הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

גידול ראשוני ובידוד תא MEF לחקר ריאות גרורה

15.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/52609

⸱

20 במאי 2015

 ,  , 
1Biochemistry and Molecular Biology, Louisiana State University Health Sciences Center

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מטרת פרוטוקול זה היא לחקור גידולי שד. בטכניקה זו מסירים גידולי שד של עכברים ומכינים תאים ראשוניים מגידולים. פרוטוקול מיצוי ריאות כלול לחקר גרורות ריאות. יתר על כן, כלול פרוטוקול נוסף לניתוח פיברובלסטים עובריים של עכברים מעובר העכבר.

תקציר

בגידול שד, השלב הגרורתי של המחלה מהווה את האיום הגדול ביותר על האדם הפגוע. לתאי שד נורמליים עם גנוטיפים משתנים יש כעת את היכולת לפלוש ולשרוד ברקמות אחרות. בפרוטוקול זה מסירים גידולי שד של עכברים ומכינים תאים ראשוניים מגידולים. התאים המבודדים מהליך זה זמינים לאחר מכן לניסויי פרופיל גנים. כדי לשלוח גרורות מוצלחות, תאים אלה חייבים להיות מסוגלים לעבור לתוך כלי הדם, לשרוד במחזור הדם, להתפשט לאיברים מרוחקים ולשרוד במערכת האיברים החדשה הזו. הריאות הן המטרה האופיינית לגרורות סרטן השד. התגלתה קבוצה של גנים המתווכים את הסלקטיביות של גרורות לריאות. כאן אנו מתארים שיטה לחקר גרורות ריאה ממודל עכבר מהונדס גנטית. יתר על כן, כלול פרוטוקול נוסף לניתוח פיברובלסטים עובריים של עכברים (MEFs) מעובר העכבר. תאי MEF מאותו סוג בעל חיים מספקים רמז לביטוי גנים של תאים שאינם סרטניים. יחד, טכניקות אלה שימושיות בחקר גידול חלב של עכברים, מנגנוני האיתות הקשורים אליו ומסלולי החריגות בעוברים.

מבוא

גרורות הן השלב האחרון בהתקדמות סרטן השד 1. זה כרוך בסדרה של שלבים שבהם תאים ממאירים משתחררים מהגידול הראשוני ומופצים לאיברים אחרים 2. התאים חייבים להיות מסוגלים לעבור לתוך כלי הדם, לשרוד במחזור הדם, להתפשט לאיברים מרוחקים ולשרוד במערכת האיברים החדשה 3. כל שלב בגידול נשלט באופן הדוק על ידי תאים באמצעות שינויים גנטיים ואפיגנטיים שונים 4. כדי לחקור את המנגנונים של גידול סרטן השד, נעשה שימוש במערכות מודל עכברים בשל תוחלת החיים הקצרה, גודלן הקטן וזמן הרבייה המהיר שלהן. כמה יתרונות עיקריים של שימוש במודלים של עכברים בחקר הסרטן הם הדמיון המולקולרי והפיזיולוגי שהם חולקים עם בני אדם 5.

קווי תאים מבוססים של עכברים ובני אדם שימשו באופן נרחב בחקר סרטן השד. למרות שאנו יכולים לקבל מידע על השלבים בגרורות באמצעות תאים אלה, מודלים של בעלי חיים שעברו מניפולציה גנטית עם מדכאי גידולים/אונקוגנים יתנו הרבה יותר מידע על התפתחות הגידול והגרורות החל מהשלב העוברי. לפיכך, בעזרת מודלים עכבריים אלה, אנו יכולים להשיג ויסות גנטי והתפתחותי של צמיחת הגידול. יתר על כן, המיקרו-סביבה של הגידול ממלאת גם תפקיד חשוב בביטוי הגנים של תאי הגידול וזה יכול להיות קשה לחקות את אותו תרחיש עם מחקרים המשתמשים בקווי תאים מבוססים. גידולי חלב אנושיים ראשוניים יכולים לשמש גם לחקר גידולי חלב של עכברים. החיסרון העיקרי בשימוש בגידולי שד מבודדים הוא שלגידול החדש שהושתל אין את כלי הדם ורקמת הלימפה של העכבר. בעוד שמערכות המודל הגנטי של העכברים לחקר גידולי שד יאפשרו לנו לעקוב אחר שלבי הגרורות, לנתח את המיקרו-סביבה של הגידול וגישה לכל הגוף 5.

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לחקור גידולי שד בעכברים. ידוע כי סרטן השד שולח בדרך כלל גרורות למוח, לריאות ולעצמות. פרוטוקול זה מאפשר בידוד של תאי גידול שד ראשוניים, כמו גם חקר גרורות סרטן השד לריאות. יתר על כן, כלול פרוטוקול נוסף לניתוח פיברובלסטים עובריים של עכברים (MEFs) מעובר העכבר. יחד, טכניקות אלה שימושיות בחקר גידולי חלב של עכברים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ניסויי העכבר נעשו בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי בעלי החיים המוסדיים הטיפול ושימוש בועדות (IACUC) של בית הספר לרפואה של LSU. כל המכשירים חייבים להיות autoclaved לפני הנתיחה.

1. הכנה של תאים ראשוניים מגידולי שד עכבר

  1. להשתמש במודל עכבר שהונדס גנטי עם וירוס עכבר החלב גידול Polyoma התיכון T-Antigen (עכבר MMTV-PyMT-מהונדס), אשר באופן ספונטני לפתח גידולים כפי שתואר בעבר 6.
  2. להקריב עכברים עם Isoflurane (99.9%) ולרסס 75% אתנול כדי להבטיח סביבת סטרילית (איור 1 א).
  3. פתח את העור מאזור פתח השופכה לצוואר עם מספריים. הצמד את העור כלפי מטה, כדי לאפשר גישה קלה לאיברים (איור 1).
  4. לבודד את הגידול בשד החלב ולשטוף עם פוספט סטרילי הקר שנאגרו (PBS) (pH 7.4) (איור 1 ג).
  5. העבר את הגידול לצלחת תרבות 10 ס"מ רקמות סטריליים וקוצצת אותו בסכין גילוח סטרילי ומספריים כ 1 מ"מ 3 חתיכות. יש לבצע את הפעולות הבאות בזרימה למינרית סטרילי.
  6. דגירה רקמת גידול הקצוצה עם Collagenase מומס בתקשורת DMEM סרום ללא בריכוז סופי של 1 מ"ג / מיליליטר על כיסא נדנדה לשעה 2 ב 37 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה ההשעיה רקמת גידול 3 דקות ב 200 x גרם.
    הערה: הדגירה Collagenase חיונית לניתוק האנזימטית של הרקמה.
  7. בטל supernatant ולשטוף את המשקע 3 פעמים עם PBS (pH 7.4) על ידי צנטריפוגה במשך 3 דקות ב 200 x גרם. לאחר לשטוף הסופי, למזוג supernatant.
  8. Resuspend רקמות עם 2 מיליליטר של EDTA טריפסין במשך 5 דקות על 37 מעלות צלזיוס בזמן nutating. צנטריפוגה ההשעיה למשך 3 דקות ב XG 200 ולחזור על שוטף.
  9. Resuspend גלולה הרקמה במדיום גידול רגיל (DMEM, 10% FBS, 2X עט / סטרפטוקוקוס) על צלחת 10 ס"מ. שינויהתקשורת כל יום במשך 3 הימים הבאים. תרבות תאים עד מספר תא רצוי מתקבל.
    הערה: כ 1x10 7 תאים יהיו מבודדת מהליך זה. מודלים אחרים החלב עכבר tumorigenesis, כגון MMTV-Neu, נותנים תשואה נמוכה יותר של תאים בהשוואה לMMTV-PyMT. בעת שימוש במודלים המייצרים תשואה נמוכה יותר, זה מועיל להתחיל עם תאי גידול והתרבות גדולים יותר.

2. עכבר ריאות הפקה לדמיין ריאות גרורה

  1. לפני מיצוי ריאות, להסיר את הכבד והסרעפת. לעקור את הצלעות מבלי להפריע לריאות.
  2. עם זוג נאה של מספריים, לפתוח את החלק העליון של קנה הנשימה שהוא קרוב יותר לוריד הצוואר.
  3. באמצעות קטטר, להזריק סוכן כגון 1 מיליליטר של Z-תיקון או דיו הודו דרך קנה הנשימה כדי למלא את הריאות (איור 2 א). להטביע את Z-לתקן ריאות בפרפין.
  4. דה-להכתים את הריאות הוזרקו דיו הודו בפתרון של Fekete(אלכוהול 100 מיליליטר 70%, 10 מיליליטר של 10% שנאגרו פורמלין, ו 5 מיליליטר של חומצה אצטית קרחונית) במשך 5 דקות. הגדר גושים סרטניים באתרים משניים עם ≥ 0.5 מ"מ קוטר, לקבוע את הגושים כגרורות.
    הערה: בשל חסימת הסמפונות וbronchiole על ידי הגידול, גושים סרטניים לא יכולים לספוג 15% דיו הודו, ובכך רקמת ריאה נורמלית תהיה בשחור, וגושי גידול יהיו בצבע לבן 7. זה יאפשר להדמיה של גושים בודדים גידול (איור 2).

3. הכנת fibroblasts העכבר העוברית (MEFs) מהעכבר עוברים

  1. להקריב עכברים בהריון עם Isoflurane (99.9%) ולרסס 75% אתנול כדי להבטיח סביבת סטרילית.
  2. פתח את העור מאזור פתח השופכה לצוואר עם מספריים ולבודד את העוברים מהרחם.
  3. היזהר שלא להפריע לעוברים בעת פתיחת העור.
  4. הסר את קרן הרחם ולשטוף אותם בSTE הקרלהרגיז PBS (pH 7.4).
  5. הפרד את העובר מהשליה שלה בזהירות רבה ועוברי מקום בצלחת 10 ס"מ המכילות קרח הקר PBS (pH 7.4).
  6. הסר את הראש, בכבד ובמעיים מן העובר ומניח את החלק שנותר בצלחת תרבית רקמה גם 12 המכילה PBS (pH 7.4).
  7. העבר את גוף העובר לעוד EDTA טריפסין המכיל 12 צלחת היטב ולחתוך לחתיכות קטנות (~ 1 מ"מ 3) באמצעות סכין גילוח סטרילי ומספריים. דגירה החומר הקצוץ עם 5 מיליליטר של EDTA טריפסין במשך 5 דקות על 37 מעלות צלזיוס.
  8. להשבית טריפסין על ידי הוספת 1 מיליליטר סרום שור עוברי (FBS) לעוברים הקצוצים. צנטריפוגה ההשעיה במהירות XG 200 במשך 10 דקות, להסיר בזהירות את supernatant, resuspend גלולה עם 1 מיליליטר של מדיום DMEM החם ולהעביר את כל התוכן לצלחת 10 ס"מ המכילה FBS 10 מיליליטר של DMEM (עם 20% ו2X פניצילין / סטרפטומיצין ).
  9. לשנות הבינוני בכל יום ליומיים. תרבות התאים עד תא רצוימספר מושגת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

שלב התקדמות גידול שבלהקריב בעלי החיים תלויים במחקר המסוים והנחיות IACUC. באיור 1 א, C57BL / 6 עכבר בן 100 יום עם וירוס גידול עכבר החלב Polyoma התיכון T-Antigen (MMTV-PyMT) הוקרב בשלושה חודשים. העור נפתח מאזור פתח השופכה לצוואר עם המספריים והעור היה מרותק כדי לאפשר גישה קלה לאיברים כפי שמוצגים באיור 1. זה אפשר גישה קלה לגידול שהושג באיור 1 ג. התאים הראשוניים המתקבלים מהגידולים הם דמיינו באיור 1D. מאז גנים רבים לתוו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה הוא לבידוד תאים ראשוניים מגידול עכבר טרי. Lysates הוכן משיטה זו שימושי לחלבון, DNA וניתוח RNA. תאים סרטניים מהגידול השד הראשוני לעתים קרובות לשלוח גרורות למוח, הריאות ועצמות 1. כלול הוא טכניקה כדי לחלץ את הריאות לגילוי של גרורות. מכתים את הריאות עם כתם דיו יאפשר להדמיה של גושים סרטניים כפי שניתן לראות באיור 2. תיקון הריאות בפתרון Z-תיקון יאפשר לנו להפוך את הקטעים של ריאות, ואת הכתם עם נוגדנים המתאימים ללמוד מנגנונים גרורתי. כמו כן, נכלל הוא ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

יש הסופרים לא גילויים.

תודות

ברצוננו להודות ל-NIH, LACaTS וקרן מרפאת אוקסנר על התמיכה הכספית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
DMEMHyCloneSH30243.01חנות ב-4 מעלות; C
0.05% Trypsin-EDTALife  טכנולוגיות25300-062חנות ב – 20 & deg; C
קולגנאז סוג IVSigma-AldrichC5138חנות ב – 20 & deg; C
HyaluronidaseSigma-AldrichH3506חנות ב – 20 & deg; C
Pen StrepLife  טכנולוגיות15140-122חנות ב-4 מעלות;
C סרום בקר עוברי (FBS)Gemini Bio-Products100-106חנות ב – 80 & deg; חנות C
Z-fixANATECH#174בחנות RT
IndiaInk Yasutomoבחנות RT
AERRANE (Isoflurane)BaxterNDC 10019-773-60חנות
אתנולEMDAX0441-3בחנות RT
בחנות RT

מקורות

  1. Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Natur. 436 (7050), 518-524 (2005).
  2. Poste, G., Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis. Natur. 283 (5743), 139-146 (1980).
  3. Wan, L. Tumor Metastasis Moving New Biological Insights into the Clinic. Nat Med. 19 (11), 1450-1464 (2013).
  4. Bergers, G., Benjamin, L. E. Tumorigenesis and the angiogenic switch. Nat Rev Cancer. 3 (6), 401-410 (2003).
  5. Frese, K. K., Tuveson, D. A. Maximizing mouse cancer models. Nat Rev Cancer. 7 (9), 654-658 (2007).
  6. Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Mol Cell Biol. 12 (3), 954-961 (1992).
  7. Wexler, H. Accurate Identification of Experimental Pulmonary Metastases. J Natl Cancer Inst. 36 (4), 641-645 (1966).
  8. Boczkowski, D., Nair, S. K., Nam, J. H., Lyerly, H. K., Gilboa, E. Induction of tumor immunity and cytotoxic T lymphocyte responses using dendritic cells transfected with messenger RNA amplified from tumor cells. Cancer Res. 60 (4), 1028-1034 (2000).
  9. Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. Modelling breast cancer: one size does not fit all. Nat Rev Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).
  10. Watts, A. M., Kennedy, R. C. Quantitation of Tumor Foci in an Experimental Murine Tumor Model Using Computer-Assisted Video Imaging. Anal Bioche. 256 (2), 217-219 (1998).
  11. Rosenberg, S. A., et al. Regression of Established Pulmonary Metastases and Subcutaneous Tumor Mediated by the Systemic Administration of High-Dose Recombinant Interleukin 2. J Exp Me. 161 (5), 1169-1188 (1985).
  12. Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Re. 8 (4), 212(2006).
  13. Veer, L., et al. Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature. 415 (6871), 530-536 (2002).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

MEFTrypsin EDTA
גידול ראשוני ובידוד תא MEF לחקר ריאות גרורה
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.