ניתוח התכונות הפיזיולוגיות של נוירונים חושי ריח עדיין מתמודד עם מגבלות טכניות. כאן אנו מתעדים אותם באמצעות מהדק טלאי מחורר בהכנה שלמה של אפיתל הריח בעכברים ממוקדי גנים. טכניקה זו מאפשרת לאפיין את תכונות הממברנה ותגובות לליגנדים ספציפיים של נוירונים המבטאים קולטני ריח מוגדרים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הקלטה מחוררת תיקון מהדק של עכבר עצב סנסורי חוש הריח בneuroepithelium שלמים: ניתוח פונקציונלי של נוירונים הבעת קולטן odorant מזוהה
במאמר זה
סיכום
תקציר
ניתוח התגובות הפיזיולוגיות של תאי עצב תחושתיים חוש הריח (OSN) כאשר מגורה עם ligands הספציפי הוא קריטי כדי להבין את הבסיס של התנהגויות מונעים ריח והאפנון שלהם. מאפייני קידוד אלה תלויים במידה רבה באינטראקציה הראשונית בין מולקולות ריח וקולטני הריח (OR) באו לידי ביטוי בOSNs. ספקטרום זהות, הסגוליות ויגנד של ביטוי או קריטיים. ההסתברות למצוא יגנד של או הביטוי בOSN נבחר באופן אקראי בתוך האפיתל הוא נמוך מאוד. כדי להתמודד עם אתגר זה, פרוטוקול זה משתמש גנטי עכברים מתויגים המבטאים את ה- GFP חלבון פלואורסצנטי תחת השליטה של האמרגן של חדרי ניתוח שהוגדר. OSNs ממוקם באפיתל הדוק ומסודר המצפים את חלל האף, עם תאי שכנים משפיעים ההתבגרות ותפקודם. כאן אנו מתארים שיטה לבודד אפיתל ריח שלם ולהקליט דרך הקלטות תיקון מהדק המאפיינים של דואר OSNsxpressing קולטנים odorant מוגדרים. הפרוטוקול מאפשר לאפיין תכונות קרום OSN, תוך שמירה על ההשפעה של רקמות שכנות. ניתוח של תוצאות תיקון מהדק מניב כימות מדויק של יגנד / או אינטראקציות, מסלולי העברה ופרמקולוגיה, תכונות הקידוד 'OSNs והאפנון שלהם ברמת הקרום.
מבוא
נוירונים חושיים ריח (OSN) מייצגים את השלב הראשון של תפיסת חוש הריח. ממוקם באפיתל ההרחה המצפה את חלל האף במכרסמים, הם יהפכו את המידע הכימי של ניחוחי לפוטנציאל פעולה שנשלח דרך האקסון שלהם למוח. כדי להבין טוב יותר את מנגנוני קידוד חוש הריח, יש צורך לאפיין את תכונות התמרה וקרום של OSNs. עד לאחרונה, רוב הטכניקות המשמשות כדי לאפיין את המאפיינים של OSNs יונקים בוצעו על 1-4 OSNs ניתקו. תהליך הניתוק משתמש (כלומר, אנזימים) תהליכים שונים מכאניים וכימיים לשחרר OSNs מסביבתם. תהליכים אלה גורמים למספר נמוך של תאים זמינים להקלטות. מספר נמוך זה יכול להיות אפילו יותר קריטי במקרה של תאי ה- GFP שכותרתו. דיסוציאציה גם מסירה את א....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
פרוטוקול זה כדלקמן הנחיות טיפול בבעלי החיים של Université de Bourgogne ואושר על ידי ועדת האתיקה Université de Bourgogne.
1. בעלי חיים
- השתמש עכברים או-IRES-tauGFP מהונדסים גנטי זמינים במעבדה ג'קסון. עכברים אלו פותחו במעבדה של ד"ר פיטר 'Mombaerts כדי לנתח מיקוד ופיתוח האקסון של מערכת ההרחה 19. לדוגמא, קו MOR23-IRES-tauGFP, מספר מניות 006,643, נושא את השם הרשמי מתח B6; 129P2- Olfr16 tm2Mom / MomJ; באופן דומה, הקו-SR1 IRES-tauGFP, מספר ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
התוצאה של פרוטוקול זה תלויה באיכות של הנתיחה. צעדים לנתיחה זה חייבים להיות קצרים (פחות מ 10 עד 15 דקות) ומדויקים (כלומר, כדי למנוע נזקים של האפיתל). איור 1 מדגים כיצד הכנה אידיאלית נראית כמו ברמות הגדלה שונות. בהגדלה נמוכה בשדה בהיר תאים מסוגים השונים (כגון ידיות של OSNs, תמיכה תאים) הם (איור 1 א) להבחנה. ברמה הגבוהה ביותר בהגדלה, בדרך כלל 80x ל160X, בשדה בהיר, ידיות הדנדריטים של OSNs צריכה להיות הבחנה מתאי התומכים (איור 1)
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
היכולת של פרוטוקול זה כדי לפקח בצורה נכונה את המאפיינים של OSNs הבריא תלויה במידה רבה באיכות של התכשיר. לכן, הצעדים לנתיחה הם קריטיים. הראשון הוא קריטי לשים לב לאיכות (pH, osmolarity), חמצון וטמפרטורה של המדיום לנתיחה (אבל לא קפוא קר כקרח). שנית, המניפולציה של האפיתל עם כלים לנתח חייבת להיות מוגבלת ככל האפשר, כדי למנוע נזקים. לבסוף, זה הוא קריטי להשגת הכנה שטוחה ככל האפשר על מנת לגשת לאוכלוסיית OSN הגדולה ככל האפשר.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין להם אינטרס כלכלי מתחרה.
תודות
המחברים רוצים להודות לפיטר מומברטס על התרומה הנדיבה של עכברי OR-GFP; אן לפרנק ומתקן החיות CSGA לטיפול מעולה בבעלי חיים. המימון ניתן על ידי CNRS באמצעות מענקי ATIP ו-ATIP Plus, על ידי Conseil Régional de Bourgogne (מענקי FABER ו-PARI), על ידי Université de Bourgogne (תוכנית BQR).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שולחן רטט עם כלוב פאראדיי | TMC | 63-500 SERIES | נדרש: מבודד את מערכת ההקלטה מרעידות הנגרמות על ידי הסביבה (תנועות נסיין, רעידות של ציוד כגון מאווררים לקירור מחשבים וכו'); ניתן לרכוש גם עם כלוב פאראדיי, או מצויד בכלוב פאראדיי בהתאמה אישית; כלוב זה מומלץ כדי למנוע רעש חשמלי מאופטיקה |
| סביבתיתמיקרוסקופ | אולימפוס | BX51WI | מיקרוקופ זקוף המצויד באפיפלואורסצנטי; שלב קבוע או נע בהתאם ליעדי העדפת המשתמש |
| אולימפוס | LUMPLFL40XW | לפחות 2 מטרות נדרשות: 4X או 10X לגישה גסה לתא; ודוגמה למרחקים ארוכים טבילה פי 40 אולימפוס LUMPLFL40XW / IR /0,8 / WD: זכוכית מגדלת 3.3 מ"מ | |
| אולימפוס | U-TVCAC | נדרש בהחלט: ממוקם בנתיב האור בין האובייקט למצלמה; מאפשר להגדיל את התמונה על המסך על מנת להגיע במדויק לכפתור עם מצלמת אלקטרודות ההקלטה | |
| אולימפוס | DP72 | נדרשת מצלמה טובה כדי לראות את הנוירונים בפלואורסצנטיות כמו גם בשדה בהיר; תוכנת הבקרה פשוטה ומאפשרת לצלם ולבצע תמונת מצלמה חיה כדי לפקח על התקרבות האלקטרודה לתא. אין צורך במצלמה אולטרה-רגישה | |
| מסננת | אולימפוס/כרומה | בהתאם לחלבון הפלואורסצנטי המשמש בעכברים; דוגמה ל-GFP: עירור: BP460-490: פליטה: מגבר HQ530/50m | |
| HEKA | EPC10 USB | מנטר את הזרמים הזורמים דרך אלקטרודת ההקלטה וגם שולט בנשיפה על ידי שליחת אות TTL לשפריצר; הגדרת ה-EPC10 נשלטת על ידי | |
| תוכנת | מחשבHEKA | Patchmaster | שולט במגבר במהלך המיקרומניפולטור |
| Sutter | MP225 | מיקרומניפולטור מדויק, מאפשר תנועות מדויקות עד 1/10 המיקרומטר; דגם זה יציב מאוד; הימנע ממניפולטורים הידראוליים שעלולים להיסחף | |
| לחולץ האלקטרודות | Sutter | P97 | עם חוט שוקת רחב FT345-B; להכנת פיפטות הקלטה של כ-2µ קוטר מ 'עם קצה ארוך כדי להגיע לתאים; ההתנגדות צריכה להיות 15 עד 20Mohm עם זכוכית תמיסת מהדק תיקון מחוררת |
| Sutter | BF120-69-10 | בתנאי ההקלטה שלנו, זכוכית זו אידיאלית להקלטת | |
| תא הקלטה | של וורנר אינסטרומנטס | RC-26G | יש צורך בתא כדי להגדיר את התכשיר מתחת למיקרוסקופ. כדי לשמור על התכשיר במרכז החדר, יש להשתמש ברשת/עוגן. |
| גירוי | |||
| WPI | TW100F-4 | מחוברת בקבוצות של 7, פיפטות אלה משמשות להכנת פיפטות מגרות שנמשכו מראש | |
| חולץ רב-חבית | MDI | PMP-107-Z | על ידי אסוציאציה של משיכה וטוויסט, מושך זה מאפשר לנו להכין אלקטרודות נפיחות עם מזרק לחץ מדויק של 7 חביות |
| חברת Toohey | P/N T25-1-900 ערוץ יחיד | מזרק לחץ מדויק זה שולט בלחץ הנפלט במושך הרב-חבית; הוא נשלט באופן ידני או על ידי המגבר על ידי 5V | |
| מיקרומניפולטור | Narishige | YOU-1 | מניפולטור גס מספיק כדי לקרב את האלקטרודה המתנפחת לאתר ההקלטה |
| צינורות | טיגון N/A | כדי להביא את הלחץ מהנשיפה לתמיסות פיפטה מתנפחות | |
| /זלוף/כימיקלים | |||
| משאבת ואקום | Gardner Denver | 300 series | משאבת ממברנה רוטטת שקטה ויעילה יותר מסוגים אחרים של משאבות |
| מערכת זלוף | N/A | N / A | מערכת זלוף כבידה עם צינורות פוליאתילן כדי להכניס ולהוציא את התמיסה החיצונית מתא ההקלטה |
| Nystatin | Sigma-Aldrich | N3503 | חובה לחלחל תמיסה פנימית עבור מהדק תיקון מחורר |
| DIMETHYL SULFOXIDE | Sigma-Aldrich | D5879 | משמש להמסת ניסטטין לפתרון פנימי עבור תיקון מחורר |
| נתרן כלורי | סיגמא-אולדריץ' | S9625 | תמיסה חוץ-תאית |
| אשלגן כלורי | סיגמא-אולדריץ' | P4504 | תמיסה תוך-תאית/חוץ-תאית |
| סידן כלוריד דיהידראט | סיגמא-אולדריץ' | C7902 | תמיסה חוץ-תאית |
| נתרן פוספט מונוהידראט מונוהידראט (NaH2PO4) | סיגמא-אולדריץ' | S9638 | תמיסה חוץ-תאית |
| מגנזיום גופרתי הפטהידראט (MgSO4 7H2O) | Sigma-Aldrich | 63140 | תמיסה חוץ-תאית |
| גלוקוז | Sigma-Aldrich | G8270 | תמיסה חוץ-תאית |
| נתרן ביקרבונט | Sigma-Aldrich | S6297 | תמיסה |
| חוץ-תאיתEGTA (אתילן גליקול-ביס(2-אמינואתילאתר)-N,N,N&פריים;,N&פריים;-חומצה טטראצטית) | תמיסה פנימית | של סיגמא-אולדריץ | E3889 |
| אשלגן הידרוקסיד | סיגמא-אולדריץ' | P1767 | תמיסה פנימית |
| מתיל סולפוקסיד | סיגמא-אולדריץ' | W387509 | תמיסה תוך-תאית |
| Hepes-Na | Sigma-Aldrich | H7006 | |
| סוכרוז | סיגמא-אולדריץ' | S0389 | פתרון תוך-תאי |
מקורות
- Lowe, G., Gold, G. H. Nonlinear amplification by calcium-dependent chloride channels in olfactory receptor cells. Nature. 366 (6452), 283-286 (1993).
- Ponissery Saidu, S., Dibattista, M., Matthews, H. R. Odorant-induced responses recor....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
