מאמר שיטה

צינור מהיר ואמין למחקר בקטריאלי transcriptome ניתוח מקרה: ויסות גני Serine תלויה ב Streptococcus pneumoniae

DOI:

10.3791/52649

⸱

25 באפריל 2015

 ,  , 
1Department of Molecular Genetics, Groningen Biomolecular Sciences and Biotechnology Institute, University of Groningen, 2Department of Bioinformatics and Biotechnology, Government College University Faisalabad

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כתב יד זה מתאר את השימוש בטכנולוגיה חדישה המסופקת על ידי מיקרו-מערכי DNA. מיקרו-מערכים מספקים סקירה כללית של השינויים הטרנסקריפטומיים בחיידקים שנגרמו בתנאי מסוים. יתר על כן, אנו מדגישים את הקלות שבה ניתן לנתח כמויות גדולות של נתונים באמצעות חבילות תוכנה נוחות שפותחו בבית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ביטוי גנים והרגולציה שלה הם מאוד חשובים להבין את התנהגותם של תאים בתנאים שונים. טכניקות שונות משמשות כיום ללמוד ביטוי גנים, אך רובם מוגבלים במונחים של מתן תמונה כוללת של הביטוי לכל transcriptome. מערכי DNA מציעים טכנולוגית מחקר מהירה וכלכלית, אשר נותנת סקירה מלאה של ביטוי גנים הגלובלי ויש להם מספר עצום של יישומים, כולל זיהוי של גנים חדשים וגורם שעתוק מחייבים אתרים, אפיון של פעילות תעתיק של התאים וגם לעזור בניתוח אלפים של גנים (בניסוי יחיד). במחקר הנוכחי, את התנאים לניתוח transcriptome חיידקים מקציר תא לניתוח מערך DNA כבר מותאמים. אם ניקח בחשבון את הזמן, עלויות ודיוק של הניסויים, פלטפורמה טכנולוגית זו מוכיחה להיות שימושי מאוד ואוניברסלי applicabale ללימוד transcripto חיידקיםmes. כאן, אנו מבצעים ניתוח מערך DNA עם pneumoniae Streptococcus כמקרה מבחן-ידי השוואת תגובות תעתיק של ס ' pneumoniae גדל בנוכחות ריכוזים שונים L-סרין במדיום. RNA סה"כ היה מבודד באמצעות שיטת Macaloid באמצעות ערכת בידוד RNA והאיכות של RNA נבדק על ידי שימוש בערכת בדיקת איכות RNA. cDNA הוכן באמצעות transcriptase ההפוך ודגימות cDNA תויגו באמצעות אחת משני צבעי ניאון אמין-reactive. שקופיות מערך DNA תוצרת בית שמשו לכלאה של דגימות cDNA המסומנים ונתונים microarray נותחו באמצעות מסגרת עיבוד מראש נתונים microarray cDNA (Microprep). לבסוף, Cyber-T שימש כדי לנתח את הנתונים שנוצרו באמצעות Microprep לזיהוי גנים הביעו באופן דיפרנציאלי משמעותיים מבחינה סטטיסטית. חבילות תוכנה כמו כן, נבנו בבית (פלפל, FIVA, לחשוף, התובע, Genome2D) שמשו כדי לנתחנתונים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר של המערך השלם של mRNA שפע (transcriptome) מקודד על ידי הגנום של האורגניזם חד-תאי או תא האיקריוטים בזמן מסוים או במצב מסוים, ובכלל זה ביטוי יתר של גן או נוק-אאוט, נקרא transcriptomics. Transcriptomics מאפשר לנו להתבונן למה גני המידה באים לידי ביטוי במצב מסוים בנקודת זמן X ונותן לנו מידע על כמה חזק גנים באים לידי ביטוי ביחס להתייחסות.

Microarray הוא מערך דו-ממדי על מצע מוצק (בדרך כלל שקופיות זכוכית או תא סרט דק סיליקון) שיכול לשמש לassay כמויות גדולות של חומר ביולוגי באמצעות הקרנת תפוקה גבוהה, וממוזער, עיבוד מרובב ומקביל וזיהוי שיטות. Microarrays בא בסוגים שונים, כולל DNA-microarrays, microarrays חלבון, microarrays פפטיד, microarrays רקמות, microarrays נוגדן, microarrays הסלולרי ואחרים. מערך DNA הואבעצם הרכבה של כתמים מיקרוסקופיים DNA קבוע למשטח מוצק, בדרך כלל זכוכית. מערכי DNA משמשים למדידת רמות הביטוי של גן או קבוצת גנים בו זמנית או לגנוטיפ אזורים מרובים של הגנום 2,3. Picomoles (10 -12 שומות) של חללית נמצא בתוך כל מקום DNA שמייצג רצף DNA ספציפי, הידוע גם בכתב. מולקולות mRNA שכותרתו מהדגימות נקראות 'יעדים'. Fluorophores משמשות למדידת הכלאת בדיקה-יעד וזיהוי של מטרות שכותרתו fluorophore קובע את השפע היחסי של רצפי חומצות גרעין ביעד. ניסוי microarray יכול להשיג בדיקות גנטיות מרובות במקביל כי מערך עשוי להכיל עשרות אלפי בדיקות. הפריסה של ניסוי microarray פשוט מוצגת באיור 1. לאחרונה, הוקם במעבדות האחרות שלנו ושהמערכים אלה הם לשימוש חוזר, מה שהופך את עלות effectiv די בטכניקה זודואר.

טכניקות בידוד RNA וטיהור שונות פותחו לאורך השנים כולל C-TAB, SDS ושיטות GT 4-8. יתר על כן, כמה ערכות מסחריות זמינות גם. לביטוי גני RNA באיכות גבוהה הוא חשוב מאוד. לכן, שיטות בידוד RNA הן שונה כדי לקבל כמות המרבית של RNA. באופן דומה, הצעדים להכנת cDNA וסימון של cDNA הם מזעריים. נורמליזציה של נתונים לאחר הסריקה מבוצעת גם ביעילות על ידי שימוש בחבילות תוכנה ב- בית שנבנה וכלים 9.

pneumoniae Streptococcus הוא הפתוגן אנושי גרם-חיובי שcolonizes לוע האף והוא הגורם לזיהומים רבים כגון דלקת ריאות, אלח דם, דלקת אוזן תיכונה ודלקת קרום המוח 10. החיידק יכול לנצל את מגוון רחב של החומרים המזינים הדרושים לצמיחה והישרדות 11,12. מספר המחקרים בוצעו עלחילוף חומרים דלקת ריאות חנקן ורגולציה המדגישים את החשיבות של חומצות אמינו ותפקידם בארסיות 13,14. במחקר זה, תגובת transcriptomic של ס ' pneumoniae לשינוי ריכוזים של L-סרין, חומצת אמינו בשפע קיים בפלזמת הדם האנושית, הוא דיווח באמצעות מערכי DNA. תגובת transcriptomic של ס ' pneumoniae גדל בריכוז מינימאלי של L-סרין (150 מיקרומטר) הושווה שלגדל בריכוז מרבי (10 מ"מ) של סרין. בינוני הגדרה כימית (CDM או בינוני מינימאלי) 15 שימש למחקר זה כדי לשלוט בריכוז של סרין. המוקד של מחקר זה הוא להפוך ידידותי למשתמש בטכניקה זו ולספק כלים שונים לנורמליזציה נתונים וניתוח. לכן, מספר הכלים שפותחו לצורך הניתוח ופרשנות הנתונים. FIVA (מידע Viewer פונקציונלי וAnalyzer) מספק פלטפורמה לעיבוד המידע הכלול באשכולות של גנים שישדפוסים דומים ביטוי גנים ולבניית פרופילים תפקודיים 16. התובע הוא חבילת תוכנה אחרת המאפשרת זיהוי של פונקציות והסברים של גנים 17 משוערים. על ידי עשיית שימוש של שיטות קיבוץ באשכולות, לחשוף מספק אלגוריתם זיהוי אתר הקישור DNA. המוטיבים רגולטורית הסיס של גנים יכולים להיות מוקרנים באמצעות אלגוריתם זה 18. Genome2D מציע פלטפורמה מבוססת Windows להדמיה וניתוח של נתונים transcriptome על ידי הצעת טווחי צבע שונים כדי לאפיין את השינויים ברמות ביטוי גנים על מפת הגנום 19. שרת האינטרנט של הפלפל מציע, בנוסף לשיטת ניתוח all-in-one, ארגז כלים לכרייה לregulons, יזמים וגורם שעתוק מחייב אתרים 20. ביאור מלא של אזורים חוץ-בגנום של חיידקים יכול להיות מושגת על ידי שימוש בחבילה זו. ביולוגים יכולים להפיק תועלת רבה מפלפל כפי שהוא מציע להם במה לעיצוב ניסויs כך שהמידע המשוער ניתן לאשר במבחנה 20. חבילות תוכנה אלה תורמים באופן משמעותי לניתוח microarray כמו רובם זמינים באופן חופשי ולעשות נורמליזציה נתונים וניתוח אמינה מאוד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת מדיה, ותרבית תאים

  1. לגדול S. זן pneumoniae D39 wild-type 21 כפי שתואר לעיל 11. לחסן תאים מאוחסנים ב -80 o C בגליצרול 10% (עם יחס 1/100 בצינורות 50 מיליליטר סטרילי) ב 50 מיליליטר כימי מוגדר בינוני (CDM) עם pH סופי של 6.4 15, אבל להשמיט L-סרין מחומצת אמינו תערובת.
    הערה: שני CDMS שונה שימש; אחד המכיל ריכוז מינימאלי של L-סרין (150 מיקרומטר) ואחר המכיל ריכוז מרבי של L-סרין (10 מ"מ). ריכוז מינימאלי זה בעצם הריכוז של L-סרין בפלזמת דם אדם והמטרה היא להשוות את ביטוי הגנים של ס ' זן D39 pneumoniae תחת שני תנאים אלה.

2. בידוד של RNA סה"כ

  1. חומרים
    1. השתמש בפנול חומצה, כיתה RNA לבידוד של רנ"א הכל.
    2. Macaloid:
      1. להשעות 2 גרםmacaloid ב100 מיליליטר TE ולהרתיח במשך 5 דקות. מגניב RT וsonicate עד gels.Centrifuge macaloid הפתרון ב2,000 × גרם במשך 5 דקות בRT, resuspend ב 50 מיליליטר TE pH 8 ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.
    3. פתרונות:
      1. פנק את כל הפתרונות עם pyrocarbonate diethyl (DEPC). הוספת 100 DEPC μl / 100 מיליליטר פתרון, דגירה O / N ב 37 מעלות צלזיוס וחיטוי במשך 15 דקות.
  2. מתודולוגיה
    1. לגדול 50 מיליליטר של ס ' תרבות pneumoniae D39 תא בצינורות 50 מיליליטר ב 37 o C (לא רועד) עד שלב אמצע מעריכי (OD ~ 0.3). תרבויות צנטריפוגות ב 4 ° C על 10,000 × גרם במשך 2 דקות. בטל תקשורת ולהקפיא באופן מיידי את כדורי התא בחנקן נוזלי.
    2. כלורופורם Premix 300 μl: רשות העתיקות (24: 1) ו- 300 פנול μl (פנול חומצה, הכיתה RNA). השתמש 500 μl של השלב האורגני בשלב 2.2.3.
    3. מכין את התערובת הבאה מראש בצינורות הברגה כובע ללא RNA: 0.5 חרוזי זכוכית גרם, 50 μl 10% SDS, 500 פנול μl / כלורופורם: רשות העתיקות (כפי שהוכן בשלב 2.2.2), שכבת macaloid (150-175 μl, לא מדויק כפי שהוא צמיג מאוד). Resuspend את כדורי תא ב400 μl TE (DEPC) ולהוסיף תאי resuspended לתוך צינורות הברגה הכובע.
    4. כדי לשבור את התאים, למקם את צינורות בורג יתר במקצף חרוז פולסים 2x 60 "('Homogenize') עם מרווח 1 דקות על קרח. צנטריפוגה הדגימות עבור 10 דקות ב g 10,000 × (4 מעלות צלזיוס).
    5. מעביר את השלב העליון לצינור טרי, להוסיף 500 כלורופורם μl: רשות העתיקות (24: 1) וצנטריפוגות במשך 5 דקות בg 10,000 × (4 ° C).
    6. העבר את 500 μl של השלב העליון לצינורות טריים, להוסיף 2 כרכים (1 מיליליטר) של תמוגה / מאגר מחייב ומערבבים על ידי pipetting מעלה ומטה. לבודד RNA הכולל שימוש בערכת בידוד RNA ובצע את יצרן פרוטוקול מומלץ.

ניקוי 3. RNA

< ol>
  • כדי להסיר את הזיהום של DNA מרנ"א הכל, להוסיף 100 μl תערובת DNAseI (חיץ DNAse 90 μl ו10μl DNAseI) ודגירה של 20-30 דקות ב 15-25 מעלות צלזיוס.
  • לשטוף ניקה RNA באמצעות ערכת RNAse. להשיג 50 μl של נפח eluted.

    • 4. ניתוח של RNA

    1. קבע את הריכוז של RNA בספקטרופוטומטר. לקבוע את האיכות של RNA באמצעות assay כדלקמן (איור 2).
      1. לדלל 1 μl של מדגם עם 50 μl מים DEPC כדי לקבל ריכוז של 20-200 ng / μl.
      2. השתמש במדגם RNA המדולל μl 1 כדי לבדוק את האיכות על Bioanalyser לפי הוראות היצרן.
    2. הערה: יחס של 23S: 16S של כ 2.0 נחשב טוב RNA יחידת A260 1 מתאים עד 40 מיקרוגרם / מיליליטר.. כמות מומלצת לתיוג היא 10-20 מיקרוגרם.

    5. cDNA הכנה ותוויות

    ntent "> הערה: הפרוטוקול הבא אחרי להכנת cDNA ותיוג.

    1. רִכּוּך
      1. בצע תגובת חישול ב300 צינורות PCR μl, שמירה על הריכוז בסך הכל RNA 10-15 מיקרוגרם לשקופיות תוצרת בית או 5 מיקרוגרם לשקופיות מתוצרת חברה. מערבבים RNA עם 2 nonamers μl אקראי (1.6 מיקרוגרם / μl) ולהוסיף מים nuclease חינם במידת צורך כדי לשמור על הנפח הסופי של תערובת חישול עד 18 μl.
      2. שמור את תערובת חישול ב 70 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. אחרי זה, להתקרר לתערובת RT במשך 10 דקות (חישול) ובמידת הצורך, לסובב את התגובות לחלק התחתון של הצינור. מניחים את צינורות תגובה על קרח דק 'לפחות 1.
    2. שעתוק לאחור
      1. מכין את תערובת transcriptase ההפוכה כדלקמן: לתערובת חישול 18 μl, להוסיף 12 תמהיל μl מאסטר (בהיקף של 6 μl חיץ 5x הראשון סטרנד, 3 μl 0.1 M DDT, 1.2 μl 25x AA-dUTP / תערובת נוקלאוטיד ו -1.8 μl להפוך transcriptase (μl 1 לשקופיות מתוצרת חברה). שמור את תערובת התגובה ל2-16 שעות על 42 מעלות צלזיוס.

    6. השפלה של mRNA וטיהור של cDNA

    1. להשפיל mRNA מתערובת התגובה, להוסיף 3 μl של 2.5 M NaOH ומקום על 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות על. בהמשך לכך, להוסיף 15 μl של 2M HEPES חומצה חופשית כדי לנטרל את NaOH.
    2. לטהר את תערובת cDNA באמצעות עמודות לנקות PCR ועיקבו אחרי הפרוטוקול של היצרן.

    7. מדידת ריכוז cDNA

    1. למדוד ריכוזי cDNA בספקטרופוטומטר. כדי להמשיך בתיוג, לבדוק שהריכוז של cDNA הוא לפחות 60 ng / μl (שקופיות תוצרת בית) או 20 ng / μl (שקופיות מתוצרת חברה).

    8. תוויות של cDNA עם אמין-reactive דיי וטיהור

    1. השתמש בצבע אמין-reactive לתייג cDNA. ישירות לערבב cDNA עם aliquot אחד (5 μl) שלאמין-reactive צבע.
    2. דגירה את התערובת על RT, בחושך, 60 עד 90 דקות ולהמשיך ישירות לטיהור cDNA שכותרתו צבע. לטהר cDNA שכותרתו צבע על ידי שימוש בעמודות לנקות PCR והבא הפרוטוקול של היצרן. Elute cDNA ב -50 μl של חיץ elution.

    9. מדידה של Labelled cDNA

    1. השתמש ספקטרופוטומטר למדוד את השילוב של צבעים האמינים-reactive לcDNA. בדוק שהריכוז של צבעים האמינים-reactive הוא לפחות 0.5 pmol / μl בהיקף כולל של 50 μl.

    10. ערבוב של דוגמאות Labelled cDNA

    1. לשקופיות תוצרת בית, להשתמש בכל cDNA המסומן להכלאה עם הבדל לא יותר מ -30% בריכוז cDNA. לשקופיות מתוצרת חברה, להשתמש cDNA עם לא יותר מהבדל של פי 2 בריכוז cDNA.
      הערה: בדרך כלל, כ -300 ng של cDNA נחוץ לשקופיות מתוצרת חברה, שהוא קטן מאוד בהשוואה לrequired סכום של cDNA לשקופיות תוצרת בית.

    11. הכלאה וכביסה

    1. השתמש בחומרים כימיים הבאים: המים demi, אתנול 99%, הצפת SHY (תוצרת בית; עם השמרים RNA 40 μl). הכן 1 מיליליטר מרבי של SHY.
    2. הכנת מכשירים ופתרונות
      1. לעבור על ריכוז ואקום ושעה לפחות 1 מחמם לפני הייבוש. לעבור על תנור הכלאה, עם נקודת סט המותאמת לטמפרטורת הכלאה הנכונה (למערכי DNA S. pneumoniae, להשתמש 45 ° C). באופן דומה, מחממים קלטת הכלאה ותנור במשך 30-60 דקות.
      2. מחממים חיץ SHY 68 צלזיוס למשך לפחות 30 דקות.
    3. לדוגמא הכנה (שכותרתו cDNA)
      1. לשלב כמויות שווה של cDNAs שכותרתו (הבדל של 30% לכל היותר). ייבש את הדגימה באמצעות ריכוז האבק בטמפ 'הגבוה (כ. 40 דקות) עד הנפח קטן מ -7 μl.
    4. מרים החלקה
      1. השתמש מרים-התלושים נקיים.הערה: ± ניתן לטעון 30 μl בשקופית.
      2. נקה את המרים-התלושים עם סבון, שפע של מים ברז ו 100% אתנול. הערה: תלושי מרים Dirty לתת רקע גבוה.
      3. אוויר יבש מרים-התלושים עם אקדח אוויר ללפוצץ חלקיקי אבק. הנח מרים החלקה נקייה בשקופית עם בטנת הטפלון הלבנה בצדדים כלפי מטה.
    5. הוספת מאגר הכלאה (לcDNA המסומן)
      1. ממיסים את דגימות צבע המיובשים ב -7 μl H 2 O ולדגור על 94 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
      2. מייד, להוסיף 35 μl חיץ שחומם מראש SHY (68 ° C), מערבב בעדינות וספין במהירות המרבית דקות 1 להיפטר ממשקעים. מחממים את החללית על 68 צלזיוס למשך כ 5 דקות עד שטעינה.
    6. Slide-מרים החלקה הרכבה וחימום מוקדם.
      1. הנח את מחזיק שקופיות הכלאה על חום-בלוק בגיל 50 ג. הנח שקופיות מערך DNA עם מרים החלקה על מחזיק שקופיות הכלאה המחומם וpלחמם את השקופית עם מרים החלקה לרגע. בצע את השלבים הבאים מהר ככל האפשר.
      2. הוסף 40 μl של יעד המדגם לסוף השקופית. לאפשר לנוזל לזרום בין משטחי הזכוכית בכוח נימים. לבצע את כל pipetting לאט ובזהירות.
      3. שמור את השקופיות עם אופקי מרים החלקה בכל העת ולנוע באיטיות כדי לוודא שמרים החלקה לא זזה.
      4. קח את קלטת ההכלאה מראש חימם מהתנור ההכלאה ולסגור את המכונה. מסנן נייר מקום ספוג עם 3 מיליליטר 2x SSC (ציטראט מלוח הסטנדרטי) בקלטת ההכלאה.
      5. מניח בעדינות את מחזיק שקופיות הכלאה עם מגלשות בקלטת ההכלאה. סגור את קלטת ההכלאה ולשים בתנור ההכלאה שוב (כ 16-18 שעות).
    7. שטיפת שקופיות
      1. הכן לשטוף מאגרים טריים I, II ו- III (750 מ"ל לכל שלב לשטוף). עבור 500 מיליליטר לשטוף חיץ אני, להשתמש 2 x SSC / 0.5% SDS. ל500 מ"ל לשטוף-חובבאה השני, להשתמש 1 x SSC / 0.25% SDS. עבור 500 מיליליטר לשטוף חיץ III, להשתמש 1 x SSC / 0.1% SDS (אופציונאלי)
      2. מניחים את השטיפה-המאגרים ליום 30 במעלות צלזיוס (כדי להיות בטוח SDS נמס).
      3. להטביע את השקופיות מהר ככל האפשר, אבל בעדינות רבה, בצינור בז מלא 50 מיליליטר לשטוף חיץ אני עד הזכוכית מונחת על תחתית חרוטי של הצינור.
      4. אחרי כמה שניות, כאשר כיורים מרים החלקה לחלק התחתון של הצינור, להוציא את השקופית עם פינצטה מבלי לשרוט את המערך ולשים במעמד של תחנת השטיפה. המשך עם הכביסה ללא פער זמן.
      5. שטוף את השקופיות עבור 5 דקות ב500 מ"ל לשטוף חיץ אני (בתחנת שטיפה). נותן לו לשטוף את השני במשך 20-30 דקות ב500 מ"ל לשטוף חיץ השני (בתחנת שטיפה). באופן דומה, לשטוף את השקופיות במשך 5 דקות ב500 מ"ל לשטוף חיץ III (אופציונאלי) (בתחנת שטיפה).
      6. ייבש את השקופיות 2 דקות ב2,000 סל"ד.

    12. Microarray ניתוח

    1. סריקת תמונותעם אורכי גל המתאימים בסורק ולשמור בתיקייה "יופיטר פרויקט".
    2. השתמש בתוכנה כדי לנתח את הקבצים הסרוקים בתחילה כפי שתואר לעיל 22. לאחר הפעלת תוכנה זו, בחר בכרטיסייה "פתחה תמונה" כדי לטעון את קובץ תמונה האדומה (-.550) כמו "אדום" וקובץ תמונה ירוק (-.635) כ "ירוק". להעלות את קובץ גל (.gal) יש רשימת מערך S. pneumoniae בקובץ תמונה על ידי בחירה "רשימת מערך טעינה" כרטיסייה 22.
      הערה: רשימה זו כללה מערך של 48 רשתות, בכל רשת היו 16 שורות ועמודות 15. כל נקודה על הרשת מייצגת גן יחיד ומידע נקודה כולל את שם גן מוסף באמצעות קובץ נקודת תיאור. מקבלים משמאל מספרי הנקודה לימין ומלמעלה למטה.
    3. אחרי שהבחין בזהירות את הרשתות, הכרטיסייה בחר "מצא את המערך, מצא בלוקים, יישר תכונות" כדי ליישר את הכתמים. לאחר יישור כל התכונות, לנתח את התמונה על ידי בחירת t "ניתוח"ab. צור קובץ חדש שיש תוצאות, היסטוגרמה ועלילת פיזור. שמור קובץ זה מכרטיסייה "תוצאות שמור בשם" כקובץ .gpr לניתוח נוסף.
    4. לבצע נורמליזציה ועיבוד של נתונים נוספים עם חבילת תוכנת Microprep פותחה ב-בית כמתואר 9.
    5. השתמש משכפל ביולוגי עצמאי לנתוני מערך DNA שהם החליפו-צבע. לבצע יישום CyberT של גרסה של t-test1 ולחשב שיעורי שווא גילוי (FDRs) כפי שתוארו 9.
    6. לגנים הביעו באופן דיפרנציאלי, לקחת p <0.001 וFDR <0.05 כסטנדרט.
    7. העלה נתונים מערך DNA בעמוד הגשת צמח השדה כדי לקבל מספר GEO (אומניבוס ביטוי גנים) הצטרפות.

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    תוצאות

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    RNA, בידודי cDNA וניתוח

    L-סרין הוא אחד מחומצות אמינו החיוניות וריכוזו בפלזמת דם אדם משתנה 60-150 מיקרומטר בילדים ומבוגרים. תפקידה בביוסינתזה של purines וpyrimidines מדגיש את חשיבותה בחילוף חומרים והוא מבשר על כמה חומצות אמינו (גליצין, ציסטאין וטריפטופן). כדי לחקור את ההשפעה של L-סרין על כל transcriptome של ס ' זן פראי סוג pneumoniae D39, ניתוח microarray של זן D39 גדל בCDM עם רי...

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    דיון

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    אנו מתארים פרוטוקול ידידותי למשתמש שניתן ליישם כדי לבצע ניתוח transcriptome שלם של חיידקים. נקודת המפתח על הטכניקה המסוימת הזה היא שהמצב לפיו התאים נקצרים ישתנה. לאחר קצירת תאי הבידוד ו- RNA, טכניקה זו הופכת להיות שווה לכל סוגי דגימות חיידקים ופועלת בהתאם לשלבים זהים לחלוטין ולכן, יכולה להיות מיושמת על כל סוג של תרבות חיידקים. הפרוטוקול הוא מאוד פשוט ונוח ומתחיל מבידוד RNA. פרוטוקול בידוד RNA שלנו (באמצעות Macaloid וערכת בידוד RNA) הוא זמן יעיל בהשוואה לפנול, כלורופורם קונבנציונלי...

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    גילויים

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

    תודות

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    אנו מודים אן דה יונג וSiger Holsappel לעזרה עם הפקת שקופיות מערכי DNA. תמיכתה של אנה דה יונג לניתוח ביואינפורמטיקה גם מוערכת. אנו מודים גם Jelle Slager לבחינת הנייר. מוחמד אפזאל ואירפאן Manzoor נתמך על ידי אוניברסיטת GC, Faisalabad, פקיסטן במסגרת תכנית פיתוח סגל של HEC פקיסטן.

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    חומרים

    רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
    שםחברהמספר קטלוגהערות
    פנול חומציSigmaAldrichP4682
    ערכת בידוד RNAרוש חרוזי
    105015
    IAA106630
    NanodropNanodropND-100
    Agilent BioAnalyserAgilentG2940CA
    Superscript IIILife technologies Invitrogen18080044
    AA-dUTPLife technologies InvitrogenAM8439
    DDTLife technologies Invitrogen
    First Strand BufferLife Technologies Invitrogen18080044
    NaOHSigmaAldrichS8045-1KG
    HEPESSigmaAldrichH4034-500G
    DyLight-550Thermoscientiffic62262
    DyLight-650Thermoscientiffic62265
    SHY BufferSigmaAldrichH7033-125ML
    מצנןSpeedvac EppendorfRUGNE3140רכז Speedvac בתוספת
    תנור היברידיזציהGrant BoekelIso-20
    Lifter-SlipsErie Scientific25x60I-M-5439
    נגב KIMTECH
    SDSSigmaAldrichL3771-100g
    SSCSigmaAldrichW302600-1KG-K
    Genpix autoloader 4200A1MSD טכנולוגיות אנליטיותסורק Microarray
    נתרן ביקרבונטSigmaAldrich104766
    של זכוכית 11828665001 מדע יישומיבום כלורופורם 92013505.1000.18080044

    מקורות

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Kayala, M. A., Baldi, P. Cyber-T web server: differential analysis of high-throughput data. Nucleic Acids Res. 40, W553-W559 (2012).
    2. Chang, T. W. Binding of cells to matrixes of distinct antibodies coated on solid surface. J. Immunol. Methods. 65, 217-223 (1983).
    3. Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science. 270, 467-470 (1995).
    4. Galau Levi, A., A, G., Wetzstein, H. Y. A rapid procedure for the isolation of RNA from high-phenolic-containing tissues of pecan. 27 (12), 1316-1318 (1992).
    5. Lopez-Gomez, R., Gomez-Lim, M. A. A method for extraction of intact RNA from fruits rich in polysaccharides using ripe mango mesocarp. (5), 440-442 (1992).
    6. Salzman, R. A., Fujita, T., Salzman, Z., Hasegawa, P. M., Bressan, R. A improved RNA isolation method for plant tissues containing high levels of phenolic compounds or carbohydrates. Plant Molecular Biology Report. 17, 11-17 (1999).
    7. Kiefer, E., Heller, W., Ernst, D. A simple and efficient protocol for isolation of functional RNA from plant tissues rich in secondary metabolites. Plant Mol. Biol. Report. 18, 33-39 (2000).
    8. Tattersall, E. A. R., Ergul, A., Alkayal, F., Deluc, L., Cushman, J. C., Cramer, G. R. Comparison of methods for isolating high-quality RNA from leaves of grapevine. Am. J. Enol. Vitic. 56, 400-406 (2005).
    9. Van Hijum, S. A. F. T., Garcia de la Nava, J., Trelles, O., Kok, J., Kuipers, O. P. MicroPreP: a cDNA microarray data pre-processing framework. Appl.Bioinformatics. 2, 241-244 (2003).
    10. Kadioglu, A., Weiser, J. N., Paton, J. C., Andrew, P. W. The role of Streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease. Nat.Rev.Microbiol. 6, 288-301 (2008).
    11. Afzal, M., Shafeeq, S., Kuipers, O. P. LacR is a repressor of lacABCD and LacT is an activator of lacTFEG, constituting the lac gene cluster in Streptococcus pneumoniae. Appl. Environ. Microbiol. 80, 5349-5358 (2014).
    12. Afzal, M., Shafeeq, S., Henriques-Normark, B., Kuipers, O. P. UlaR activates the expression of the ula operon in Streptococcus pneumoniae in the presence of ascorbic acid. Microbiol. Read. Engl. , (2014).
    13. Hendriksen, W. T., et al. Site-specific contributions of glutamine-dependent regulator GlnR and GlnR-regulated genes to virulence of Streptococcus pneumoniae. Infect. Immun. 76, 1230-1238 (2008).
    14. Kloosterman, T. G., Kuipers, O. P. Regulation of arginine acquisition and virulence gene expression in the human pathogen Streptococcus pneumoniae by transcription regulators ArgR1 and AhrC. J. Biol. Chem. 286, 44594-44605 (2011).
    15. Kloosterman, T. G., Bijlsma, J. J. E., Kok, J., Kuipers, O. P. To have neighbour's fare: extending the molecular toolbox for Streptococcus pneumoniae. Microbiol. Read. Engl. 152, 351-359 (2006).
    16. Blom, E. J., et al. FIVA: Functional Information Viewer and Analyzer extracting biological knowledge from transcriptome data of prokaryotes. Bioinforma. Oxf. Engl. 23, 1161-1163 (2007).
    17. Blom, E. J., et al. Prosecutor: parameter-free inference of gene function for prokaryotes using DNA microarray data, genomic context and multiple gene annotation sources. BMC Genomics. 9, 495(2008).
    18. Blom, E. J., et al. DISCLOSE : DISsection of CLusters Obtained by SEries of transcriptome data using functional annotations and putative transcription factor binding sites. BMC Bioinformatics. 9, 535(2008).
    19. Baerends, R. J. S., et al. Genome2D: a visualization tool for the rapid analysis of bacterial transcriptome data. Genome Biol. 5 (5), R37(2004).
    20. De Jong, A., Pietersma, H., Cordes, M., Kuipers, O. P., Kok, J. PePPER, a webserver for prediction of prokaryote promoter elements and regulons. BMC Genomics. 13, 229(2012).
    21. Lanie, J. A., et al. Genome sequence of Avery's virulent serotype 2 strain D39 of Streptococcus pneumoniae and comparison with that of unencapsulated laboratory strain R6. J. Bacteriol. 189, 38-51 (2007).
    22. Molecular Devices, Corp. GenePix Pro 6.0 Microarray Acquisition and Analysis Software for GenePix Microarray Scanners-Use's Guide and Tutorial. , Molecular Devices, Corp. (2005).

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    הדפסות חוזרות והרשאות

    בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

    בקש הרשאה

    תגיות

    DNA MicroarrayRNA IsolationcDNA LabelingMicroarray HybridizationMicroprep AnalysisCyber T AnalysisIn house Software Packages

    מאמרים קשורים