מאמר שיטה

Lepr

9.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/52632

⸱

11 במאי 2015

 ,  , 
1School of Biomedical Sciences, The University of Queensland

במאמר זה

סיכום

אנו מציגים כאן פרוטוקול לבידוד איים ממודל העכבר של סוכרת מסוג 2, Leprdb ופרטים על בדיקת תאים חיים למדידת הפרשת אינסולין מאיים שלמים המשתמשת במיקרוסקופ 2 פוטונים.

תקציר

סוכרת מסוג 2 היא מחלה כרונית המשפיעה על 382 מיליון אנשים בשנת 2013, והוא צפוי לעלות ל 592 מיליון על ידי 2035 1. במהלך 2 העשורים האחרונים, את התפקיד של בעיות בתפקוד התא בטא בסוכרת מהסוג 2 כבר נקבע 2 באופן ברור. התקדמות מחקר נדרשת שיטות לבידוד של איי לבלב. הפרוטוקול של בידוד איון מוצג כאן מניות רבות צעדים משותפים עם פרוטוקולים מקבוצות אחרות, עם כמה שינויים כדי לשפר את התפוקה ואיכות של איים מבודדים משני הסוג בר וdb Lepr סוכרת עכברים (DB / DB). שיטת הדמיה 2-פוטון לחיות תאים מכן הציגה שיכול לשמש כדי לחקור את השליטה בהפרשת אינסולין באיים.

מבוא

התפקיד של תפקוד לקוי של בטא-תא במחלה הוכר נרחב 3,4. שורות תאים כגון MIN6 ואח"י-1 הן כלים שימושיים כדי להבין את הביולוגיה של תאי הבטא התנהגות. עם זאת, השליטה הפיזיולוגית של הפרשת אינסולין מתרחשת בתוך האיים לנגרהנס. איים אלה מכילים אלפי תאי הבטא צפופים, כמו גם כלי דם וסוגי תאים אנדוקריניות אחרים. סביבה זו באיון משפיעה הפרשת אינסולין ועשויה להיות חשוב בסוכרת. לכן, כדי להבין את השליטה הפיזיולוגית של הפרשת אינסולין, והפתופיזיולוגיה של מחלה, חשוב ללמוד איים שלמים.

בידוד איון

איים חיים אדם ו, באיים מסוימים, אדם מחולי סוכרת מסוג 2 הם קשים להשגה. בנוסף, יש לי איים אנושיים אפשרויות מוגבלות למניפולציה מולקולרית ניסיונית. חוקרים לכן מועסקים הואמאפשר מבעלי חיים ומודלים של בעלי חיים של סוכרת מהסוג 2. מודל מחלה אחת כזו הוא עכבר db / db. זוהי מוטציה ספונטנית שמודלי סוכרת מסוג 2 עם התקדמות הפנוטיפ שמקבילה מחלה אנושית 5,6 מקרוב. יש הפרוטוקול המובא כאן לבידוד איון מעכברי db / db סוכרת שלבים רבים במשותף עם קבוצות אחרות עם כמה חידודים לתשואה טובה יותר, טיהור והישרדות איון משופרת.

הדמיה 2 פוטון

Assay 2-הפוטון לחיות התאים המתוארים כאן מאפשר לחוקרים לכמת את המספר ולהעריך את המאפיינים של גרגרים המכיל אינסולין אחת מהתאים רבים של 7 סוכרת והסוג בר על האיים קטנטנים 8,9.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: כל הניסויים הנוכחיים בוצעו על פי נהלים המקומיים אתיקה של בעלי החיים של אוניברסיטת קווינסלנד (שאושרו על ידי אוניברסיטת קווינסלנד, ועדת האתיקה Biosciences אנטומי).

1. בידוד איילט

  1. הכנת מגיב
    1. תערובת של אנזימים
      1. לעיכול הלבלב, להשתמש בתערובת של הסוג IV liberase וcollagenase. לדלל TL liberase (thermolysin הנמוך) בקבוקון 1 של 5 מ"ג עם 26 מיליליטר של DMEM (הנשר בינוני השתנה Dulbecco).
      2. הכן סוג IV collagenase במאגר של האנק בריכוז של 0.5mg / מיליליטר, בתוספת 5 מ"מ HEPES, 0.5mm CaCl 2, 0.1mg / מיליליטר DNAse ו1mg / אלבומין בסרום שור מיליליטר.
      3. מערבבים את TL liberase ופתרונות collagenase ביחס של 4: 1 (לפי נפח), כלומר, 4 מיליליטר liberase collagenase מיליליטר TL + 1. Aliquot התערובת של אנזימים ל2.5ml כל חנות ב -20 ° C.
        הערה: הפעמים הדגירה רקמת vארי קצת בין קבוצות של אנזים (הבדל דק '30 שניות ל1). לכן, ייתכן שתידרש בדיקה אצווה.
    2. מדיה בידוד RPMI
      1. לפזר בקבוקון אחד של אבקת RPMI 1640 ב1 ליטר של מים בRT ולהשלים עם 2 גרם NaHCO 3, 4.02 HEPES ז.
      2. מערבבים את תקשורת בידוד RPMI בבקבוק חרוטי גדול, לערבב עם בוחש מגנטי, להסתגל לpH 7.4 עם NaOH, המסנן לעקר ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.
    3. RPMI תרבות מדיה
    4. השתמש תקשורת תרבות RPMI, עם 10% בסרום שור עוברי ואנטיביוטיקה 1% (כלומר, פניצילין 100 U / ml, 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין).
  2. בידוד וCulturing איון
    1. קורבן של בעלי חיים
      1. להקריב עכברי נקע בצוואר רחם או מחנק CO 2 על פי נהלי האתיקה של המוסד המקומי. לרסס את גוף העכבר ביסודיות עם אתנול 70%.
    2. זלוף לבלב
      1. Uקיצוצי se 2 ארוכים רוחבי דרך העור וצפק הבטן לעשות דש בצורת V. משוך את הדש של העור עד כדי לחשוף את חלל הבטן כולו, לשים בצד את המעי ולשמור על הכבד במקום על ידי נייר טישו מקופל כדי לחשוף את צינור מרה המשותף (איורים 1 ו -2). שים את בעלי החיים, כך שהראש כלפי המנתח והזנב מהמנתח.
      2. החל מהדק כלי דם בampulla על קיר תריסריון לחסום אנזימים המוזרקים מלהיכנס לתריסריון (איור 1).
        הערה: זהו צעד חשוב כפי שקובע אם האנזימים הזריקו ייכנסו לצינור הלבלב וינקבו הלבלב או רפלוקס לאתר ההזרקה (מעל מהדק) או ללכת לתריסריון (תחת מהדק).
      3. Cannulate צינור מרה המשותף עם מחט G 31 בסמוך לצומת של צינור הכבד הנפוץ וצינור פיברוזיס (איור 1) ולהשאיר מקום לזריקה שנייה, אם הלבלב הדואר אינו ינקב בפעם הראשונה. לאט לאט (מעל ~ 10 שניות) להזריק כ -2 מיליליטר של תערובת אנזים קרה לתוך צינור המרה משותפת העכבר.
        הערה: הלבלב יהיה perfused במהירות אם המהדק נמצא במצב תקין.
      4. להתאים את מיקום המהדק אם המחט נמצאת בתוך צינור המרה המשותף, אבל לא יכולה perfuse הלבלב (כלומר., להעביר את המהדק קצת מהכבד אם על מהודק או להעביר אותו קצת בכבד אם תחת מהודק).
        הערה: המחט לפעמים הולכת לכמוסה המקיפה במקום לומן של הצינור. סימן שימושי כדי לבדוק אם המחט נמצאת בתוך צינור המרה המשותף היא ההתרחבות של הצינור כאשר הזרקה. אם הלבלב אינו ינקב, אלטרנטיבה היא תערובת האנזים יכולה להיות מוזרקת לאתרים מרובים של הלבלב עם תשואה נמוכה הצפויה. טפטוף של אתר השמאל של הלבלב (אונת הטחול) הוא חשוב למקסום תשואת איון.
      5. לאחר הלבלב הוא perfused, להסיר במהירות את הלבלב, הכניס אותו לתוך בקבוקון (~ 20 מיליליטר, זכוכית) ודגירה ~ 19 דקות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
        הערה: זמן הדגירה יכול להשתנות קצת בהתאם לזן העכבר וגיל.
      6. לאחר זמן הדגירה, לעצור את תהליך העיכול על ידי הוספה ~ 20 מיליליטר של תקשורת בידוד הקרה. לנער את הבקבוקון בעדינות כדי לשבש את הלבלב ולשפוך אותו דרך מסננת רגיל תה (קוטר נקבובית של 1 מ"מ) לתוך צינור 50 מיליליטר סטרילי. למעלה למעלה הצינור עם תקשורת בידוד וצנטריפוגות ב 400 XG דקות 1 ב 4 ° C עם בלם משם.
      7. ממיסים את גלולה בתקשורת הבידוד שוב ולהעביר לשני צינורות 15 מיליליטר, אז צנטריפוגות ב 400 XG דקות 1 ב 4 ° C עם בלם משם. לאחר שאיפת supernatant, לערבב את שני כדורים היטב עם 6 מיליליטר של תקשורת הפרדת תא שיפוע צפיפות (פתרון Histopaque 1,077) לכל צינור על ידי vortexing או pipetting למעלה ולמטה. ואז בעדינות להוסיף ~ 6 מיליליטר של תקשורת הבידוד לצד של הצינור על גביתקשורת שיפוע צפיפות ההפרדה וצנטריפוגות בבמשך 15 דקות 100 XG ב 4 מעלות צלזיוס עם בלם משם.
      8. לאסוף את supernatant ב( תקשורת בידוד) העליונה, שכבה (תקשורת הפרדת תא שיפוע צפיפות) אמצע והנמוך ב 3 מנות נפרדות. בוחר ידני את האיים ב 3 מנות אלה, באמצעות פיפטה תחת מיקרוסקופ לנתח.
        הערה: השכבה האמצעית מכילה את רוב האיים. איים מוכרים כמבנים קומפקטיים של ~ 50 ל 500 מיקרומטר בגודל (איור 3). אנו משיגים ~ 200 איים בעכברי WT ו300 <100 בעכברי db / db איים.
    3. Culturing איון
      1. כדי לעזור לאיים להתאושש מעיכול האנזים, קבוצות התרבות של 40 איים בצלחת פטרי 25 סנטימטר עם 6ml תקשורת תרבות RPMI (גלוקוז 10 מ"מ) על 37 מעלות צלזיוס, 5% / 95% CO 2 / O 2 עבור 2 ימים לפני שידור חי -cell הדמיה 2-פוטון. לשנות את התקשורת והתרבות יומית.

2. תא חי 2-פוטון הדמיה

  1. מגיב הכנה
    1. תאי מאגר
      1. הכן את החיץ תאי נתרן עשיר עבור assay 2-הפוטון עם 140 מ"מ NaCl, 5 מ"מ KCl, 2.5 מ"מ CaCl 2, 1 מ"מ MgCl 2, 5 מ"מ NaHCO 3 ו -10 מ"מ HEPES.
    2. תאי דיי
      1. עבור assay 2-הפוטון, להכין SRB המניה 8 מ"מ במאגר תאי, aliquot לתוך צינורות קטנים וחנות ב -20 ° C. לדלל את מניות SRB 1:10 ב חיץ תאי טרי כדי לקבל ריכוז עבודה של 0.8 מ"מ.
  2. הדמיה פוטון
    1. ראשית, לפני דגירה איים תרבותיים 2 ימים במאגר תאי גלוקוז 3 מ"מ למשך 30 דקות.
      הערה: אנו משתמשים באיים בין 2 ל 5 ימים בתרבות.
    2. ואז, במקום שקופיות זכוכית על התא תרמו-שליטה רכוב על הבמה מיקרוסקופ. השתמש גריז כדי למנוע הדליפה של פתרון.
    3. מכסה את החדר עם 500 μl של extracellמאגר ular המכיל 0.8 מ"מ SRB עם ריכוזים שונים של גלוקוז (3 מ"מ, 6 מ"מ, 15 מ"מ ו -20 מ"מ גלוקוז).
    4. בשלב הבא, למקם את איון מראש מודגרות לאמצע החדר ולהתמקד ב 3-4 שכבות תאים לאיון בי, באיי מכרסמים, immunostaining לאינסולין מראה כי רוב התאים בטא תאים.
      הערה: SRB מתאר את כל קרום התא של איון במהירות ובאיון מוכן תמונה.
    5. השתמש במיקרוסקופ 2-פוטון עם מטרת 60x טבילת שמן (NA 1.42) ותוכנת הדמיה (למשל., ScanImage 11). איור 4 ממחישים הסדר מיקרוסקופיה טיפוסי. אירועי תמונה exocytic באמצעות SRB כקרום סמן תאי ניאון impermeant הנרגש פעימות לייזר פמטו-שניות ב880 ננומטר, עם הקרינה שזוהו ב550-650 ננומטר. רשום את תגובות איון לגירוי.
    6. לזהות אירועי exocytic אחת על ידי הופעתו הפתאומית של נקודת ניאון קטנה (רזולוציה של 10 פיקסלים /1; מ ') ולאשר על ידי השלב המהיר העולה של אות הניאון מעל אזור של עניין (~ 0.78 מיקרומטר 2).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תשואה וטיהור איון

לעכבר נורמלי סוג בר, כ -200 איים צפויים. איים בריאים נראים בהירים, בצורה עגולה ויש לי גבול חלק. אצווה בידוד מתעכל-על בדרך כלל יש איים קטנים ומטושטשים בזמן שיש אצווה-מתעכל תחת פחות איים ואיוני acinar תא מצורף (איור 3). לעכברי db / db סוכרת, תשואת איון וההופעה תלויה בהתקדמות המחלה עם עכברים גליקמי טובים יותר איים גדולים יותר, בהירים יותר ויותר (עד 300 איים) בהשוואה לעכברי גליקמי ג...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הגורם הקריטי ביותר בבידוד איון הוא זלוף הראשוני של הלבלב; תחת perfused תוצאות לבלב בתשואת איון נמוך משמעותי. גורמים אחרים משפיעים גם על איכות הבידוד כגון זמן העיכול והרמה של טלטול שיכול לפצות באופן חלקי לרמה של זלוף. לדוגמא, לבלב perfused באופן מלא יהיה צורך טופח על 37 מעלות צלזיוס במשך ~ 30 שניות 18 דקות בזמן שלוחץ בעדינות, בניגוד תחת מתעכל לבלב עשוי לדרוש ~ 20 דקות עם רעד עיכול קשה יותר. התערובת של שני אנזימי עיכול בידיים שלנו מספקת בידוד איון טוב יותר מאשר כל אחד לבד. לco...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענק של מועצת המחקר האוסטרלית DP110100642 (ל-PT) ומענקי המועצה הלאומית לבריאות ומחקר רפואי APP1002520 ו-APP1059426 (ל-PT ו-HYG).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Liberase TL 5 מ"גRoche-5401020001
קולגנאז מסוג IV-1gGibco-Life Technologies17104-019
Histopaque 1077 500 מ"לSigma Aldrich10771
RPMI 1640 בינוני (10x) 1LSigma AldrichR1383להכנת מדיה מבודדת
RPMI 1640 (1x) 500 מ"לGibco-Life Technologies21870-076להכנת מדיה מתורבתת
פניצילין-סטרפטומיצין 100 מ"לGibco-Life Technologies15140-122להכנת מדיה מתורבתת  
סרום בקר עוברי 500 מ"לGibco-Life Technologies10099-141להכנת מדיה מתורבתת
DMEM (מדיום הנשר השונה של Dulbecco)Gibco-Life Technologies11966-025לדילול תוכנית המטמורף של liberase
מכשירים מולקולריים, ארה"בלניתוח תמונות 2 פוטונים

מקורות

  1. Guariguata, L., et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035. Diabetes Research and Clinical Practice. 103, 137-149 (2014).
  2. Ashcroft, F. M., Rorsman, P. Diabetes mellitus and the beta cell: The last ten years. Cell. 148, 1160-1171 (2012).
  3. Weir, G. C., Bonner-Weir, S. Five stages of evolving beta-cell dysfunction during progression to diabetes. Diabetes. 53, S16-S21 (2004).
  4. Kjorholt, C., Akerfeldt, M. C., Biden, T. J., Laybutt, D. R. Chronic hyperglycemia, independent of plasma lipid levels, is sufficient for the loss of beta-cell differentiation and secretory function in the db/db mouse model of diabetes. Diabetes. 54, 2755-2763 (2005).
  5. Wang, Y. W., et al. Spontaneous type 2 diabetic rodent models. Journal of Diabetes Research. , (2013).
  6. Hummel, K. P., Dickie, M. M., Coleman, D. L. Diabetes a new mutation in mouse. Science. 153, 1127-1128 (1966).
  7. Do, O. H., Low, J. T., Gaisano, H. Y., Thorn, P. The secretory deficit in islets from db/db mice is mainly due to a loss of responding beta cells. Diabetologia. 57, 1400-1409 (2014).
  8. Low, J. T., et al. Glucose principally regulates insulin secretion in mouse islets by controlling the numbers of granule fusion events per cell. Diabetologia. 56, 2629-2637 (2013).
  9. Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet. Science. 297, 1349-1352 (2002).
  10. Low, J. T., et al. Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature. Diabetologia. 57, 1655-1663 (2014).
  11. Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomedical Engineering Online. 2, 13(2003).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Lepr dbSRB

מאמרים קשורים