מאמר שיטה

סנכרון של Caulobacter crescentus לחקירה של מחזור תא החיידק

DOI:

10.3791/52633

⸱

8 באפריל 2015

 , 
1Department of Developmental Biology, Stanford University School of Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סנכרון של תאי חיידקים חיוני למחקר על מחזור התא החיידקי והתפתחותו. Caulobacter crescentus ניתן לסנכרון באמצעות צנטריפוגה בצפיפות המאפשרת כלי מהיר ורב עוצמה לחקר מחזור התא החיידקי. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט לסנכרון תאי Caulobacter.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחזור התא חשוב לגדילה, שכפול גנום והתפתחות בכל התאים. בחיידקים, מחקרים על מחזור התא התמקדו בעיקר בתאים לא מסונכרנים, מה שמקשה על סדר האירועים הזמניים הנדרשים להתקדמות מחזור התא, שכפול הגנום וחלוקה. Caulobacter crescentus מספק מערכת מודל מצוינת למחזור תאי החיידקים לפיו ניתן לסנכרן במהירות תאים במצב G0 על ידי צנטריפוגת צפיפות. ניסויי סנכרון מחזור התא שימשו לקביעת האירועים המולקולריים השולטים בשכפול והפרדת הכרומוזומים, למיפוי רשת ויסות גנטית השולטת בהתקדמות מחזור התא ולזיהוי הקמת מתחמי איתות קוטביים הנדרשים לחלוקת תאים אסימטרית. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט לסנכרון מהיר של תאי Caulobacter NA1000. ניתן לבצע סנכרון בקנה מידה גדול עבור פרופיל ביטוי גנים ובדיקות כתם מערבי, כמו גם בפורמט בקנה מידה קטן עבור מיקרוסקופיה או מבחני FACS. יכולת הסנכרון המהירה ותפוקת התאים הגבוהה של Caulobacter הופכים את האורגניזם הזה למערכת מודל רבת עוצמה לחקר מחזור התא החיידקי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחזור תא החיידק שולט שני השכפול של הגנום וחלוקת תאי בת. חשוב לציין, כעמידות לאנטיביוטיקה היא איום הולך וגדל לבריאות ציבור, מחזור תא החיידק מציג יעד שלא נוצל לפיתוח אנטיביוטיקה.

בcrescentus Caulobacter החיידק, כל מחזור תא מוביל לחלוקה סימטרית, מניב שני תאי בת של גורלות שונים (איור 1 א) 1,2. תא בת אחת יורש השוטון והוא ניע ואילו הבת אחרת יורשת גבעול ונייח. מעגל משולב גנטי שולט התקדמות מחזור התא ותא גורל על ידי רגולציה תעתיק, phospho-איתות, וproteolysis המוסדרת 3. בנוסף, שכפול כרומוזום ותאים בת תשואת הפרדה במקביל המכילים עותק אחד בדיוק של כרומוזום 4. חשוב לציין, אלה שני סוגי התאים ניתן להפריד במהירות על ידי Colloצנטריפוגה idal חלקיקי סיליקה צפיפות במתח NA1000 synchronizable 5-7 המאפשר בידוד של תאי swarmer משאר האוכלוסייה עם תשואות גבוהות (איור 1). מבודד swarmer תאים ולאחר מכן להמשיך באופן סינכרוני באמצעות חלוקת תא סימטרית. כאן, אנו פירוט הפרוטוקול המשמשים לסנכרון NA1000 מתח Caulobacter. אנו מספקים פרוטוקולים ועצות לפתרון בעיות משותפות לשני סנכרונים מידה גדול וקטנה בקנה מידה. הליך ניסיוני זה מספק כלי רב עוצמה כדי לחקור את שליטת spatiotemporal של מחזור תא Caulobacter וגורל תא.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. בתיאום בקנה מידה גדולה - אופטימלי עבור מערבי כתם, Microarray / RNA-Seq, ומבחנים עתירי חומרים אחרים

  1. ממניות מקפיא או צלחת, לגדול 5 מיליליטר O / תרבות N של NA1000 מתח על ידי טלטול על 28 מעלות צלזיוס במדיום פאי.
  2. לחסן 0.5 מיליליטר של התאים משלב 1 ב 25 מיליליטר של M2G (לוחות 1-2) ולנער בגיל 28 ° C עד התרבות מגיעה OD 600 בין 0.5 ו -0.6.
  3. לחסן את התאים לתוך 1 ליטר של M2G ולנער על 28 מעלות צלזיוס.
  4. ברגע שמגיע OD 600 0.5-0.6, לאשר את קיומו של swarmer תאים באמצעות מיקרוסקופיה שלב הנוזלית רכוב. מקום 1 μl של תאים בשקופית זכוכית, לכסות עם תלוש כיסוי, ותמונה על ידי מיקרוסקופ שלב. לאשר את קיומם של תאי swarmer על ידי הדמיה תאים במהירות השחייה באוכלוסייה.
  5. ספין תאים במשך 15 דקות בשעה 7 kxg על 4 מעלות צלזיוס בJA-10 הרוטור.
  6. בטל supernatant ולהוסיף 180 מיליליטר של M2 הקר (לוחות 1-2) ומיל בעדינותuspend כל התאים באמצעות pipet סרולוגיות. בטל תאי pelleted רופף; הם תאי predivisional וצעדה.
  7. להוסיף 60 מיליליטר של תמיסת סיליקה Colloidal הקרה (הקפד לערבב את ההשעיה סיליקה Colloidal היטב לפני הוספה לתאים) ומערבבים את ההשעיה התא היטב.
  8. יוצקים את ההשעיה התא לשמונה 30 מיליליטר צינורות וספין למשך 30 דקות ב 6.4 kxg על 4 מעלות צלזיוס ב20-JA הרוטור.
    הערה: יש לראות את שתי להקות שונות; להקת swarmer היא הרצועה התחתונה בזמן שתאים ארבו / predivisional נמצאים בלהקה העליונה (איור 1).
  9. בזהירות לשאוב הלהקה העליונה והסר את הנוזל ל~ 1 סנטימטר מעל ללהקת swarmer (הלהקה התחתונה).
  10. (קריטי) שימוש pipet פסטר, להסיר בזהירות את להקת swarmer ומקום לתוך צינור נקי. כדי לשטוף את סיליקה Colloidal, ראש הצינור את עם M2 הקר וספין במשך 10 דקות ב 6.4 kxg על 4 מעלות צלזיוס ב20-JA הרוטור.
  11. להשליך בזהירות את supernatant ו resuspendתאים ב 20 מיליליטר של M2 הקר וספין במשך 10 דקות ב 6.4 kxg על 4 מעלות צלזיוס ב20-JA הרוטור.
  12. Resuspend כל כדורים לתוך 30 מיליליטר של M2 הקר ולמדוד את OD 600 באמצעות ספקטרופוטומטר וריק באמצעות מדיום M2 קר. להציל 1 μl הדמיה שלב כדי לבדוק swarmer תאים; 90-95% מתאים צריכים להיות swarmers.
  13. ספין למטה התאים 5 דקות בkxg 6.4 על 4 מעלות צלזיוס ב20-JA הרוטור. תאי Resuspend ב -28 ° C בינוני M2G כך ש600 הוא ~ 0.3-0.4 ולהתחיל רועד ב 28 מעלות צלזיוס.
    הערה: תשואות אופייניות הן בין 30 ל 60 מ"ל של swarmer תרבית תאים מ1 הליטר של תאים לא מסונכרנים.
  14. להתחיל לקחת נקודות זמן (תרבות מהסוג בר תיקח כ 135-140 דקות לחלק) 8,9. בכל נקודת זמן, למדוד את OD 600. בדוק שOD 600 לאחר החלוקה הוא כ 2X OD הראשוני 600.
  15. עבור מבחני כתם או ביטוי גנים מערביים, להסיר aliquots 1mL של מ"קlture בנקודות הזמן הרצוי, ספין למטה במהירות מקסימלית בצנטריפוגה שולחן למשך 30 שניות, מהירות למזוג או לשאוב את המדיום, ופלאש להקפיא את התא גלולה בחנקן נוזלי. אחסן את התאים ב -80 ° C עד ניתוח במורד הזרם.

2. בתיאום בקנה מידה קטנה - אופטימלי עבור מיקרוסקופית

  1. ממניות מקפיא או צלחת, לגדול 5 מיליליטר O / תרבות N רועדת ב 28 ° C בM2G.
  2. לדלל ב -15 מיליליטר של M2G (לוחות 1-2) ולגדול עד אמצע יומן (OD 600 = 0.5-0.6).
  3. ספין 6.4 kxg במשך 10 דקות ב 4 ° C ב20-JA הרוטור, וגלול ב 1 מיליליטר M2 (לוחות 1-2) קרים ולהעביר צינור microcentrifuge 2 מיליליטר.
  4. ספין ב 15 kxg במשך 3 דקות בצינור microcentrifuge לגלולת תאים, לשאוב את supernatant, לשים את הכדור על קרח, וגלול ב900 μl של M2 הקר.
  5. להוסיף 900 ​​μl של PVP הקר מצופה סיליקה וספין colloidal במשך 20 דקות ב 15 kxg על 4 מעלות צלזיוס במיקרופוןצינור rocentrifuge.
  6. (קריטי) לשאוב או pipet את החלק העליון ארבה / להקת תא predivisional ולאסוף התחתון swarmer להקה לתוך צינור microcentrifuge חדש.
  7. שוטף את תאי swarmer שתי פעמים ב 1 מיליליטר של M2 הקר תוך צנטריפוגה ב 15 kxg במשך 3 דקות.
  8. לפני הסיבוב האחרון, להעביר את התאים לתוך מבחנת זכוכית 1 מיליליטר מראש צונן ולמדוד את OD 600 של התאים בהשוואה לריק של M2.
  9. Resuspend תא גלולה הסופי ל -28 מעלות צלזיוס M2G בOD בין 0.3-0.4 ולנער תאים / גליל ב 28 מעלות צלזיוס.
    הערה: תשואות אופייניות הן בין 2 ל 4 מיליליטר של תרבית תאי swarmer.
  10. לניסויים במיקרוסקופ, בμl 1 מקום נקודות זמן הרצוי של תאים על גבי משטח agarose M2G להדמיה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סנכרון בדרך כלל תשואות שתי להקות של תאים (איור 1): להקת swarmer, שבו יש צפיפות גבוהה יותר, ולהקה ארבה / predivisional תא של צפיפות נמוכה יותר. כדי להבטיח בקרה משותפת סנכרון יעיל כוללת ניטור OD 600 ומדידת הרמות של חלבון CTRA על ידי כתם מערבי בנקודות זמן מחזור התא נפרדות. OD 600 צריך להגדיל בכ 2 לקפל במהלך מחזור התא (איור 2). הכתם המערבי לרגולטור הראשי מחזור התא CTRA הוא שליטה שימושית כדי לוודא תיאום טוב (איור 2).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחזור התא החיידקי הוא תהליך בסיסי בחיים וחשוב לחקר הגדילה וכמטרה לאנטיביוטיקה מהדור הבא. כאן, פירטנו את הליכי הסנכרון המהיר עבור C. crescentus NA1000, אורגניזם מודל לחקר מחזור התא החיידקי וחלוקת תאים אסימטרית. שיטה זו ניתנת לתיקון למבחני כתם מערבי, פרופיל ביטוי גנים ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לחקור את הוויסות המרחבי-זמני של מחזור התא החיידקי.

הפרוטוקול מהיר ומניב תאים מסונכרנים בריאים. שיטות סנכרון אחרות דורשות רעב ממושך של תאים ומסתמכות על התגובה המחמירה כדי לעצור את מחזור התא ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים לחברי מעבדת שפירו ולארין שרדר על ההערות על כתב היד. המחברים מודים לתמיכה כספית מ: מלגת פוסט-דוקטורט של NIH F32 GM100732 ל-JMS ומענקי NIH R01 GM51426 ו-R01 GM32506 ל-LS.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
סיליקה קולואידית מצופה PVP (פרקול)סיגמא-אולדריץ'P4937
סיליקה קולואידית (לודוקס AS-40)סיגמא-אולדריץ'420840
JA10 רוטורבקמן-קולטר369687
JA20 רוטורבקמן-קולטר334831
ברזל סולפט תמיסת כלאטסיגמא-אולדריץ'F0518
30 מ"ל צינורות צנטריפוגהקורנינג8445
Na2HPO4EMDSX0720-1
KH2PO4VWRBDH9268-500G
NH4ClAmresco0621-500g

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McAdams, H. H., Shapiro, L. System-level design of bacterial cell cycle control. FEBS Lett. 583, 3984-3991 (2009).
  2. McAdams, H. H., Shapiro, L. The architecture and conservation pattern of whole-cell control circuitry. J. Mol. Biol. 409, 28-35 (2011).
  3. McAdams, H. H., Shapiro, L. A bacterial cell-cycle regulatory network operating in time and space. Science. 301, 1874-1877 (2003).
  4. Ptacin, J. L., Shapiro, L. Initiating bacterial mitosis: understanding the mechanism of ParA-mediated chromosome segregation. Cell Cycle. 9, 4033-4034 (2010).
  5. Evinger, M., Agabian, N. Envelope-associated nucleoid from Caulobacter crescentus stalked and swarmer cells. J. Bacteriol. 132, 294-301 (1977).
  6. Tsai, J. W., Alley, M. R. Proteolysis of the Caulobacter McpA chemoreceptor is cell cycle regulated by a ClpX-dependent pathway. J. Bacteriol. 183, 5001-5007 (2001).
  7. Marks, M. E., et al. The genetic basis of laboratory adaptation in Caulobacter crescentus. J. Bacteriol. 192, 3678-3688 (2010).
  8. Ely, B. Genetics of Caulobacter crescentus. Methods Enzymol. 204, 372-384 (1991).
  9. Williams, B., Bhat, N., Chien, P., Shapiro, L. ClpXP and ClpAP proteolytic activity on divisome substrates is differentially regulated following the Caulobacter asymmetric cell division. Mol. Microbiol. 93, 853-866 (2014).
  10. Quon, K. C., Yang, B., Domian, I. J., Shapiro, L., Marczynski, G. T. Negative control of bacterial DNA replication by a cell cycle regulatory protein that binds at the chromosome origin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 120-125 (1998).
  11. Laub, M. T., Chen, S. L., Shapiro, L., McAdams, H. H. Genes directly controlled by CtrA, a master regulator of the Caulobacter cell cycle. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 4632-4637 (2002).
  12. Quon, K. C., Marczynski, G. T., Shapiro, L. Cell cycle control by an essential bacterial two-component signal transduction protein. Cell. 84, 83-93 (1996).
  13. Ferullo, D. J., Cooper, D. L., Moore, H. R., Lovett, S. T. Cell cycle synchronization of Escherichia coli using the stringent response, with fluorescence labeling assays for DNA content and replication. Methods. 48, 8-13 (2009).
  14. Degnen, S. T., Newton, A. Chromosome replication during development in Caulobacter crescentus. J. Mol. Biol. 64, 671-680 (1972).
  15. Bates, D., et al. The Escherichia coli baby cell column: a novel cell synchronization method provides new insight into the bacterial cell cycle. Mol. Microbiol. 57, 380-391 (2005).
  16. Abel, S., et al. Bi-modal distribution of the second messenger c-di-GMP controls cell fate and asymmetry during the caulobacter cell cycle. PLoS Genet. 9, e1003744(2013).
  17. Johnson, R. C., Ely, B. Isolation of spontaneously derived mutants of Caulobacter crescentus. Genetics. 86, 25-32 (1977).
  18. Britos, L., et al. Regulatory response to carbon starvation in Caulobacter crescentus. PLoS One. 6, e18179(2011).
  19. Boutte, C. C., Crosson, S. The complex logic of stringent response regulation in Caulobacter crescentus: starvation signalling in an oligotrophic environment. Mol. Microbiol. 80, 695-714 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Swarmer cellsWestern BlotCTRA

מאמרים קשורים