$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
הערה: זכר C57BL / 6 עכברים (5-7 שבועות) הם מצ'ארלס ריבר מעבדות International, Inc (St-קבוע, קוויבק, קנדה.) ומניפולציות על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת בעלי החיים Sainte-ג'סטין CHU Care. explants רקמת הסימפונות העכבר מספק מקור טוב לתאי האפיתל הסימפונות ראשיים לחקירת השפעות proapoptotic של LMPs על תאי האפיתל. פרוטוקול זה מתאר את הדור במבחנה של LMPs, כמו גם שיטה לגילוי תאי האפיתל אפופטוטיים בexplants רקמת הסימפונות טופל LMPs. פרוטוקול זה כולל 3 חלקים.
1. LMPs ייצור ואפיון
הערה: כדי למנוע זיהום, לוודא שכל החומרים המשמשים בניסוי זה הם סטרילי או autoclaved. לבצע את כל השלבים בRT בארון בטיחות ביולוגי בתנאי סטרילי, אלא אם צוין אחרת.
1.1) גירוי ואוסף של חברי פרלמנט9
- להפשיר aliquot של 10 מיליון תאי CEM T באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. לדלל ב 10 מיליליטר מראש חימם בינוני hematopoietic כגון X-VIVO, בשפופרת 15 מיליליטר סטרילי וצנטריפוגות ב 200 GX 5 דקות סרום ללא. לשאוב את תאי supernatant ו resuspend ב 5 מיליליטר בינוני מחומם מראש.
- העברת תאים לתוך בקבוק רקמות T75 תרבות (לתאי השעיה) עם 15 מיליליטר בינוני מחוממת מראש hematopoietic כגון X-VIVO ודגירה של 4 ימים בחממה humidified על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.
- לאחר 4 ימים, להעביר את כל מדיום התרבות ותאים לתוך בקבוק תרבית רקמת T175 המכיל 100 מיליליטר בינוני טרי. להמשיך דוגרים התאים לכ -72 שעות באותם תנאים עד שהם גדלו לצפיפות של 2 מיליון תאים / מיליליטר.
- באופן שווה לפצל תאים בין ארבע צלוחיות T175 כל מדיום המכיל 150 מיליליטר טרי ולהמשיך תרבית תאים עד תאים גדלו (כ 48 דגירה hr) לצפיפות של 2 מ'/ מיליליטר.
- 6 תאים לתוך בקבוק T175 חדש המכיל 150 מיליליטר בינוני טרי, כדי לשמור על 2 מ'/ צפיפות תאי מיליליטר.
- להוסיף actinomycin D (מומס DMSO ב2 מ"ג / מיליליטר) למדיום בריכוז סופי של 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר ו דגירה של 24 שעות.
- להעביר את כל התרבות הבינוני לתוך צינורות חרוטי 50 מיליליטר ולסובב את התאים ב 750 XG במשך 5 דקות. מעביר את supernatant לצינורות 50 מיליליטר ו צנטריפוגות חרוטי ב 1500 XG במשך 15 דקות כדי להסיר שברי תאים גדולים.
- מעביר את supernatant לתוך בקבוק 250 מיליליטר וultracentrifuge ב XG 12,000 למשך 50 דקות. בטל supernatant ולאסוף כדורים.
- לשטוף LMPs מועשר כדורים עם PBS 40 מיליליטר סטרילי בשפופרת 50 מיליליטר על ידי צנטריפוגה ב XG 12,000 למשך 50 דקות. חזור על פעולה זו פעמיים.
- לאסוף את supernatant לשטוף האחרון; הוא ישמש כשליטה ברכב. להשעות את כדורי LMPs ב 1מיליליטר של PBS ולהעביר לתוך microtube סטרילי 1.5 מיליליטר. LMPs המבודד Aliquot ולאחסן ב -80 ° C (כדי למנוע מחזורים חופשי הפשרה מרובות).
1.2) אפיון של חברי פרלמנט באמצעות ניתוח FACS 4
- הכן 2 דגימות של חיץ Annexin, 1 ובמשנו ללא CaCl 2: Hepes 10 מ"מ, 140 מ"מ NaCl, פלוס או מינוס 5 מ"מ CaCl 2.
- סנן חיץ Annexin ונוזל זרימת נדן FACS באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר כדי להסיר חלקיקים.
- לדלל 1 μl של LMPs ב -44 μl של חיץ Annexin עם 5 מ"מ CaCl 2 לתוך צינור FACS. הכן צינור אחר עם 1 μl של LMPs ב -44 μl של חיץ Annexin ללא CaCl 2 (שליטה שלילית).
- הוסף 5 μl של annexinV-Cy5 בצינור אחד ומערבבים היטב. דגירה במשך 15 דקות ב RT בחושך. לעצור את התגובה על ידי דילול התערובת עם 400 μl של נוזל זרימת נדן FACS בצינור אחד.
- הוסף 10 μl (200,000 חרוזים) של bea הספירה 7 מיקרומטרהשעיה ds כסטנדרט פנימי בצינור אחד כדי להשיג ספירה מוחלטת.
- הקמת שערים של גודל יחסי (FSC-H, PMT E00, להיכנס בקנה מידה) וגרעיניות היחסית (SSC-H, PMT 325, להיכנס בקנה מידה) עלילת נקודה על cytometer הזרימה באמצעות חרוזי ניאון-מכויל גודל של 1 מיקרומטר (שער 1) ו ספירת שער חרוזים בשעה 7 מיקרומטר (שער 2).
- לנתח את מדגם LMPs על עלילה / SSC-H FSC-H באמצעות השערים שהוקמו וFL-4 ערוצים לAnnexin (PMT 765, להיכנס בקנה מידה) עלילת נקודה, על ידי רכישת אות עד 20,000 חרוזים ספירה הם הגיעו בשער 2.
- לקבוע את אירועי annexinV החיוביים של LMPs במאגר Annexin מכיל CaCl 2, וכך להפחית את האירועים של LMPs במאגר Annexin ללא CaCl 2 (שליטה שלילית).
- לחשב את מספרם המוחלט של חברי פרלמנט המבוססים על המשוואה הבאה:
1.3) קביעת MP Pריכוז rotein (רדפורד Assay)
- הכן 5 דילולים סידוריים של תקן 1.25-20 מיקרוגרם / מיליליטר חלבון. פיפטה 800 μl של כל פתרון סטנדרטי ומדגם לתוך מבחנה נקייה בשני עותקים. הוסף 200 μl של מגיב ברדפורד צבע לכל צינור. מערבבים היטב, ולאחר מכן לדגור על RT במשך 5 דקות.
- למדוד הספיגה ב 595 ננומטר. קבע את ריכוז החלבון של LMPs באמצעות רגרסיה ליניארית של עקומה סטנדרטית.
2. Explants רקמות הסימפונות וLMPs טיפול
הערה: שים לב מיוחד לסביבת העבודה סטרילית, וסביבה נקיה מחיידקים להכין את הפתרונות ובינוניים המשמשים בניסויים הבאים. כדי להכין את Complete הריפוי בינוני, להוסיף 1 מיליליטר של רקמות תוספי בינוניים ריפוי עם סרום (מופשר על קרח) 100 מיליליטר רקמות ריפוי בינוני ומערבבים היטב.
2.1) הכנת Explants רקמות הסימפונות
- לפני culturing, לגרד 6 אזורים של 1 סנטימטר 2כל אחד בקצה של פני השטח של כל מנה תרבית רקמת 100 מ"מ עם להב סכין מנתחים. מעיל כל גרד 100 צלחת תרבית רקמת מ"מ עם 2 מיליליטר של פתרון ציפוי המנה התרבות, ודגירת הצלחת בO חממת humidified CO 2 / N על 37 מעלות צלזיוס. אבק לשאוב את הפתרון העודף ולמלא את הצלחת עם 15 מיליליטר של כביסה רקמות בינונית.
- להרדים C57BL / 6 עכברים (5-7 שבועות) משאיפת CO 2 על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת האתיקה טיפול בבעלי החיים.
- הסביבה נקיה מחיידקים לנתח רקמת ריאה עם אזמל, פינצטה סופר בסדר דומון, ומספריים כירורגיות. מוציא בזהירות כלי parenchyma ודם. הנח רקמת ריאה לכביסה בינוני רקמות קרות כקרח להובלה למעבדה, אם ישים.
- בהמשך לנתח הסמפונות שקועות בכביסת רקמות בינונית ולהפריד את הסמפונות בקוטר של 1 עד 2.5 מ"מ מרקמות ריאה היקפית. רקמות הסימפונות Slice לטבעות ~ 5 מ"מ עובי הסימפונות עם אזמל.
השתמש בתנועה גורף עם המלקחיים המעוקלים microdissecting סטרילי כדי להרים את שברי הסימפונות ולמקם אותם על האזורים השרוט של המנות. - הסר את כביסה רקמות בינונית, ודגירה שברים בRT ל~ 5 דקות, כדי לאפשר להם לדבוק במנות.
- הוסף 10 מיליליטר של שלם ריפוי בינוני לכל מנה ולמקם אותם בתא חממת מודולרי אווירה מבוקרת. רוקן את החדר עם תערובת גבוהה O 2 גז (70% O 2, 25% N 2, 5% CO 2,). מניחים את החדר בחממה מסלולית benchtop ולנער אותו על 37 מעלות צלזיוס. לנער את התא למשך 24 שעות ב 10 מחזורים לדקה על מנת לאפשר למדיום לזרום לסירוגין על שברים.
- אחרי 24 שעות דגירה, להתבונן explants הרקמה תחת מיקרוסקופ אור שלב בניגוד הפוכה. בחר explants הסימפונות עם, תנועה שלמה קנס שיער ואפיתל הסימפונות התוסס לטיפול LMPs שלאחר מכן.
2.2) LMPs טיפול
- הכן מדיום גידול מוחלט כדלקמן: תוספי מדיום גידול הפשרה עם מעכב סרום ופיברובלסטים על קרח. הוסף 1 מיליליטר של תוספי מדיום גידול עם סרום ו -200 מעכב פיברובלסטים μl לשל מדיום גידול של 100 מיליליטר; מערבב היטב. לחמם את מדיום גידול המוחלט על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפני השימוש.
- לדלל LMPs המבודד בצינור Eppendorf סטרילי חדש עם PBS להכין מניית LMPs בריכוז של 800 מיקרוגרם / מיליליטר.
- הוסף 0.5 מיליליטר של צמיחה בינונית מלאה היטב בכל צלחת תרבית רקמת 12 גם.
- העבר את explants הסימפונות נבחר עם המלקחיים microdissecting המעוקלים מהפרוטוקול הקודם (סעיף 2.1) היטב בכל הצלחת בתרבית הרקמה.
- תווית צלחת התרבות כראוי לזהות בארות טיפול LMPs ובארות שליטה. הוסף 25 מניות LMPs μl לכל טיפול LMPs היטב (לריכוז סופי של 40 מיקרוגרם / מיליליטר) ו -25 כלי רכב שליטת μl (ראה LMP של ייצור) לבארות שליטה.
- המשך הדגירה בתא חממת מודולרי אווירה מבוקרת על 37 מעלות צלזיוס עם רעד עדין.
- לאחר 24 שעות, לשטוף explants 3 פעמים עם PBS ולהמשיך ל( קיבעון 4 paraformaldehyde% [PFA]) השלב הבא.
3. Histopathological בחינה
3.1) הכן את הפתרונות הבאים לפני שתמשיכו לשלבים הבא
- הכן חיץ PBS 1x ידי ערבוב 137 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 10 מ"מ Na 2 4 HPO, 1.76 מ"מ KH 2 PO 4, pH 7.4.
- כדי להכין 4% PFA, לפזר 20 גרם של PFA ב400 מיליליטר של מים, מחומם על 60 ° C עם ערבוב; להוסיף כמה טיפות של 10 M NaOH כדי לנקות את הפתרון. הבא להוסיף למאגר PBS 1x ולהתאים את עוצמת הקול עד 500 מיליליטר ו- pH 7.4. מסנן וaliquot; לאחסן ב -20 ° C.
- הכן את חומרים כימיים התייבשות או התייבשות הבאה; 100%, 90%, 70%, 50% אתנול ו קסילן.
e_step "> 3.2) explant קיבוע ורקמות סעיף Deparaffinization
- מניחים כל explant בצינור microcentrifuge שכותרתו עם 1.5 מיליליטר של PFA 4% ו דגירה O / N ב 4 מעלות צלזיוס. יש לשטוף את explants פעמיים עם PBS 1x.
- ליבש explants באמצעות סדרת אלכוהול (אתנול 70%: 3 פעמים 30 דקות כל אחד, 90% אתנול: 2 פעמים 30 דקות כל אחד, 100% אתנול: 3 פעמים 30 דקות כל אחד, ואז קסילן: 3 פעמים 20 דקות כל אחד). לבצע את כל השלבים בRT במנדף.
- להשתיל explants הרקמה בפרפין על 58 מעלות צלזיוס בתנור. הכן 5 מיקרומטר סעיפי רקמות עבים באמצעות microtome סיבובי.
- לצוף החלקים באמבט המים C ° 56, ולאחר מכן להתקין את החלקים על גבי שקופיות היסטולוגית שכותרת. מניחים את השקופיות במדפי צביעה ידניות ויבש על 65 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. אפשר השקופיות כדי לקרר בRT.
- טובלים את המדפים ב 4 מנות כתם רצופות המכילות קסילן במשך 10 דקות כל אחד כדי להסיר פרפין. טובלים את המדפים בסדרת אתנול להסיר קסילן: 100%, אז 95%, הen 80%, אז 70%, אז 50% אתנול (5 דקות לכל שלב). יש לשטוף את המדפים במים ברז למשך 5 דקות כדי להסיר אתנול.
3.3) Hematoxylin ו Eosin (H & E) מכתים
- להמשיך לעבוד עם קטעי רקמה הקבועים; הנח את המדף לתוך צלחת מלאה בכתמים Hematoxylin מאיר במשך 15 דקות. יש לשטוף את המדף במים ברז כדי להסיר Hematoxylin עבור 20 דקות.
- מניחים במים מזוקקים למשך 30 sec.Place באתנול 95% למשך 30 שניות. מניחים בצלחת מכתים פתרון Eosin Y דקות 1. ליבש באמצעות 2 שינויים של 95% אתנול, 100% אתנול, וקסילן עבור 2 דקות כל אחד.
- לבצע בדיקה מהירה תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח שeosin העודף מוסר. מניחים 2-3 טיפות של מדיום הרכבה (פישר SP15-100) על כל שקופית, ואז לכסות עם מכסה זכוכית.
3.4) בתא Situ מוות איתור: Assay TUNEL
- לפני שיתחיל, להכין פתרון K proteinase עבודה: 20 מיקרוגרם / מ"ל ב10 מ"מ טריס / HCl, pH 7.4.
- חזור על שלבי 1 עד 5 מתוך סעיף 3.2 (קיבעון explant וdeparaffinization סעיף רקמות). יש לשטוף את השקופיות עם deionized H 2 O.
- לטבול את השקופיות עם 1x PBS במשך 10 דקות. מסננים את PBS העודף. דגירה סעיפי רקמות למשך 30 דקות ב RT עם פתרון עובד proteinase K. יש לשטוף את שקופיות פעמיים עם 1x PBS.
- בצע את assay TUNEL כפי שמתואר בחוברת הוראות ההפעלה של ערכה לגילוי מוות של תאים. הר באמצעות הרכבה בינונית, וcoverslip ידני עם coverslips זכוכית.
- ניתוח דגימות תחת מיקרוסקופ אור. השתמש בתמונת Pro 4.5 לנתח את התאים אפופטוטיים בצבע חום.