אנו מציגים כאן פרוטוקול לבידוד איים ממודל העכבר של סוכרת מסוג 2, Leprdb ופרטים על בדיקת תאים חיים למדידת הפרשת אינסולין מאיים שלמים המשתמשת במיקרוסקופ 2 פוטונים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
סוכרת מסוג 2 היא מחלה כרונית המשפיעה על 382 מיליון אנשים בשנת 2013, והוא צפוי לעלות ל 592 מיליון על ידי 2035 1. במהלך 2 העשורים האחרונים, את התפקיד של בעיות בתפקוד התא בטא בסוכרת מהסוג 2 כבר נקבע 2 באופן ברור. התקדמות מחקר נדרשת שיטות לבידוד של איי לבלב. הפרוטוקול של בידוד איון מוצג כאן מניות רבות צעדים משותפים עם פרוטוקולים מקבוצות אחרות, עם כמה שינויים כדי לשפר את התפוקה ואיכות של איים מבודדים משני הסוג בר וdb Lepr סוכרת עכברים (DB / DB). שיטת הדמיה 2-פוטון לחיות תאים מכן הציגה שיכול לשמש כדי לחקור את השליטה בהפרשת אינסולין באיים.
מבוא
התפקיד של תפקוד לקוי של בטא-תא במחלה הוכר נרחב 3,4. שורות תאים כגון MIN6 ואח"י-1 הן כלים שימושיים כדי להבין את הביולוגיה של תאי הבטא התנהגות. עם זאת, השליטה הפיזיולוגית של הפרשת אינסולין מתרחשת בתוך האיים לנגרהנס. איים אלה מכילים אלפי תאי הבטא צפופים, כמו גם כלי דם וסוגי תאים אנדוקריניות אחרים. סביבה זו באיון משפיעה הפרשת אינסולין ועשויה להיות חשוב בסוכרת. לכן, כדי להבין את השליטה הפיזיולוגית של הפרשת אינסולין, והפתופיזיולוגיה של מחלה, חשוב ללמוד איים שלמים.
בידוד איון
איים חיים אד....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: כל הניסויים הנוכחיים בוצעו על פי נהלים המקומיים אתיקה של בעלי החיים של אוניברסיטת קווינסלנד (שאושרו על ידי אוניברסיטת קווינסלנד, ועדת האתיקה Biosciences אנטומי).
1. בידוד איילט
- הכנת מגיב
- תערובת של אנזימים
- לעיכול הלבלב, להשתמש בתערובת של הסוג IV liberase וcollagenase. לדלל TL liberase (therm....
- תערובת של אנזימים
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
תשואה וטיהור איון
לעכבר נורמלי סוג בר, כ -200 איים צפויים. איים בריאים נראים בהירים, בצורה עגולה ויש לי גבול חלק. אצווה בידוד מתעכל-על בדרך כלל יש איים קטנים ומטושטשים בזמן שיש אצווה-מתעכל תחת פחות איים ואיוני acinar תא מצורף (איור 3). לעכברי db / db סוכרת, תשואת איון וההופעה תלויה בהתקדמות המחלה עם עכברים גליקמי טובים יותר איים גדולים יותר, בהירים יותר ויותר (עד 300 איים) בהשוואה לעכברי גליקמי ג.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הגורם הקריטי ביותר בבידוד איון הוא זלוף הראשוני של הלבלב; תחת perfused תוצאות לבלב בתשואת איון נמוך משמעותי. גורמים אחרים משפיעים גם על איכות הבידוד כגון זמן העיכול והרמה של טלטול שיכול לפצות באופן חלקי לרמה של זלוף. לדוגמא, לבלב perfused באופן מלא יהיה צורך טופח על 37 מעלות צלזיוס במשך ~ 30 שניות 18 דקות בזמן שלוחץ בעדינות, בניגוד תחת מתעכל לבלב עשוי לדרוש ~ 20 דקות עם רעד עיכול קשה יותר. התערובת של שני אנזימי עיכול בידיים שלנו מספקת בידוד איון טוב יותר מאשר כל אחד לבד. לco.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענק של מועצת המחקר האוסטרלית DP110100642 (ל-PT) ומענקי המועצה הלאומית לבריאות ומחקר רפואי APP1002520 ו-APP1059426 (ל-PT ו-HYG).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Liberase TL 5 מ"ג | Roche-5401020001 | ||
| קולגנאז מסוג IV-1g | Gibco-Life Technologies | 17104-019 | |
| Histopaque 1077 500 מ"ל | Sigma Aldrich | 10771 | |
| RPMI 1640 בינוני (10x) 1L | Sigma Aldrich | R1383 | להכנת מדיה מבודדת |
| RPMI 1640 (1x) 500 מ"ל | Gibco-Life Technologies | 21870-076 | להכנת מדיה מתורבתת |
| פניצילין-סטרפטומיצין 100 מ"ל | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | להכנת מדיה מתורבתת |
| סרום בקר עוברי 500 מ"ל | Gibco-Life Technologies | 10099-141 | להכנת מדיה מתורבתת |
| DMEM (מדיום הנשר השונה של Dulbecco) | Gibco-Life Technologies | 11966-025 | לדילול תוכנית המטמורף של liberase |
| מכשירים מולקולריים, ארה"ב | לניתוח תמונות 2 פוטונים |
מקורות
- Guariguata, L., et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035. Diabetes Research and Clinical Practice. 103, 137-149 (2014).
- Ashcroft, F. M., Rorsman, P. Diabetes mellitus and the beta cell: The last ten years. Cell<....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
