Method Article

Multiwell הנוקשות Assay לחקר תגובות תא הנוקשת תלויות מבוסס polyacrylamide פשוטה

DOI:

10.3791/52643

⸱

March 25th, 2015

 ,  , 
1Biomedical Engineering Department, Saint Louis University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן מתוארת שיטה המאפשרת הכנה מהירה, יעילה וזולה של ג'לים פוליאקרילאמיד בפורמט צלחת מרובת בארות. השיטה אינה דורשת ציוד מיוחד וניתן לאמץ אותה בקלות על ידי כל מעבדת מחקר. זה יהיה שימושי במיוחד במחקר המתמקד בהבנת תגובות תאים תלויות נוקשות.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כיום, רוב המחקר בתאי מבחנה מבוצע על פוליסטירן קשיח בתרבית רקמה (~1 GPa), בעוד שרוב התאים בגוף מחוברים למטריצה אלסטית ורכה בהרבה (0.1 - 100 kPa). מכיוון שחוסר התאמה של קשיחות כזו משפיע מאוד על תגובות התאים, יש עניין רב בפיתוח חומרי הידרוג'ל המשתרעים על פני טווח רחב של קשיחות כדי לשמש כמצעי תאים. ג'לים פוליאקרילאמיד, שהם זולים ומכסים את טווח הנוקשות של כל הרקמות הרכות בגוף, הם ההידרוג'ל המועדף על קבוצות מחקר רבות. עם זאת, הכנת ג'ל פוליאקרילאמיד היא ארוכה, מייגעת ומתאימה רק לקבוצות קטנות. כאן, אנו מתארים בדיקה אשר על ידי שימוש בסרט פלסטיק גמיש קבוע כתמיכה מבנית לג'לים, מאפשרת הכנת ג'לים פוליאקרילאמיד בפורמט צלחת מרובת בארות. הטכניקה מהירה יותר, יעילה יותר ופחות יקרה מהשיטות הנוכחיות ומאפשרת הכנת ג'לים בגדלים מותאמים אישית שאינם זמינים אחרת. מכיוון שהיא אינה דורשת ציוד מיוחד, השיטה יכולה להיות מאומצת בקלות על ידי כל מעבדת מחקר ותהיה שימושית במיוחד במחקר המתמקד בהבנת תגובות תאים תלויות נוקשות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רוב הרקמות בגוף הן חומרי viscoelastic רכים עם מודול יאנג הנע בין 0.1 kPa למוח עד 100 kPa לסחוס רך, עדיין, רובם במחקר בתאים במבחנה מתבצע על קלקר תרבית רקמה (TCP) שבו יש מודול של ~ 1-GPA . 1 התאמה נוקשות זו מאוד משפיעה על הדרך בה תאים מגיבים לסביבתם. גוף הולך וגדל של מחקר הוא בכך מסור להבהרת ההשפעה של מצע נוקשות על גורלם של סוגי תאים שונים, 2,3 כולל תאי גזע. 4 כתוצאה מכך, הידרוג מרובה פותחו כדי לסייע בהבנה של תא נוקשות תלויה הביולוגיה כולל polyacrylamide (PA), פוליאתילן גליקול 5-7 (PEG), 8,9 polydimethylsiloxane (PDMS), 10 ואלגינט. 11 בעוד ההוכחה לכך שיש מצע נוקשות השפעה מהותית על גורל תא גדלה, רוב המחקרים שנערכו ב בקנה מידה קטנה עם מספר קטן של samples. מחקרים שיטתיים, רב-ממדיים על ההשפעה של מצע נוקשות למערך של סוגי תאים או תנאים סביבתיים הם נדירים. 12

מספר טכנולוגיות הידרוג'ל תפוקה גבוהה מבטיחות פותחו, כולל microarrays מבוסס PEG, 13 מכשירים microfluidic לייצור microbeads agarose הידרוג'ל, 14 או מיקרו וננו-מוטות שבו קשיחות היא מווסת על ידי הקוטר והגובה של microrods. 15 עם זאת , הטכנולוגיות להכנת מצעים כאלה הם מתוחכמים וזמינים למספר מוגבל של מעבדות. מחקרים רבים מעורבים תגובות תא נוקשות מווסתת מנצל polyacrylamide ג'לי (PA) שהם לא רק זולים ופשוטים ליישום, אלא גם להציג מגוון רלוונטי מבחינה פיזיולוגית של מודול יאנג, כלומר 0.3 -. 300 kPa 16-22 עם זאת, קיימים שיטות לפברק הרשות הפלסטינית ג 'לים תרבית תאים הם עבודה אינטנסיבית וכתוצאה מכך הכנהared בקבוצות קטנות. חלק מהקשיים הכרוכים בהכנה של ג'לי הרשות הפלסטינית כמו מצעי תאי גזע מהדרישה שג'לים צריך להיות מוכן: 1) בהעדר החמצן כדי לאפשר פילמור מלא, 2) עם משטח שטוח וחלק להתיר תא אחיד התקשרות והפצה, ו 3) באופן קבוע המודבק בתחתית של צלחת תרבית תאים כדי למנוע צף.

כמה קבוצות ניסו לייצר ג'לי רשות לתרבית תאים בקבוצות גדולות. Semler et al. גיליונות עבים מוכנים של ג'לי הרשות הפלסטינית שהיו אז "לחתוך" עם ניקוב חורים והניחו לתוך 96-גם צלחות. 23 עם זאת, שיטה זו מוגבלת לג'לים נוקשה, כלומר,> 1 kPa במודול יאנג, כי רך יותר ג 'הם "דביק", קשה לחתוך, ונפגע בקלות. MIH et al. פיתח טכניקה מתוחכמת יותר המאפשרת לג'לים להיות polymerized ישירות בצלחת multiwell זכוכית תחתונה. 6 זו הושגה על ידי שפיכת פתרונות ג'ל לצלחות זכוכית תחתונה פונקציונליות ויצירת ג'לים על ידי "הרבדה" אותם עם מערך coverglass המותאם אישית. 6 למרות שהשפעות קצה מבטיחות מאוד, קלות עדיין נצפו עם טכניקה זו. בנוסף, הטכניקה דורשת מערך אישית מעוצב לא נגיש באופן מיידי למעבדות רבות, כמו גם צלחות multiwell זכוכית תחתונה יקרות.

מאמר זה מתאר דרך פשוטה וזולה כדי להרכיב ג'לי הרשות הפלסטינית בצלחת multiwell שאפשר לאמץ בקלות על ידי כל מעבדה. כאן, תמיכת פלסטיק גמישה מנוצלת, שבו יש שני צדדים - אחד הידרופובי, שהוא דוחה לג'לי הרשות הפלסטינית, ואחד הידרופילי, שנקשר קוולנטית ג'ל הרשות הפלסטינית על תצהיר. ברגע גיליונות ג'ל הרשות הפלסטינית מופקדים וקבוע מודבקים תמיכת פלסטיק הגמישה, זה מאפשר טיפול בג'לים של כל עובי או נוקשות וחיתוכם לכל צורה רצויה. appr זהאוח לא רק מייצר מותאם אישית 'coverslips' הפלסטיק בגדלים לא אחר זמין מסחרי, אבל גם מונע את הצורך לטיפול מקדים משטחי זכוכית, או coverslips זכוכית או בארות של צלחות multiwell זכוכית תחתונה יקרות, עם פתרון הרשות הפלסטינית מחייב, שהוא מייגע וצעד זמן רב. לבסוף, ניתן להכין גיליונות ג'לי הרשות הפלסטינית אחידים בקבוצות גדולות ומאוחסנים דה-hydrated במשך כמה חודשים.

לסיכום, assay שהוצג כאן הוא שיפור פני שיטות קיימות במספר היבטים. ראשית, התהליך של הרכבה צלחת multiwell הוא יעיל, ואת העלות הכוללת של חומרים הדרושים היא נמוכה. שנית, הידרוג מיוצר בקבוצות גדולות בסרט ג'ל הומוגנית אחת. לבסוף, רק חומרים שהם זמינים מסחריים נדרשים. השירות של assay מודגם על ידי לחקור את ההשפעה של מצע נוקשות על מורפולוגיה של תאים ומתפשטים באזור.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנה של הפתרונות וAliquots קשורים-Hydrogel

  1. הכנת הפתרון מבשר ג'ל polyacrylamide.
    1. הכן פתרון מבשר ג'ל polyacrylamide על ידי ערבוב acrylamide (א) (40% w / v, M r 71.08 g / mol), bisacrylamide crosslinker (ב) (2% w / v, M r 154.17 g / mol), ודה מים מיוננים באחוזי הנפח שצוינו בטבלה 1.
      הערה: ניתן להכין פתרונות אלה בקבוצות גדולות ומאוחסנים על 4 מעלות צלזיוס עד למספר חודשים.
      1. זהירות: Acrylamide הוא רעיל על שאיפה או בליעה, במיוחד, כאשר בצורת אבקה: כך, רצוי להשתמש 40% w / v פתרון לצמצום סיכוני רעילות. לטפל רק בעת לבישת ביגוד מגן, כגון כפפות, משקפי מגן, וחלוק מעבדה. חנות במכל אור-עמיד, סגור היטב במקרר (<23 ° C, מאוורר היטב באזור).
      2. זהירות: Bis-acrylamide הוא רעיל על שאיפה או בליעה, במיוחד,כאשר בצורת אבקה: כך, רצוי להשתמש 2% w / v פתרון לצמצום סיכוני רעילות. לטפל רק בעת לבישת ביגוד מגן, כגון כפפות, משקפי מגן, וחלוק מעבדה. חנות במכל אור-עמיד, סגור היטב במקרר (4 מעלות צלזיוס האזור <, מאוורר היטב).
  2. הכנה ושימוש של N -Sulfosuccinimidyl-6- (4'-azido-2'-nitrophenylamino) hexanoate (Sulfo-SANPAH, M r 492.40 g / mol) aliquots. זהירות: Sulfo-SANPAH גורמת לגירוי חמור בעיניים; להתמודד עם כפפות ועין נכונה או פנים הגנה. חנות ב -20 ° C עם קבלה ולפני aliquoting.
    1. כדי לאחסן sulfo-SANPAH: לפזר Sulfo-SANPAH בdimethylsulfoxane (DMSO) בשעה 50 מ"ג / מיליליטר. Aliquot פתרון המניות לתוך 50 צינורות צנטריפוגה מיקרו 20 μl לכל צינור. הקפאת Flash על קרח יבש או בחנקן נוזלי (צעד אופציונאלי, אך העדיף לשמור על יעילות מקסימלית crosslinker) ולאחסן ב -80 ° C.
      הערה: aliquots can להיות מאוחסן במשך מספר חודשים.
    2. כדי להשתמש בsulfo-SANPAH: להפשיר בקצרה aliquot ולדלל ב480 μl מים דה המיונן. השתמש באופן מיידי. Sulfo-SANPAH hydrolyzes במהירות במים: לכן לקחת בזהירות לבצע את כל השלבים לעיל במהירות.
  3. הכנת persulfate אמוניום (M r 228.18 g / mol) aliquots.
    הערה: persulfate אמוניום גורם העין, עור ומערכת נשימה. ללבוש ציוד מגן אישי מתאים בעת הטיפול. ידית אבקת persulfate אמוניום במנדף הכימי. אבקה יש לאחסן במקום יבש ומאוורר היטב. ברגע שaliquoted, התמיסה מהולה יכולה לשמש על ספסל העבודה.
    1. לפזר persulfate אמוניום במים ללא יונים כדי להשיג ריכוז persulfate אמוניום סופי של 10% w / v. Aliquot ולאחסן ב -20 ° C. להפשיר מייד לפני השימוש.
  4. הכנה של קולגן Type I פתרון.
    1. הכן 0.2 מ"ג פתרון קולגן מיליליטר / על ידי דילול המניות כל כך-פתרון מלוחים 1x פוספט (PBS) של pH 7.4. אחסן בבקצרה קרח או להשתמש מייד עם דילול.

2. Hydrogel הכנה (עיין באיור 1)

  1. הכנת שקופיות זכוכית הידרופובי.
    1. מניחים כמה טיפות של פתרון הידרופובי על צלחת זכוכית ולהשתמש בנייר רקמה להתפשט על פני המשטח. בואו אוויר יבש ולנגב עם נייר טישו שוב אפילו את הציפוי הידרופובי.
      הערה: פתרון הידרופובי חנות בקבינט דליק בRT. ללבוש ציוד מגן אישי בעת הטיפול. עובד באזור מאוורר היטב.
  2. הכנת תמיכת פלסטיק גמישה.
    1. חותך את תמיכת פלסטיק הגמישה כדי להתאים את הגודל של צלחת הזכוכית מצופה הידרופובי.
    2. סמן את הצד הידרופובי של תמיכת פלסטיק הגמישה באורח קל מגרד את פני השטח עם כלי חד כמו סכין מנתחים.
      הערה: לאחר ג'ל - שהוא שקוף לחלוטין - מתייבש, השריטות יעזרו להבחין באיזה צד תמיכת פלסטיק גמיש מכיל ג'ל.
      הערה: יש תמיכת הפלסטיק הגמישה הידרופובי וצד הידרופילי. שהופקד ברגע, polyacrylamide באופן קבוע שומרת על הצד הידרופילי של תמיכת פלסטיק המאפשרת טיפול הידרוג'ל שלאחר מכן קל.
  3. ג'ל הכנה (ניתנים כרכי דוגמא לפתרונות מבשר ג'ל 5 מיליליטר).
    הערה: 5 מיליליטר יהיה מספיק כדי לייצר ~ 40 ג 'לים, כאשר העובי הראשוני ג'ל הוא 0.5 מ"מ. ניתן לייצר יותר ג'לי אם עובי ג'ל מצטמצם.
    1. הנח 4,972.5 μl של פתרון מבשר polyacrylamide של ריכוז סופי רצוי (טבלה 1) לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר. מניחים בתא degassing למשך 30 דקות עם המכסה נפתח.
      הערה: מעשי חמצן כמלכודת רדיקלים חופשית וכאשר קיימים, הוא מעכב פילמור.
    2. הוסף 25 μl של 10% w / v persulfate אמוניום (עיין להצביע 1.3) כדי להשיג סופיריכוז persulfate אמוניום של 0.05%.
    3. להוסיף 2.5 μl של N, N, N ', tetramethylethylenediamine N'- (TEMED, M r 116.24 g / mol) לפתרון ג'ל degassed כדי להשיג ריכוז TEMED סופי של 0.5%.
      הערה: חנות TEMED בקבינט דליק בRT. ידית במנדף כימי כאשר לובשים ציוד מגן אישי מתאים. שמור סגור היטב תחת גז אינרטי, כפי שהוא מאוד אוויר ולחות רגישה.
    4. מערבבים את הפתרון בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה 3-5 פעמים. לא מערבולת כדי למנוע דיפוזיה חמצן לתוך התמיסה המבשרת ג'ל.
    5. פיפטה פתרון ג'ל על הצד הידרופילי של תמיכה הגמישה מפלסטיק וכריך עם שקופיות זכוכית מצופים הידרופובי. להפריד בין שתי שקופיות עם מפרידי סיליקון בעובי רצוי (למשל, 0.5 מ"מ). להשאיר כמות קטנה (~ 100 μl) של פתרון מבשר פולימר בצינור חרוטי 50 מיליליטר לשימוש כמדד לgelation.
      הערה:יכול לשמש כל spacer. לדוגמא, רצועה אחת של Parafilm נותנת עובי ג'ל נפוח סופי של 100-120 מיקרומטר.
    6. מניחים צלחת זכוכית אחרת על גבי כריך התמיכה / ג'ל פלסטיק גמיש כדי לוודא משטח אפילו הידרוג'ל על פילמור.
    7. בואו ג'ל לפלמר במשך 45 דקות, למרות שפחות זמן יכול לשמש לג'לים של wt% גבוה יותר אם תרצה בכך. כדי לוודא שהג'ל polymerized, להתבונן הפתרון שנותר בצינור חרוטי 50 מיליליטר; אם הפתרון שנותר יש gelled, אז סביר להניח שgelation על צלחת הזכוכית כבר ביוזמת גם כן. עם זאת, שימו לב כי פתיחה מוקדמת של העובש תמנע פילמור מלא.
    8. ברגע שנוצר קריש, לקלף את תמיכת פלסטיק הגמישה עם ג'ל polyacrylamide המצורף קוולנטית על גבי, ולהגדיר ג'ל-עין לייבוש באוויר.
      הערה: גם הסעה או ייבוש בחום ניתן להשתמש כדי להאיץ את הצעד הזה. ברגע שהתייבש על תמיכת פלסטיק הגמישה, ג'ל יכול להיות חנותד ללא הגבלת זמן.
      1. לסמן כל כתמים חשופים של תמיכת פלסטיק הגמישה, שבו ג'ל polyacrylamide לא להיווצר עקב בועות. מארק ואילו הג'ל עדיין התייבשות כמו זה יהיה להתמזג עם תמיכת פלסטיק הגמישה פעם ג'ל הוא יבש.

3. אסיפת multiwell פלייט, קולגן ציפוי, ועיקור

  1. הרכבה צלחת multiwell.
    1. ברגע מיובש, לחתוך ג'לי הרשות הפלסטינית לצורות הרצויות.
      1. לצלחת 96-היטב, להשתמש בניקוב חורים כבד בקוטר של 6 מ"מ ~. השתמש בחותך נייר כבד לחתוך ג'ל לצורות מרובעות או מלבניות. לחלופין, להשתמש במספריים.
    2. הכן כ -500 μl של PDMS לכל צלחת 96-גם על פי הוראות היצרן. להדביק את ג'לי לתחתית צלחת multiwell, מקום טיפה קטנה (~ μl 5) של polydimethylsiloxane (PDMS) במרכזה של כל טוב. בעזרת מלקחיים, למקם polyacrylamid אחדג'ל דואר בצד כל הטוב, גמיש מפלסטיק תמיכה במורד. כדי לאפשר PDMS לרפא, לעזוב את הצלחת התאסף על 37 מעלות צלזיוס למשך תקופה מינימאלית של 4 שעות.
  2. ציפוי קולגן של ג'לים polyacrylamide.
    1. עם טפטפת העברה, הנח כמות קטנה (7-8 μl) של sulfo-SANPAH (עיין להצביע 1.2.2) בכל טוב ומערבולת מצד לצד למעייל משטח ג'ל באופן שווה. לעבוד מייד מאז sulfo-SANPAH אינו יציב במים.
    2. מניחים את הצלחת גם תחת מנורת UV בעוצמה גבוהה (עוצמת = 37 mW, λ = 302-365 ננומטר) למשך 5 דקות. יש לשטוף את ג'לי עם PBS להסיר sulfo-SANPAH העודף.
    3. פיפטה 50 μl של 0.2 מ"ג / מיליליטר קולגן Type I פתרון (ראה להצביע 1.4) גם לכל אחד. השאר את הצלחת מכוסות בRT לפחות 2 שעות או O / N ב 4 מעלות צלזיוס.
      הערה: כדי לזרז את התהליך של ציפוי קולגן, פיפטה העברה יכולה לשמש כדי להוסיף את פתרון קולגן. בדרך כלל, 1-2 טיפות של תמיסה צריכה להיות מספיק כדי להשליםly לכסות את פני השטח ג'ל.
    4. השאר את הצלחת גם בRT לפחות 2 שעות כדי לאפשר מליטה קולגן.
    5. לשטוף עם PBS להסיר פתרון קולגן עודף ולעקר תחת UV (λ = 200 ננומטר) בשכונת תרביות רקמה עבור שעה 2.
    6. משרים את ג'לי במדיום מלא (ראה סעיף 4.1 למדיום הרכב) O / N מימה ולאזן. השתמש לתא זריעה באופן מיידי או בחנות במקרר לתקופה של עד 2 ימים.

4. זריעת תאים ברשות הפלסטינית הנוקשות Assay

הערה: למרות שאופייני לשורות תאים יונקים משותפות, הפרוטוקול המפורטים בסעיף זה באופן ספציפי בשימוש עם סרטן שד שורת תאי מד"א MB-231 (ראה איורים 4 ו -5).

  1. איסוף תאים מבקבוק תרבות רקמה על ידי חשיפה ל5% טריפסין / EDTA במשך 5 דקות על 37 מעלות צלזיוס. השתמש ~ 80 μl של טריפסין / EDTA לכל 2 סנטימטר של שטח בקבוק תרבות; לדוגמא, השתמש 2 מיליליטר של טריפסין / EDTA fora T25 בקבוק תרבית תאים. מחדש להשעות תאים שנאספו במדיום מלא בתוספת סרום 10% שור עוברי (FBS) ופניצילין 1% / סטרפטומיצין בריכוז תא סופי רצוי. אם ניקח בחשבון זמן הכפלת תאים, כמו גם את משך זמן התאים יהיו זרע על assay, לבחור ריכוז תא תת-מחוברות מתאימה. ודא שהוסיף בינוני מספיק כדי להטביע את הידרוג לחלוטין.
    הערה: מאחר הידרוג כבר מראש equilibrated בתקשורת (ראה צעד 3.2.6) 100 μl נפח צריך להיות מספיק. כרכים בינוניים טיפוסיים המשמשים לצלחות multiwell צריכים להיות מספיק מאז ג 'כבר מראש equilibrated בתקשורת בשלב הקודם.
    הערה: assay יהיה מתאים לכל סוג תא מצורף תלויה.
    1. ספירת תאים מספר תחת מיקרוסקופ הפוכה באמצעות hemacytometer. טען 10 μl של תא השעיה לכל יציאת hemacytometer ומחשבים את ממוצע ספירת תאים מלפחות 8 רביעים. כדי לקבל אתריכוז תא סופי, להכפיל את ספירת תאים על ידי 10 4.
      הערה: תוצאות ספירת תאים הטובות ביותר מתקבלות כאשר מספר תאים בכל רבע hemacytometer הוא 20-50.
  2. תרבות התאים על assay נוקשות הרשות הפלסטינית בחממה humidified על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. שינוי בתקשורת כל 2-3 ימים. איסוף תאים בעת צורך על ידי חשיפה ל5% טריפסין / EDTA על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. השתמש ~ 80 μl של טריפסין / EDTA לסנטימטר 2 של בקבוק בתרבית רקמה. במהלך כל שלבי המניפולציה התא, לקבל טיפול מיוחד שלא לשבש את פני השטח הידרוג'ל: לשאוב או בינוני פיפטה על ידי מעט להטות את צלחת multiwell הצידה ונוגע בקצה פיפטה על הקיר הצדדי של כל אחד גם, בניגוד לנגיעה בהידרוג'ל.
    הערה: פרט לטיפול מיוחד שלא לפגוע במשטח הידרוג'ל במהלך טיפול בתרבית רקמה רגיל, התאים שנזרעו על assay הנוקשות ניתן להשפיע באותה הצורה כמו אם הם היו זורעים בלצלחת multiwell רגילה.

5. הדמיה של תאים שנזרעו על הרשות הפלסטינית הנוקשות Assay

  1. תאי תמונה ישירות על assay נוקשות הרשות הפלסטינית.
    הערה: כל מיקרוסקופ - הפוך, או confocal ניאון, יכולה לשמש להדמית תא.
    הערה: תמיכת הפלסטיק הגמישה המשמשת לבניית assay הנוקשות היא שקופה לחלוטין ואינה autofluoresce או להפריע להדמית תא. עם זאת, למרות שתמיכת פלסטיק הגמישה עצמו היא שקופה, יכולות הדמיה תהיה מוגבלות על ידי מרחק העבודה של המטרה. יש תמיכת הפלסטיק הגמישה בעובי של 0.23 מ"מ ומרחק עבודה טיפוסי של מטרת 10X הוא ~ 4 מ"מ, בחדות יורדת להגדלות גדולות יותר.
    1. הדמיה תא חי, עמדת assay נוקשות הרשות הפלסטינית בבעל צלחת מיקרוסקופ ותמונה. שמור פגישות הדמיה תחת 2 שעות, או להשתמש במיקרוסקופ מצויד בתא סביבתי לפעמי הדמיה עוד.
    2. כאשר im תא החיההזדקנות היא לא המטרה, לתקן תאים 4% תמיסת פורמלדהיד בתוספת חומרי ניקוי 0.1%. משרים תאים במקבעים ב RT עבור מינימום של 2 שעות. לשטוף עם PBS פעמיים. השלך פסולת מקבע במכל פסולת מיועד.
      ניתן הדמיה תאים באופן מיידי או מאוחסנים שקוע בPBS על 4 מעלות צלזיוס עד 2 שבועות: הערה. זהירות: פורמלדהיד הוא רעיל על שאיפה ומגע. ידית עם כפפות במנדף הכימי.
      הערה: פרוטוקול קיבוע תא צריך להיות נבחר על סמך פרוטוקולי מכתים תא וטיפול שלאחר מכן, משום שfixatives מסוים לפגוע כמה חלבוני תא.
    3. להדמית ניאון, כתם קבוע תאים עם כתם תא רצוי ישירות בצלחת multiwell. תמונה באופן מיידי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Polyacrylamide הידרוג (PA) נמצא בשימוש נרחב כדי לבדוק את תגובות תא נוקשות תלויה. 17,24 על ידי ערבוב ריכוזים שונים של acrylamide () וbis-acrylamide (B) אחד יכול לעשות ג'לי הרשות הפלסטינית כי היקף מגוון הנוקשות של רוב הרקמות הרכות ב הגוף - 0.3 -.. 300 מודולוס של kPa הצעיר 1 עם זאת, הכנת ג'לים polyacrylamide היא מייגעת ביותר זמן, לעתים קרובות מגביל את השימושיות שלהם ביישומים "תפוקה גבוהה" כמו להקרנת דוגמא תרופת 12 הנה, שיטה פשוטה ומהירה ל הרכבת ג'לי ה...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ג'ל polyacrylamide, שפותח במקור עבור אלקטרופורזה, 28 המשמשים כיום באופן שיגרתי כמו מצעי תרבית תאים כדי לחקור את ההשפעות של מצע נוקשות על מורפולוגיה של תאים, תנועתיות, ותקשורת 3,24,29 בין מאפייני תא אחרים. Polyacrylamide מאפשרת מניפולציה של מצע נוקשות להקיף את הנוקשות של כל הרקמות הרכות בגוף (.3-300 kPa) 1 עם שינוי פשוט בריכוז מבשר פולימר (איור 2, טבלת 1, ראה גם אזכור 17,25,26). מצמידים את העובדה שהרשות פלסטינית ג'...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו מומנה על ידי קרנות הזנק שניתנו לד"ר סילביה זוסטיאק על ידי אוניברסיטת סנט לואיס וכן על ידי מענק קרן המחקר של הנשיא (PRF) שהוענק לד"ר סילביה זוסטיאק על ידי אוניברסיטת סנט לואיס. אנו מודים לנוויד אחמד וקוואל שאה על הסיוע הטכני.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<חזק>ריאגנטים
40% אקרילאמידביו-ראד161-0140
2% ביס-אקרילאמידביו-ראד161-0142
אמוניום פרסולפטביו-ראד161-07000
TEMEDסיגמא אולדריץ'T9281
סולפו-SANPAHתרמו סיינטיפיק22589
קולגן סוג 1, מזנב חולדה, 3.68 מ"ג/מ"לBD Biosciences354236
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)Fisher ScientificBP231-100
תמיסה הידרופובית — Repelé SilaneGE Healthcare Bio-Sciences17-1332-01
PBS (1x), pH 7.4HyCloneSH30256.01
Polydimehylsiloxane (PDMS) [ערכת אלסטומר Slygard 182]דבקי Elsworth3097358-1004
Tyrpsin/EDTA (10x)Sigma Aldrich44174
RPMI-1640 בינוני (1x)HyCloneSH30027-02
סרום בקר עובריHyCloneSH30073-03
פניצילין סטרפטומיציןMP ביומדיקל1670046
חומר ניקוי: Triton-XSigma AldrichT8787
פורמלדהיד 37% תמיסהסיגמא אולדריץ'F1635
סרום בקר אלבומין (BSA)סיגמא אולדריץ'A2153
ערכת חסימת הידבקות תאים מבוססת BSA — ערכת מערך הידבקות תאים ECMChemicon InternationalECM540
<חזק>ציוד מעבדה חד פעמי
גמיש תומך פלסטיק — GelBond PAG סרט לג'לים פוליאקרילאמיד GEHealthcare Bio-Sciences309819
צלחות זכוכיתSlumpysGBS4100SFSL
50 מ"ל צינורות חרוטייםFisher Scientific3181345107
15 מ"ל צינורות חרוטייםFALCON352097
צינורות מיקרו צנטריפוגהפישר סיינטיפיק2 מ"ל:
96 בארות (תחתית שטוחה)12565501פישר סיינטיפיק
(1  מ"ל, 2  מ"ל, 5  מ"ל, 10  מ"ל, 25  מ"ל, 50  מ"ל)פישר סיינטיפיק1 מ"ל: 13-678-11B, 2  מ"ל: 05214038, 5  מ"ל (FALCON): 357529, 10  מ"ל: 13-678-11E, 25  מ"ל: 13-678-11, 50  ml: 13-678-11F
פיפטות העברת זכוכיתפישר סיינטיפיק5 3/4 אינץ': 1367820A, 9 אינץ': 136786B
קצות פיפטות (1-200  μ l, 101-1000  μ l)פישר סיינטיפיק2707509
פיפטות העברה חד פעמיות סטנדרטיות מפלסטיקפישר סיינטיפיק13-711-9D
ParafilmPARAFILM כפפות בדיקה ללא אבקה PM992
Quest92897
מרווחי סיליקון — יריעת סיליקון, עובי 0.5 מ"מ/13 ס"מ x 18 ס"מגרייס ביו-לאבסJTR-S-0.5<
קל ופלואורסצנטי (Axiovert 200M)Zeiss
ZeissAxioVision Rel. 4.8.2
תנורUV UVITRON UV1080
תא ואקום/מסיר גזיםBelArt999320237
משאבת ואקום למסיר גזיםKNF Lab5097482
קולט אדים לתרבית רקמותNUAIRE NUAIRENU-425-600
קולט אדים כימיKEWAUNEE99151
מיקרוסקופ הפוך (Axiovert 25)חממת Zeiss663526
NUAIRENU-8500
פיפטה איידדראמונד סיינטיפיק ושות'P-76864
המציטומטרקו בהיר383684
צלחת 02681258 פיפטות חד פעמיות td colspan="4" ><חזק>ציוד מעבדה גדול/לא חד פעמיתוכנת מיקרוסקופ 3820005619

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Levental, I., Georges, P. C., Janmey, P. A. Soft biological materials and their impact on cell function. Soft Matter. 3, 299-306 (2007).
  2. Minton, K. Mechanotransduction: A stiff response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (8), 500-500 (2014).
  3. Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell motility and the cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).
  4. Watt, F. M., Huck, W. T. Role of the extracellular matrix in regulating stem cell fate. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (8), 467-473 (2013).
  5. Zustiak, S., Nossal, R., Sackett, D. L. Multiwell stiffness assay for the study of cell responsiveness to cytotoxic drugs. Biotechnology and bioengineering. 111 (2), (2014).
  6. Mih, J. D., et al. A multiwell platform for studying stiffness-dependent cell biology. PLoS One. 6 (5), e19929(2011).
  7. Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response. PloS one. 7 (10), e46107(2012).
  8. Herrick, W. G., et al. PEG-phosphorylcholine hydrogels as tunable and versatile platforms for mechanobiology. Biomacromolecules. 14 (7), 2294-2304 (2013).
  9. Tokuda, E. Y., Leight, J. L., Anseth, K. S. Modulation of matrix elasticity with PEG hydrogels to study melanoma drug responsiveness. Biomaterials. 35 (14), 4310-4318 (2014).
  10. Feng, J., et al. Substrate stiffness influences the outcome of antitumor drug screening in vitro. Clinical hemorheology and microcirculation. 55 (1), 121-131 (2013).
  11. Ramamoorthi, K., Hara, J., Ito, C., Asuri, P. Role of Three-Dimensional Matrix Stiffness in Regulating the Response of Human Neural Cells to Toxins. Cellular and Molecular Bioengineering. 7 (2), 1-7 (2014).
  12. Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PloS one. 5 (9), e12905(2010).
  13. Gobaa, S., et al. Artificial niche microarrays for probing single stem cell fate in high throughput. Nature methods. 8 (11), 949-955 (2011).
  14. Kumachev, A., et al. High-throughput generation of hydrogel microbeads with varying elasticity for cell encapsulation. Biomaterials. 32 (6), 1477-1483 (2011).
  15. Fu, J., et al. Mechanical regulation of cell function with geometrically modulated elastomeric substrates. Nature Methods. 7 (9), 733-736 (2010).
  16. Pelham, R. J., Wang, Y. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (25), 13661-13665 (1997).
  17. Tse, J. R., Engler, A. J., et al. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current protocols in cell biology / editorial board, Juan S. Bonifacino ... [et al.]. 10 (Unit 10 16), (2010).
  18. Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell motility and the cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).
  19. Lo, C. -M., Wang, H. -B., Dembo, M., Wang, Y. -l Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical journal. 79 (1), 144-152 (2000).
  20. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  21. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -l Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  22. Young, D. A., Choi, Y. S., Engler, A. J., Christman, K. L. Stimulation of adipogenesis of adult adipose-derived stem cells using substrates that mimic the stiffness of adipose tissue. Biomaterials. 34 (34), 8581-8588 (2013).
  23. Semler, E. J., Lancin, P. A., Dasgupta, A., Moghe, P. V. Engineering hepatocellular morphogenesis and function via ligand-presenting hydrogels with graded mechanical compliance. Biotechnology Bioengineering. 89 (3), 296-307 (2005).
  24. Reinhart-King, C. A., Dembo, M., Hammer, D. A. Cell-cell mechanical communication through compliant substrates. Biophysical journal. 95 (12), 6044-6051 (2008).
  25. Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior. Nature protocols. 7 (11), 2056-2066 (2012).
  26. Quinlan, A. M., Billiar, K. L. Investigating the role of substrate stiffness in the persistence of valvular interstitial cell activation. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 100 (9), 2474-2482 (2012).
  27. Zustiak, S. P., Leach, J. B. Hydrolytically degradable poly(ethylene glycol) hydrogel scaffolds with tunable degradation and mechanical properties. Biomacromolecules. 11 (5), 1348-1357 (2010).
  28. Chrambach, A., Rodbard, D. Polyacrylamide gel electrophoresis. Science. 172 (3982), 440-451 (1971).
  29. Lin, Y. C., et al. Mechanosensing of substrate thickness. Physical review. E, Statistical, nonlinear, and soft matter physics. 82 (4), 041918(2010).
  30. Chrambach, A. The Practice of Quantitative Gel Electrophoresis. , (1985).
  31. Sagvolden, G., Giaever, I., Pettersen, E. O., Feder, J. Cell adhesion force microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (2), 471-476 (1999).
  32. Javaherian, S., Li, K. J., McGuigan, A. P. A simple and rapid method for generating patterned co-cultures with stable interfaces. BioTechniques. 55 (1), 21-26 (2013).
  33. Tarone, G., Galetto, G., Prat, M., Comoglio, P. M. Cell surface molecules and fibronectin-mediated cell adhesion: effect of proteolytic digestion of membrane proteins. The Journal of cell biology. 94 (1), 179-186 (1982).
  34. Trujillo, V., Kim, J., Hayward, R. C. Creasing instability of surface-attached hydrogels. Soft Matter. 4 (3), 564-569 (2008).
  35. Saha, K., et al. Surface creasing instability of soft polyacrylamide cell culture substrates. Biophysical journal. 99 (12), L94-L96 (2010).
  36. Buxboim, A., Rajagopal, K., Andre’EX, B., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. Journal of Physics: Condensed Matter. 22 (19), 194116(2010).
  37. Merkel, R., Kirchgessner, N., Cesa, C. M., Hoffmann, B. Cell force microscopy on elastic layers of finite thickness. Biophysical journal. 93 (9), 3314-3323 (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Polyacrylamide Gel PreparationMultiwell Plate FormatStiffness dependent Cell ResponsesHydrogel Substrate PreparationFlexible Plastic SupportGel Polymerization ProcessCollagen Coating ApplicationCell Morphology AnalysisYoung s Modulus MeasurementMicroscopy Imaging Techniques

Related Articles