מהדק microhemostat.
  6. הסר עניבת תפר בקצה אחד ולהחיל ירידה של הפרין (100 U / ml). מייד לאחר מכן, להפוך את הקצה הדיסטלי של העורק דואר כדי לכסות את כל גוף השרוול ולתקן את הספינה ההפוכה עם תפר 8-0 משי לשרוול.
    1. חזור על אותו ההליך לחלק האחר של העורק. עורק סומק עם תמיסת מלח כדי להסיר קרישי דם.
  7. שתל שתל כלי decellularized בין שני קצוות של עורק התרדמה על-ידי החלקת קצות כלי decellularized של מעל אזיקי העורק ולתקן את זה עם 8-0 תפרי משי. הסר מלחציים כלי דם משני מסתיים לפני הערכת הפעימה של השתל.
  8. הנח את בלוטת רוק הזכות חזרה למקומו המקורי. סגור את העור על המיקום כירורגית עם תפר שהופסק באמצעות תפר 6-0 polyglactin.
  9. באופן עקבי לשמור סימנים חיוניים של עכבר לאחר ההליך הושלם, עד שיתחדש תודעה. להקריב את עכברי נמען באמצעות שתלי נקע וכלי קציר צוואר רחם או hr 24 או 3 שבועות מאוחר יותר לניתוח נוסף.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הדור המוצלח של PiPSC אושר 4 ימים לאחר nucleofecting fibroblasts אדם עם פלסמיד pCAG2LMKOSimO ינארית ביצוע 4 גורמי שעתוק, Oct4, Sox2, KLF4 וc-MYC (OSKM). PiPSC מוצג פנוטיפ ניכר מובהק בהשוואה לfibroblasts (איור 2 א) והביע גורמי תכנות מחדש 4 בmRNA (איור 2) וחלבון רמות (איור 2 ג) 10. היעילות של שתל כלי דם המבוסס על PiPSC תלויה מאוד ביכולת של PiPSC להתמיין לשתי שושלות שריר אנדותל וחלקות. לכן זה קריטי כדי לאשר מאפיינים אלה של ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקול הנוכחי מצביע על צליל אסטרטגיה, מהירה, פשוטה, יעילה ושחזור שבו יכולים להיות שנוצרו כלי רקמה מהונדסות תפקודיים באמצעות PiPSC מfibroblasts האנושי. טכניקה זו מהווה כלי רב ערך לרפואת רגנרטיבית, הנדסת רקמות וטיפול בתאים שעלולים להיות מטופל ספציפי בעתיד הקרוב. שלבים קריטיים כדי להבטיח את היעילות של הפרוטוקול כוללים הכנת PiPSC, הכנת שתלי אב העורקים סטרילי וdecellularized באופן מלא, זריעה מוצלחת ובידול של PiPSC בפיגומים ועקרות שמירה של שתלי אב העורקים בbioreactor כלי הדם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אי לנו אינטרסים כלכליים סותרים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי קרן הלב הבריטית וקרן אוק.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
פיברובלסטים אנושיים CCL-153ATCCCCL-153פיברובלסטים עובריים אנושיים טרום לידתיים
ATCC F-12K מדיום (שינוי קייגן של מדיום F-12 של האם)ATCC30-2004
סרום בקר עובריATCC30-2020
נוקאאוט מדיום DMEM המותאם לתאי גזע עוברייםטכנולוגיות חיים (Gibco)12660-012
טכנולוגיות חיים להחלפת סרום נוקאאוט(Invitrogen)10828-028
Human Basic FGF-2 Miltenyi Biotech130-093-837
אלפא-MEM טכנולוגיות חיים בינוניות(Invitrogen)32571093
PDGF אנושי D System120-HD-001
תמיסת ג'לטין 2%SigmaG1393
פלסמיד 20866: pCAG2LMKOSimO (SOX2, OCT4, KLF4, C-MYC)Addgene20866
  אנזים הגבלת PvuIניו אינגלנד BiolabsRO150S
SureClean PlusBiolineBIO-37047
ערכת Nucelofection (ערכת NHDF)LONZAVPD-1001
NeomycinSIGMAG418
KL 1500 LCD, תאורה למיקרוסקופיה סטריאוSCHOTTKL 1500 LCDתאורת אור קר למיקרוסקופיה
סטריאוניקון זום סטרומיקרוסקופ SMZ800ניקוןSMZ800
הפרין נתרן מלחסיגמאH3393
10% SDS תמיסת מלאי ריאגנט ביולוגיה מולקולריתSevern BiotechCAS 151-21-3
פוספט של Dulbecco בופר מלחסיגמאD8537
מטריג'ל (10 מ"ג/מ"ל)BDA6661
שייקר IKA Vibrax עם פלטפורמת טלטול VX 7 ג'פסון בולטון, ג'אנקה & KunkelS32-102
Masterflex L/S כונן משאבה דיגיטליCole-ParmerWZ-07523-80
Masterflex L/S 6 ערוצים, ראש משאבת מחסנית 6 רולרCole-ParmerEW-07519-15
Masterflex L/S מחסניות גדולות לראש משאבהCole-ParmerEW-07519-75
צינורות משאבת סיליקון מרפאים פלטינה Masterflex, L/S 14, 25 רגלCole-Parmer WZ-96410-14עוברים דרך המשאבה הפריסטלטית
0.5 מ"מ ID, צינורות סיליקון OD 0.8 מ"מSILEXN/A צינורות מחברים תא דגירה, מאגר מדיה ותא תאימות 
מפחית התאמה 0.5 עד 1.6, מתאם פוליפרופילין טבעיIbidi10829מתחבר מעל שני סוגים של
צינורות צינורות 1/32 אינץ', מזהה 0.01 אינץ' (250µ מ) חומר: צינורות PEEKLabSmithT-132-010Pדרך קיר תא הדגירה המחבר את השתל עם צינורות חיצוניים
אביזרי מקשה אחת LabSmithT-132-100תקן את הצינורות הנ"ל דרך דופן תא הדגירה
צינורות ניילון (OD 0.9 מ"מ, מזהה 0.75 מ"מ) Smiths MedicalN/Aמוכנסים לשני קצוות של שתל אבי העורקים
NOD. CB17-Prkdcscid/NcrCrl עכברצ'ארלס ריבר
תפרים כירורגיים, 8-0  משיETHICONW819
HypnormVetapharmVm21757/4000Neuroleptanalgesic לשימוש בעכברים
Hypnovel (Midazolam)Roche59467-70-8אינדוקציה של
מיקרוסקופ ניתוחקארל זייסStemi 2000
צינורות ניילוןPortex LTD800/200/100/200קוטר 0.65 מ"מ ואורך 1 מ"מ; להכנת שרוול עורקים
ElectrocoagulatorMartin SN 54.131קשירת ענפי העורקים על אבי העורקים
מלקחיים מיקרו המוסטט דו קוטבימרטין80-91-12-04קיבוע קצוות כלי
מרחיב כליS& TJFX-7
מרחיב כליS& TJFL-3dZ
מרחיב כליS& TD-5aZ
מיני אפליקציה AESCULAPFE572K
מהדקי המוסטטים מיקרוAESCULAPFE720K
, 6-0 VICRYLETHICONV489
מו"פצינורות צינורות הרדמה דם תפרים כירורגיים

מקורות

  1. Kurobe, H., Maxfield, M. W., Breuer, C. K., Shinoka, T. Concise Review: Tissue-Engineered Vascular Grafts for Cardiac Surgery: Past, Present, and Future. Stem Cells Transl Med. 1 (7), 566-571 (2012).
  2. Jonas, R. A., Freed, M. D., Mayer, J. E. Jr Long-term follow-up of patients with synthetic right heart conduits. Circulation. 72, II77-II83 (1985).
  3. Heureux, N., et al. Technology insight: the evolution of tissue-engineered vascular grafts-from research to clinical practice. Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 4, 389-395 (2007).
  4. Zhang, W. J., Liu, W., Cui, L., Cao, Y. Tissue engineering of blood vessel. J Cell Mol Med. 11, 945-957 (2007).
  5. Cearbhaill, E. D., et al. Response of mesenchymal stem cells to the biomechanical environment of the endothelium on a flexible tubular silicone substrate. Biomaterials. 29, 1610-1619 (2008).
  6. Gong, Z., Niklason, L. E. Small-diameter human vessel wall engineered from bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSCs). FASEB J. 22, 1635-1648 (2008).
  7. Wong, M. M., et al. Over-expression of HSP47 augments mouse embryonic stem cell smooth muscle differentiation and chemotaxis. PLoS One. 9 (1), e86118(2014).
  8. Park, S. W., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells into functional CD34+ progenitor cells by combined modulation of the MEK/ERK and BMP4 signaling pathways. Blood. 116, 5762-5772 (2010).
  9. Samuel, R., et al. Generation of functionally competent and durable engineered blood vessels from human induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 12774-12779 (2013).
  10. Margariti, A., et al. Reprogramming of fibroblasts into endothelial cells capacble of angiogenesis and reendothelialization in tissue-engineered vessels. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 13793-13798 (2012).
  11. Karamariti, E., et al. Smooth muscle cells differentiated from reprogrammed embryonic lung fibroblasts through DKK3 signaling are potent for tissue engineering of vascular grafts. Circ Res. 112, 1433-1443 (2013).
  12. Udelsman, B., et al. Development of an operator-independent method for seeding tissue-engineered vascular grafts. Tissue Eng Part C Methods. 17 (7), 731-736 (2011).
  13. Cearbhaill, E. D., Murphy, M., Barry, F., McHugh, P. E., Barron, V. Behavior of human mesenchymal stem cells in fibrin-based vascular tissue engineering constructs. Ann Biomed Eng. 38 (3), 649-657 (2010).
  14. Wong, M. M., et al. Macrophages control vascular stem/progenitor cell plasticity through tumor necrosis factor-α-mediated nuclear factor-κB activation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (3), 635-643 (2014).
  15. Wong, M. M., et al. Sirolimus stimulates vascular stem/progenitor cell migration and differentiation into smooth muscle cells via epidermal growth factor receptor/extracellular signal-regulated kinase/β-catenin signaling pathway. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (10), 2397-2406 (2013).
  16. Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: State of the art. Tissue Eng Part B Rev. 14, 61-86 (2008).
  17. Hung, H. S., Hsu, S. H. Current Advances of stem cell-based approaches to tissue-engineering vascular grafts. OA Tissue Engineering. 1 (1), 2(2013).
  18. Quint, C., et al. Decellularized tissue-engineered blood vessel as an arterial conduit. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (22), 9214-9219 (2011).
  19. Zhang, X., Xu, Y., Thomas, V., Bellis, S. L., Vohra, Y. K. Engineering an antiplatelet adhesion layer on an electrospun scaffold using porcine endothelial progenitor cells. J Biomed Mater Res A. 97 (2), 145-151 (2011).
  20. Hibino, N., et al. Evaluation of the use of an induced puripotent stem cell sheet for the construction of tissue-engineered vascular grafts. J Thorac Cardiovasc Surg. 143 (3), 696-703 (2012).
  21. Zhao, J., et al. A novel strategy to engineer small-diameter vascular grafts from marrow-derived mesenchymal stem cells. Artif Organs. 36 (1), 93-101 (2012).
  22. Tsai, T., et al. Contribution of stem cells to neointimal formation of decellularized vessel grafts in a novel mouse model. Am J Pathol. 181 (1), 362-373 (2012).
  23. Kasimir, M. T., et al. Comparison of different decellularization procedures of porcine heart valves. Int J Artif Organs. 26 (5), 421-427 (2003).
  24. Stephenson, E., et al. Derivation and propagation of human embryonic stem cell lines from frozen embryos in an animal product-free environment. Nature Protocols. 7, 1366-1381 (2012).
  25. Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature Protocols. 2, 3081-3089 (2007).
  26. McCall, F. C., et al. Myocardial infarction and intramyocardial injection models in swine. Nature Protocols. 7, 1479-1496 (2012).
  27. Olausson, M., et al. Transplantation of an allogeneic vein bioengineered with autologous stem cells: a proof-of-concept study. Lancet. 380 (9838), 230-237 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים חלקיתשתלי אביוטה דה-צלולרייםמעגל זרימה של ביו-ראקטורטכניקת זריעה כפולההליך השתלה בעכברהתמיינות אנדותלית של שריר חלקטיפול במחלות קרדיווסקולריותגישת רפואה רגנרטיביתמודל עכבר עם דפיקת חיסון
דור והארכת כלי רקמות מהונדסות במודל עכבר
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.