הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

סיכום

כאן אנו מתארים בדיקת גן מדווח מבוססת תאים ככלי רב ערך לסינון ספריות כימיות עבור תרכובות המווסתות מנגנוני בקרה פוסט-שעתוק המופעלים באמצעות 3' UTR.

תקציר

תעתיק ורגולציה לאחר תעתיק לשניהם יש השפעה עמוקה על ביטוי גנים. עם זאת, מבחני סינון מבוסס תאים נפוצים אימצו להתמקד ברגולצית תעתיק, שנועדו במהותו בזיהוי של מולקולות מיקוד אמרגן. כתוצאה מכך, מנגנונים שלאחר תעתיק נחשפים במידה רבה על ידי פיתוח תרופות ממוקדות ביטוי גנים. כאן אנו מתארים assay מבוסס תאים שנועד לבחון את התפקיד של 'האזור מתורגם (3' 3 UTR) באפנון של הגורל של mRNA שלה, ובזיהוי תרכובות יוכלו לשנות אותה. Assay מבוסס על השימוש במבנה כתב בלוציפראז המכיל 'UTR 3 של גן של עניין המשולב ביציבות לקו תא מחלה-רלוונטית. הפרוטוקול מחולק לשני חלקים, עם ההתמקדות הראשונית על ההקרנה הראשונית שמטרתו זיהוי של מולקולות המשפיעות על הפעילות בלוציפראז לאחר 24 שעות של טיפול. החלק השני של הפרוטוקולמתאר את הצורך להפלות תרכובות ויסות פעילות לוציפראז במיוחד דרך UTR '3 הקרנה ללא מרשם. בנוסף לפרוטוקול מפורט ותוצאות נציג, אנו מספקים שיקולים חשובים על פיתוח assay והאימות של הלהיט (ים) על יעד אנדוגני. Assay הגן המתואר מבוסס תאי הכתב יאפשר למדענים לזהות מולקולות ויסות רמות חלבון באמצעות מנגנונים שלאחר תעתיק תלויים ב'UTR 3.

מבוא

לרגולצית תעתיק תקופה ארוכה של ביטוי גנים שחשבו לשחק עיקרי אם לא בלעדי תפקיד בשליטה על ייצור חלבון. צבירת ראיות, לעומת זאת, מצביע על כך שרגולציה לאחר תעתיק תורמת באותה מידה, אם לא יותר מ, רגולציה תעתיק לקבוע שפע חלבון תאי ^1,2. שליטה לאחר תעתיק של ביטוי גנים היא הרבה יותר מורכב ומשוכלל יותר מהייתה במחשבה ראשונה. למעשה, את כל השלבים השונים של בקרה לאחר תעתיק צמחו להיות מוסדרים, כוללים עיבוד mRNA, לוקליזציה, מחזור, תרגום ^3, כמו גם מתילציה RNA הפיכה תיארה זה עתה ^4. ממספר תהליכי רגולציה לאחר תעתיק מושפע באופן פוטנציאלי, assay מתואר להלן מתמקד באלה הקשורים 'האזור מתורגם (3' mRNA 3 UTR). 3 '....

פרוטוקול

הערה: התפוקה של מערכות assay זה תלויה בציוד המעבדה HTS זמין. פרוטוקול זה הוא בהנחייתם של טקאן חופש רובוט EVO 200, אשר מבצע טיפול נוזלי בפורמט 96-היטב. מזעור לפורמט 384 גם הוא גם אפשרי. מערכת הטיפול הנוזלי רובוטית ממוקמת מתחת הזרימה למינרית על מנת לשמור על תנאים אספטיים במהלך כל שלבי הניסוי. אם אין אוטומציה של טיפול בנוזלים זמינה, הפרוטוקול ניתן להתאים בקלות לפורמט נמוכה תפוקה.

הקרנה ראשונית

1. יום 1: הכן ותאי זרע

הערה: תאי זרע ל....

תוצאות

שימוש בגישה המתוארת, אנו הוקרנו ספריית 2,000 מתחם למאפנני פוטנציאל של מנגנוני בקרה שלאחר תעתיק מופעלים באמצעות 'UTR 3 של גן MYCN. איור 3 מתארים את התוצאות של בדיקות הסקר הראשוניים שהודגמה על ידי צלחת ספרייה אחת. אות בלוציפראז מוצגת כאחוז מפקדי רכב שטופל הייתה מתקבלת על ידי מדידת פעילות לוציפראז בצלחות בשלושה עותקים של תאי CHP134-mycn3UTR טופלו בתרכובות של צלחת ספרייה אחת. כצפוי, רוב התרכובות לא הייתה השפעה על פעילות בלוציפראז כפי שצוין על ידי ערכים קר.......

דיון

פרוטוקול זה מתאר בדיקת גן מדווח מבוססת תאים שמטרתה לזהות מודולטורים המכוונים לתהליכים פוסט-שעתוק תלויי UTR. הוא מקיף את הבדיקה הראשונית ואת המסך הנגדי ובמידת הצורך יכול להיות מלווה בבדיקת ציטוטוקסיות. התוצאה של הסינון הראשוני היא מספר תרכובות מועמדות יקרות ערך, שיכולת השחזור והספציפיות שלהן מאומתות עוד יותר בסינון הנגדי.

זיהוי הפגיעות הראשוניות מבוסס על וריאציות של פעילות לוציפראז בטיפול בתאים המבטאים תעתיק כימרי מדווח-3' UTR. בדיקה חוזרת של הפגיעות בתאים הנושאים את אותו פלסמיד מדווח ללא ה-3' .......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלחת תרבות 96 באר לבנה	PerkinElmer	6005688
StorPlate 96 באר תחתית U (צלחת דילול)	PerkinElmer	6008190
שוקת חד פעמית 100 מ"ל לריאגנטים	Tecan	10 613 048
300 מ"ל מאגר רובוטי חד פעמי	VWR	PB12001301
טיפים לרובוט DITI 50  μ l	30038607		טקאן
DITI 200  μ l	30038617		טקאן
1.4 מ"ל ברקוד דו-ממדי w, צינורות תחתונים שטוחים	Thermo Scientific	3711
ONE-Glo Luciferase Assay System	Promega	E6120
RPMI	Lonza	BE12-918F
PBS-1x, w/o Ca2+, Mg2+	Lonza	BE17-516F
L-גלוטמין 200  mM	Lonza	BE17-605E
	FBS Lonza	DE14-801F
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
אוסף הספקטרום (ספרייה מורכבת)	MicroSource Discovery Systems	N/A
Tecan Freedom EVO200 רובוט	Tecan	N/A
Tecan F200 קורא רב-צלחות	טקאן	לא ישים

טיפים לרובוט סטרילי מטריצת סטרילית