מאמר שיטה

הקלטה מחוררת תיקון מהדק של עכבר עצב סנסורי חוש הריח בneuroepithelium שלמים: ניתוח פונקציונלי של נוירונים הבעת קולטן odorant מזוהה

DOI:

10.3791/52652

⸱

13 ביולי 2015

 , 
1UMR Centre des Sciences du Goŭt et de l'Alimentation, CNRS, INRA, Université de Bourgogne

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתוח התכונות הפיזיולוגיות של נוירונים חושי ריח עדיין מתמודד עם מגבלות טכניות. כאן אנו מתעדים אותם באמצעות מהדק טלאי מחורר בהכנה שלמה של אפיתל הריח בעכברים ממוקדי גנים. טכניקה זו מאפשרת לאפיין את תכונות הממברנה ותגובות לליגנדים ספציפיים של נוירונים המבטאים קולטני ריח מוגדרים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתוח התגובות הפיזיולוגיות של תאי עצב תחושתיים חוש הריח (OSN) כאשר מגורה עם ligands הספציפי הוא קריטי כדי להבין את הבסיס של התנהגויות מונעים ריח והאפנון שלהם. מאפייני קידוד אלה תלויים במידה רבה באינטראקציה הראשונית בין מולקולות ריח וקולטני הריח (OR) באו לידי ביטוי בOSNs. ספקטרום זהות, הסגוליות ויגנד של ביטוי או קריטיים. ההסתברות למצוא יגנד של או הביטוי בOSN נבחר באופן אקראי בתוך האפיתל הוא נמוך מאוד. כדי להתמודד עם אתגר זה, פרוטוקול זה משתמש גנטי עכברים מתויגים המבטאים את ה- GFP חלבון פלואורסצנטי תחת השליטה של ​​האמרגן של חדרי ניתוח שהוגדר. OSNs ממוקם באפיתל הדוק ומסודר המצפים את חלל האף, עם תאי שכנים משפיעים ההתבגרות ותפקודם. כאן אנו מתארים שיטה לבודד אפיתל ריח שלם ולהקליט דרך הקלטות תיקון מהדק המאפיינים של דואר OSNsxpressing קולטנים odorant מוגדרים. הפרוטוקול מאפשר לאפיין תכונות קרום OSN, תוך שמירה על ההשפעה של רקמות שכנות. ניתוח של תוצאות תיקון מהדק מניב כימות מדויק של יגנד / או אינטראקציות, מסלולי העברה ופרמקולוגיה, תכונות הקידוד 'OSNs והאפנון שלהם ברמת הקרום.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נוירונים חושיים ריח (OSN) מייצגים את השלב הראשון של תפיסת חוש הריח. ממוקם באפיתל ההרחה המצפה את חלל האף במכרסמים, הם יהפכו את המידע הכימי של ניחוחי לפוטנציאל פעולה שנשלח דרך האקסון שלהם למוח. כדי להבין טוב יותר את מנגנוני קידוד חוש הריח, יש צורך לאפיין את תכונות התמרה וקרום של OSNs. עד לאחרונה, רוב הטכניקות המשמשות כדי לאפיין את המאפיינים של OSNs יונקים בוצעו על 1-4 OSNs ניתקו. תהליך הניתוק משתמש (כלומר, אנזימים) תהליכים שונים מכאניים וכימיים לשחרר OSNs מסביבתם. תהליכים אלה גורמים למספר נמוך של תאים זמינים להקלטות. מספר נמוך זה יכול להיות אפילו יותר קריטי במקרה של תאי ה- GFP שכותרתו. דיסוציאציה גם מסירה את אינטראקציות תא אל התא המקומיות בין OSNs ותאים אחרים של אפיתל הריח שעשוי לשפר survivאל ואפנון של הנכסים "OSNs. כדי לעקוף את הליך הניתוק, הכנה שלמה פותחה 5.

כל OSN מבטא קולטן אחד חוש הריח (OR) נבחר ממשפחת multigene גדולה 6. יש ~ 1,000 חדרי ניתוח הביטוי באפיתל ההרחה העיקרי בעכבר. בשל המספר הגדול של בעלי חיים או בסוג בר, הסיכויים להקליט OSNs להביע זהה או נמוכים מאוד. כדי להתגבר על מגבלות אלה, עכברי גן ממוקד זמינים שבו כל OSNs להביע מזוהה או מסומנים עם חלבון פלואורסצנטי 7-9. OSNs שכותרתו אלה שמשו לעשות אנליזה פונקציונלית בהכנות ניתק 7,10,11 עם החסרונות שהוזכרו קודם לכן. הכנת אפיתל ללא פגע 5 מעכברים שכותרתו גנטית ולכן עוקפת בעיות אלה. זה מאפשר הניטור של הפעילות של OSNs להביע חדרי ניתוח מוגדרים במדויק בסביבה הקרוב בviVO ככל האפשר. חוץ מזה, הקלטות תיקון מהדק של OSNs גם יאפשרו ניתוח מדויק של תכונות קרום, פרמקולוגיה מסלול התמרה, יגנד / או אינטראקציות. בקושי ניתן לנתח את כל הנושאים הללו באמצעות הקלטות תאית. השתמשנו בטכניקה זו כדי לעקוב אחר התגובות של OSNs מבטאות את הקולטנים odorant SR1 וMOR23 12,13. ההיתכנות של הטכניקה אושרה על ידי קבוצות אחרות בMOR23 להביע 14 OSNs כמו גם בחדרי ניתוח אחרים להביע נוירונים 15,16. הניטור של אוכלוסייה מוגדרת של OSNs יכול להוביל לניתוח של המאפיינים שלהם בהקשרים רבים ושונים כגון פיתוח 14, הזדקנות 17, odorant מושרה פלסטיות 18, ותפקידם של שינויים ברצף של קולטן odorant בריח קידוד 15. פרוטוקול זה ובכך מספק כלי רב עוצמה כדי לעקוב אחר התכונות הפונקציונליות של OSNs המוגדר ברמת הקרום.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה כדלקמן הנחיות טיפול בבעלי החיים של Université de Bourgogne ואושר על ידי ועדת האתיקה Université de Bourgogne.

1. בעלי חיים

  1. השתמש עכברים או-IRES-tauGFP מהונדסים גנטי זמינים במעבדה ג'קסון. עכברים אלו פותחו במעבדה של ד"ר פיטר 'Mombaerts כדי לנתח מיקוד ופיתוח האקסון של מערכת ההרחה 19. לדוגמא, קו MOR23-IRES-tauGFP, מספר מניות 006,643, נושא את השם הרשמי מתח B6; 129P2- Olfr16 tm2Mom / MomJ; באופן דומה, הקו-SR1 IRES-tauGFP, מספר מניות 6717 נושא את השם הרשמי B6; 129P2- Olfr124 tm1Mom / MomJ.
  2. לגבי הגיל של בעלי החיים: לתוצאה טובה יותר של הפרוטוקול, להשתמש בבעלי חיים בין 2 ל 4 שבועות של גיל. בקבוצת גיל זו, לנתיחה היא (עצמות רכות, אפיתל ריח מוצק יותר) קלים יותר והידיות הדנדריטים הן דוgger להשוות לבעלי חיים מבוגרים.

2. הכנת אלקטרודות ופתרונות

  1. לטפטפות המגרה: רכישת prepulled גירוי טפטפות. אחרת, להכין אותם באופן ידני.
    1. שימוש בלהבה, לכופף שש טפטפות זכוכית 1 מ"מ בכ 1 סנטימטר מהקצה. הכנס שש טפטפות אלה בתוספת 7 ה ישר בצינורות כיווץ בחום 1.5 סנטימטר לחזק על ידי לולאה.
    2. חום לכווץ את צינורות כדי לשמור על החביות המצורפות יחד. צרף צינורות לכווץ נוספים לגפיים האחרים של החביות. משוך פיפטה גירוי זה עם חולץ רב-חבית.
    3. להוסיף קצת דבק נוזלי לבן סביב חריר כדי לחזק את הטיפים הכפופים. בואו N / O היבש.
  2. הכן L 1 או 2 של הפתרון תאי רינגר הרגיל (מ"מ: 124 NaCl, KCl 3, 4 MgSO 1.3, CaCl 2 2, 3 NaHCO 26, Nah 2 PO 4 1.25, 15 גלוקוז; mOsm pH 7.6 ו 305). שמור על 4 מעלות צלזיוסעד לשימוש.
  3. הכן פתרון מניות תאיים (מ"מ): 70 KCl, KOH 53, חומצת methanesulfonic 30, EGTA 5, HEPES 10, סוכרוז 70; pH 7.2 (KOH) וmOsm 310. שמור על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. טוב למספר שבועות.
  4. הכן פתרון תאיים הקלטה עם nystatin הכנה מוקדמת (ברגע האחרון) לפני הניסוי.
    1. שוקל 3 מ"ג של nystatin, להוסיף 50 μl של DMSO; מערבולת 20 שניות לאחר מכן sonicate 2-3 דקות עד מדוללים לחלוטין.
    2. הוסף 20 μl של פתרון DMSO-nystatin ב 5 מיליליטר של פתרון מניות תאיים. מערבולת 20 שניות, ואז sonicate 3 דקות. שמור פתרון זה על 4 מעלות צלזיוס ולהגן מפני אור ישיר, nystatin הוא רגיש לאור. פתרון זה יכול לשמש לכמה שעות. להחליף כל יום.
    3. לאחר הכנת אפיתל ההרחה היא מתחת למיקרוסקופ, לקחת חלק בפתרון זה במזרק 1 מיליליטר עם קצה צהוב-מוארך להבה למלא את האלקטרודות; להגן מפני אור ישיר. ברגע שב RT, פתרון nystatinאינו יציב; להחליף את הפתרון במזרק 1 מ"ל כל שעה או לשמור אותו בקרח.
  5. משוך אלקטרודות הקלטה עם חולץ להשיג צוואר ארוך וטיפ קטן (~ 2 מיקרומטר) עם התנגדות של 15-20 MΩ עם פתרון nystatin הפנימי.
  6. הכן פתרון odorant על 0.5 M בDMSO מתחת למכסה המנוע קטר; aliquot ולשמור ב -20 ° C עד שימוש. לדלל odorant בפתרון של רינגר עד הריכוז הרצוי. מלא את פיפטה הגירוי.

3. הכנת אפיתל הרחה

הערה: עכברים או-IRES-tauGFP להביע tauGFP תחת שליטתו של היזם או. בעכברים אלו, כל הנוירונים המבטאים את או עניין מסומנים עם GFP. פרוטוקול זה מותאם עבור חדרי הניתוח באו לידי ביטוי בכל האזורים. עם זאת, ניתוחים והקלטות קלים יותר לחדרי ניתוח הביע באזור הגב.

  1. להרדים את החיה על ידי הזרקת תערובת של קטמין ו xylazine (150 מ"ג / קילוגרם ו -10 מ"ג / קילוגרם דירקטוריוןמשקל y, בהתאמה). עריפת ראש יכול להתבצע במספריים חדים לעכברים צעירים או עם הגיליוטינה מכרסמים מתוחזקים היטב לעכברים מבוגרים.
    1. מספריים לנתח טבעת באמצעות לעשות חתך המדיאלי אורך דרך עור הגב. הסר את העור על ידי משיכתו לגזרים. בעזרת המספריים, לחתוך את הלסתות התחתונות במפרק הלסת. הסר את השיניים הקדמיות העליונות במקביל חתך עטרה לשיניים.
    2. ביצוע חתך עטרה של הראש מאחורי העיניים ולשמור את החלק הקדמי בלבד של הראש. לטבול אותו בתמיסת רינגר קר כקרח לנתיחה בהיקף.
  2. לנתח תחת ההיקף: בצד הגחון, לעשות חתך אורכי לאורך הלסת העליונה / השיניים. חותך את עצמות גב לאורך זמן, הבאים בצד dorso-הרוחב של חלל האף. להסיר את רוב העצמות וחיך; להעביר את המחיצה ואפיתל קשור אליו ברינגר חומץ בRT.
  3. לנתיחה הסופית: ממש לפני שמתחילה את ההקלטהפגישה, לקלף את האפיתל מהמחיצה הבסיסית עם מלקחיים. לנתק את האפיתל עם מלקחיים ועם שני 4-5 חתכי מספריים מ"מ (מספריים microvannas שימוש) בחלק הקדמי של מחיצת האף שבו ההידבקות חזקה.
    1. מוציא בזהירות את איבר יעקובסון על ידי חיתוך אותו לאורך הגב שלה לחיבור האפיתל במחיצה. העבר את האפיתל לחדר הקלטה עם שכבת הריר פונה כלפי מעלה; לשמור את זה שטוח בתא עם נבל.
  4. התקן תא תחת מיקרוסקופ הזקוף מצויד באופטיקה הקרינה ומצלמה רגישה. דמיין את ההכנה על מסך המחשב בהגדלה גבוהה דרך 40X מטרת מים טבילה (צמצם מספרי 0.8) והגדלת 2X או 4X נוסף הושגה על ידי זכוכית מגדלת. Perfuse ברציפות עם צלצול מחומצן בRT (1-2 מיליליטר / דקה).

4. הקלטת מושב

  1. לחפש את תא ניאון: להלהיב את ההכנה ב480ננומטר לEGFP, אשר פולט אור בטווח 530-550 ננומטר; יעד ידית הדנדריטים אחד שהיא באופן מהימן גלוי בקרינה ותחת שדה בהיר.
  2. מלא אלקטרודה עם פתרון תאיים עם nystatin; להסיר בועות בעדינות על ידי הקשה על האלקטרודה.
  3. הכנס האלקטרודה על בעל אלקטרודה, להפעיל לחץ חיובי בפיפטה; התנגדות צריכה להיות 15-20 MΩ.
  4. להביא האלקטרודה קרובה לתא; פעם התנגדות מגיעה ~ 40 MΩ, לשחרר לחץ חיובי ולהפעיל לחץ שלילי קל להגיע gigaseal.
  5. ברגע שהוא הגיע חותם, להגדיר את פוטנציאל הממברנה בכ -75 mV;
  6. ברגע שהתא נפתח, להמשיך עם פרוטוקולי גירוי, טיפולים תרופתיים. כדי למדוד את התגובה לגירוי odorant אחת, שיא 200-500 אלפיות שני של פעילות ספונטנית, לעורר עבור 500 אלפית שני ולמדוד את התגובה של התא לתקופה של עד 10 שניות 13. לטיפולים תרופתיים, perfuse הסוכנים תרופתיים בהריכוז הרצוי 20.

ניתוח נתונים 5.

  1. לנתח זרמים שהושרו על ידי גירוי odorant אחריו כמו: משרעת המרביות, עלייה-הזמן (זמן דרוש כדי להגיע ל -90% ממשרעת המרבית, באלפיות שני), הסכום הנוכחי (שטח מתחת לעקומה בPAS), בפעם ב 50% (זמן בין תחילת והקיזוז של התגובה ב -50% את המשרעת המרבית, באלפיות השני).
    1. שימוש בזרמי התמרה השיא (משרעת מרבי הגיע) בריכוזים שונים, לצייר ולהתאים עקומת תגובת מינון באמצעות משוואת היל: אני = Imax / (1 ​​+ (K 1/2 / n C)), שבו אני מייצג את השיא נוכחי , IMAX התגובה המרבית בריכוזים להרוות, K1 / 2 הריכוז שבהגיעה מחצית מהתגובה המרבית, C ריכוז odorant וn מקדם היל.
  2. ניתוח הקלטות של פוטנציאל הממברנה במהדק נוכחי לשלילת הקוטביות המרבית, טוטהפוטנציאל l הושר (שטח מתחת לעקומה בmVsec); פעילות שיא ספונטנית spiking מעל 30 שניות עד 1 הקלטות דקות; שיא רגישות דרך קוצים שהושרו על ידי הזרקה של זרמים (5-10 הרשות הפלסטינית).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התוצאה של פרוטוקול זה תלויה באיכות של הנתיחה. צעדים לנתיחה זה חייבים להיות קצרים (פחות מ 10 עד 15 דקות) ומדויקים (כלומר, כדי למנוע נזקים של האפיתל). איור 1 מדגים כיצד הכנה אידיאלית נראית כמו ברמות הגדלה שונות. בהגדלה נמוכה בשדה בהיר תאים מסוגים השונים (כגון ידיות של OSNs, תמיכה תאים) הם (איור 1 א) להבחנה. ברמה הגבוהה ביותר בהגדלה, בדרך כלל 80x ל160X, בשדה בהיר, ידיות הדנדריטים של OSNs צריכה להיות הבחנה מתאי התומכים (איור 1)

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היכולת של פרוטוקול זה כדי לפקח בצורה נכונה את המאפיינים של OSNs הבריא תלויה במידה רבה באיכות של התכשיר. לכן, הצעדים לנתיחה הם קריטיים. הראשון הוא קריטי לשים לב לאיכות (pH, osmolarity), חמצון וטמפרטורה של המדיום לנתיחה (אבל לא קפוא קר כקרח). שנית, המניפולציה של האפיתל עם כלים לנתח חייבת להיות מוגבלת ככל האפשר, כדי למנוע נזקים. לבסוף, זה הוא קריטי להשגת הכנה שטוחה ככל האפשר על מנת לגשת לאוכלוסיית OSN הגדולה ככל האפשר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרס כלכלי מתחרה.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים רוצים להודות לפיטר מומברטס על התרומה הנדיבה של עכברי OR-GFP; אן לפרנק ומתקן החיות CSGA לטיפול מעולה בבעלי חיים. המימון ניתן על ידי CNRS באמצעות מענקי ATIP ו-ATIP Plus, על ידי Conseil Régional de Bourgogne (מענקי FABER ו-PARI), על ידי Université de Bourgogne (תוכנית BQR).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שולחן רטט עם כלוב פאראדייTMC63-500 SERIESנדרש: מבודד את מערכת ההקלטה מרעידות הנגרמות על ידי הסביבה (תנועות נסיין, רעידות של ציוד כגון מאווררים לקירור מחשבים וכו'); ניתן לרכוש גם עם כלוב פאראדיי, או מצויד בכלוב פאראדיי בהתאמה אישית; כלוב זה מומלץ כדי למנוע רעש חשמלי מאופטיקה
סביבתיתמיקרוסקופאולימפוסBX51WIמיקרוקופ זקוף המצויד באפיפלואורסצנטי; שלב קבוע או נע בהתאם ליעדי העדפת המשתמש
אולימפוסLUMPLFL40XWלפחות 2 מטרות נדרשות: 4X או 10X לגישה גסה לתא; ודוגמה למרחקים ארוכים טבילה פי 40 אולימפוס LUMPLFL40XW / IR /0,8 / WD: זכוכית מגדלת 3.3 מ"מ
אולימפוסU-TVCACנדרש בהחלט: ממוקם בנתיב האור בין האובייקט למצלמה; מאפשר להגדיל את התמונה על המסך על מנת להגיע במדויק לכפתור עם מצלמת אלקטרודות ההקלטה
אולימפוסDP72נדרשת מצלמה טובה כדי לראות את הנוירונים בפלואורסצנטיות כמו גם בשדה בהיר; תוכנת הבקרה פשוטה ומאפשרת לצלם ולבצע תמונת מצלמה חיה כדי לפקח על התקרבות האלקטרודה לתא. אין צורך במצלמה אולטרה-רגישה
מסננתאולימפוס/כרומהבהתאם לחלבון הפלואורסצנטי המשמש בעכברים; דוגמה ל-GFP: עירור: BP460-490: פליטה: מגבר HQ530/50m
HEKAEPC10 USBמנטר את הזרמים הזורמים דרך אלקטרודת ההקלטה וגם שולט בנשיפה על ידי שליחת אות TTL לשפריצר; הגדרת ה-EPC10 נשלטת על ידי
תוכנתמחשבHEKAPatchmasterשולט במגבר במהלך המיקרומניפולטור
SutterMP225מיקרומניפולטור מדויק, מאפשר תנועות מדויקות עד 1/10 המיקרומטר; דגם זה יציב מאוד; הימנע ממניפולטורים הידראוליים שעלולים להיסחף
לחולץ האלקטרודותSutterP97עם חוט שוקת רחב FT345-B;   להכנת פיפטות הקלטה של כ-2µ קוטר מ 'עם קצה ארוך כדי להגיע לתאים; ההתנגדות צריכה להיות 15 עד 20Mohm עם זכוכית תמיסת מהדק תיקון מחוררת
SutterBF120-69-10בתנאי ההקלטה שלנו, זכוכית זו אידיאלית להקלטת
תא הקלטהשל וורנר אינסטרומנטסRC-26Gיש צורך בתא כדי להגדיר את התכשיר מתחת למיקרוסקופ. כדי לשמור על התכשיר במרכז החדר, יש להשתמש ברשת/עוגן.
גירוי
WPITW100F-4מחוברת בקבוצות של 7, פיפטות אלה משמשות להכנת פיפטות מגרות שנמשכו מראש
חולץ רב-חביתMDIPMP-107-Zעל ידי אסוציאציה של משיכה וטוויסט, מושך זה מאפשר לנו להכין אלקטרודות נפיחות עם מזרק לחץ מדויק של 7 חביות
 חברת TooheyP/N T25-1-900 ערוץ יחיד     מזרק לחץ מדויק זה שולט בלחץ הנפלט במושך הרב-חבית; הוא נשלט באופן ידני או על ידי המגבר על ידי 5V 
מיקרומניפולטורNarishigeYOU-1מניפולטור גס מספיק כדי לקרב את האלקטרודה המתנפחת לאתר ההקלטה
צינורותטיגון N/Aכדי להביא את הלחץ מהנשיפה לתמיסות פיפטה מתנפחות
/זלוף/כימיקלים
משאבת ואקוםGardner Denver300 seriesמשאבת ממברנה רוטטת שקטה ויעילה יותר מסוגים אחרים של משאבות
מערכת זלוףN/AN / Aמערכת זלוף כבידה עם צינורות פוליאתילן כדי להכניס ולהוציא את התמיסה החיצונית מתא ההקלטה
NystatinSigma-AldrichN3503חובה לחלחל תמיסה פנימית עבור מהדק תיקון מחורר
DIMETHYL SULFOXIDESigma-AldrichD5879משמש להמסת ניסטטין לפתרון פנימי עבור תיקון מחורר 
נתרן כלוריסיגמא-אולדריץ'S9625תמיסה חוץ-תאית
אשלגן כלוריסיגמא-אולדריץ'P4504תמיסה תוך-תאית/חוץ-תאית
סידן כלוריד דיהידראטסיגמא-אולדריץ'C7902תמיסה חוץ-תאית
נתרן פוספט מונוהידראט מונוהידראט (NaH2PO4)סיגמא-אולדריץ'S9638תמיסה חוץ-תאית
מגנזיום גופרתי הפטהידראט (MgSO4 7H2O)Sigma-Aldrich63140תמיסה חוץ-תאית
גלוקוזSigma-AldrichG8270תמיסה חוץ-תאית
נתרן ביקרבונטSigma-AldrichS6297תמיסה
חוץ-תאיתEGTA (אתילן גליקול-ביס(2-אמינואתילאתר)-N,N,N&פריים;,N&פריים;-חומצה טטראצטית)תמיסה פנימיתשל סיגמא-אולדריץE3889
אשלגן הידרוקסידסיגמא-אולדריץ'P1767תמיסה פנימית
מתיל סולפוקסידסיגמא-אולדריץ'W387509תמיסה תוך-תאית
Hepes-NaSigma-AldrichH7006
סוכרוזסיגמא-אולדריץ'S0389פתרון תוך-תאי
את זכוכית TTLs '

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lowe, G., Gold, G. H. Nonlinear amplification by calcium-dependent chloride channels in olfactory receptor cells. Nature. 366 (6452), 283-286 (1993).
  2. Ponissery Saidu, S., Dibattista, M., Matthews, H. R. Odorant-induced responses recorded from olfactory receptor neurons using the suction pipette technique. J Vis Exp. (62), e3862(2012).
  3. Moss, R. L., et al. Electrophysiological and biochemical responses of mouse vomeronasal receptor cells to urine-derived compounds: possible mechanism of action. Chem Senses. 23 (4), 483-489 (1998).
  4. Kaur, A., Dey, S. Live cell calcium imaging of dissociated vomeronasal neurons. Methods Mol Biol. 1068, 189-200 (2013).
  5. Ma, M., Chen, W. R. Electrophysiological characterization of rat and mouse olfactory receptor neurons from an intact epithelial preparation. J Neurosci Methods. 92 (1-2), 31-40 (1999).
  6. Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
  7. Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C. Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system. J Neurosci. 22 (8), 3033-3043 (2002).
  8. Bozza, T., et al. Mapping of class I and class II odorant receptors to glomerular domains by two distinct types of olfactory sensory neurons in the mouse. Neuron. 61 (2), 220-233 (2009).
  9. Vassalli, A., Rothman, A., Feinstein, P., Zapotocky, M. Minigenes impart odorant receptor-specific axon guidance in the olfactory bulb. Neuron. 35 (4), 681-696 (2002).
  10. Feinstein, P., Bozza, T., Rodriguez, I., Vassalli, A. Axon guidance of mouse olfactory sensory neurons by odorant receptors and the beta2 adrenergic receptor. Cell. 117 (6), 833-846 (2004).
  11. Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat Rev Neurosci. 5 (4), 263-278 (2004).
  12. Grosmaitre, X., et al. SR1, a mouse odorant receptor with an unusually broad response profile. J Neurosci. 29 (46), 14545-14552 (2009).
  13. Grosmaitre, X., Vassalli, A., Mombaerts, P., Shepherd, G. M. Odorant responses of olfactory sensory neurons expressing the odorant receptor MOR23: a patch clamp analysis in gene-targeted mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (6), 1970-1975 (2006).
  14. Lam, R. S. Odorant responsiveness of embryonic mouse olfactory sensory neurons expressing the odorant receptors S1 or MOR23. Eur J Neurosci. 38 (2), 2210-2217 (2013).
  15. Zhang, J., Huang, G., Dewan, A., Feinstein, P. Uncoupling stimulus specificity and glomerular position in the mouse olfactory system. Mol Cell Neurosci. 51 (3-4), 79-88 (2012).
  16. Zhang, J., Pacifico, R., Cawley, D., Feinstein, P. Ultrasensitive detection of amines by a trace amine-associated receptor. J Neurosci. 33 (7), 3228-3239 (2013).
  17. Lee, A. C., Tian, H., Grosmaitre, X. Expression patterns of odorant receptors and response properties of olfactory sensory neurons in aged mice. Chem Senses. 34 (8), 695-703 (2009).
  18. Cadiou, H., et al. Postnatal odorant exposure induces peripheral olfactory plasticity at the cellular level. J Neurosci. 34 (14), 4857-4870 (2014).
  19. Mombaerts, P. Axonal wiring in the mouse olfactory system. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 713-737 (2006).
  20. Grosmaitre, X., Santarelli, L. C., Tan, J., Luo, M. Dual functions of mammalian olfactory sensory neurons as odor detectors and mechanical sensors. Nat Neurosci. 10 (3), 348-354 (2007).
  21. Duchamp-Viret, P., Chaput, M. A. Odor response properties of rat olfactory receptor neurons. Science. 284 (5423), 2171-2174 (1999).
  22. Heydel, J. M., et al. Odorant-binding proteins and xenobiotic metabolizing enzymes: implications in olfactory perireceptor events. Anat Rec (Hoboken). 296 (9), 1333-1345 (2013).
  23. Pelosi, P. Perireceptor events in olfaction). J Neurobiol. 30 (1), 3-19 (1996).
  24. Spehr, M., Wetzel, C. H., Hatt, H. 3-phosphoinositides modulate cyclic nucleotide signaling in olfactory receptor neurons. Neuron. 33, 731-739 (2002).
  25. Chen, S., Lane, A. P., Bock, R., Leinders-Zufall, T. Blocking adenylyl cyclase inhibits olfactory generator currents induced by 'IP(3)-odors. J Neurophysiol. 84 (1), 575-580 (2000).
  26. Savigner, A., et al. Modulation of spontaneous and odorant-evoked activity of rat olfactory sensory neurons by two anorectic peptides, insulin and leptin. J Neurophysiol. 101 (6), 2898-2906 (2009).
  27. Ukhanov, K., Brunert, D., Corey, E. A. Phosphoinositide 3-kinase-dependent antagonism in mammalian olfactory receptor neurons. J Neurosci. 31 (1), 273-280 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

GFPOR

מאמרים קשורים