מאמר שיטה

ניצול capsid על-התאגדות האסטרטגיה Antigen לפיתוח גישות Adenovirus סרוטיפ 5-וקטורי חיסון

DOI:

10.3791/52655

⸱

6 במאי 2015

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Alabama at Birmingham, 2Center for AIDS Research, University of Alabama at Birmingham

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצור וקטור הוכחה של עיקרון סוג אדנווירוס דו הערכי 5 (Ad5) Ad5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6 על ידי ניצול אסטרטגית Antigen capsid על-ההתאגדות. וקטור זה הודגם להפגין כושר איכותי, היכולת להימלט סרה Ad5 חיובית במבחנה, וantigenicity כמו גם חיסונית לאנטיגנים המשולבים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סרוטיפ אדנווירוס 5 (Ad5) השתנה באופן נרחב בשיטות מסורתיות transgene לפיתוח החיסון. Efficacies המופחת של וקטורי Ad5 שונה באופן מסורתי אלה בניסויים קליניים יכול להיות מתואם בעיקר עם חסינות Ad5 קיימים מראש (PEI) בקרב רוב האוכלוסייה. כדי לקדם את פיתוח חיסון-וקטורי Ad5 על ידי פתרון הדאגה של Ad5 PEI, אסטרטגית Antigen capsid על-ההתאגדות החדשנית כבר מועסק. על ידי הכשרון של אסטרטגיה זו, Ad5-וקטורים שנבנינו מעבורת hexon ראשונה פלסמיד HVR1-קוואס-HVR5-6 / pH5S ידי subcloning אזור hypervariable (HVR) 1 של hexon לפלסמיד הסעות נבנה בעבר HVR5-6 / pH5S, שהיה לו תג 6 שולב HVR5. בר זה HVR1 DNA המכיל HIV epitope ELDKWAS היה מסונתז. HVR1-קוואס-HVR5-6 / pH5S היה אז לינארית ושיתוף הפך עם pAd5 פלסמיד עמוד השדרה לינארית / ΔH5 (GL),לרקומבינציה ההומולוגית. פלסמיד recombined זה pAd5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6 היה transfected לתאים לייצר הווקטור הנגיפי Ad5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6. וקטור זו קיבל תוקף יש כושר איכותי שצוין על ידי כייל פיזי (סמנכ"ל / מיליליטר) נגיפי, כייל זיהומיות (IP / מיליליטר) וסמנכ"ל יחס / IP מתאים. שני epitope HIV והתג 6 שלו היו בקפסיד Ad5 משטח חשוף, ושמר על antigenicity epitope הספציפי משלהם. Assay נטרול הצביע על היכולת של וקטור דו ערכי זה לעקוף נטרול על ידי סרה Ad5 חיובית במבחנה. חיסון עכברים הוכיח את הדור של ספציפי חסינות הלחות החזקה לאפיטופ HIV ו -6. מחקר ההוכחה של עיקרון זה הציע כי הפרוטוקול הקשורים לאסטרטגית Antigen capsid על-ההתאגדות יכול להיות מנוצל יתכן עבור הדור של חיסוני וקטורים-Ad5 ידי שינוי חלבוני קפסיד שונים. פרוטוקול זה יכול אפילו להיות further שונה עבור הדור של חיסונים-וקטורי אדנווירוס נדיר-סרוטיפ.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אדנווירוס אדם (מודעות) הוא וירוס עם nucleocapsid icosahedral מכיל הגנום DNA גדילים כפול בגודל בינוני, שאינו-עטף. מודעות שייכת למשפחת adenoviridae, עם סיווג לשבע קבוצות (עד G). כל קבוצה מכילה וירוס של סרוטיפים שונים. מזה, אדנווירוס סרוטיפ 5 (Ad5) מהקבוצה C כבר בהרחבה הנחקרת ביותר ומיושמים באופן נרחב ביותר לגישות וקטורים כמו ריפוי גנטי וחיסונים.

אסטרטגית transgene המסורתית פותחה ומיושמת לשינויים Ad5, המתאפיין בתזוזה של גנים המוקדמים הווירוס עם גן-של-עניין, והביטוי הממוקד של הגן-של-עניין במארח. דוגמאות לכך הן הבנייה של pENV9 / Ad5hrΔE3 ידי החלפת גנים מוקדמים 3 (E3) עם גן rev של קופי וירוס כשל חיסוני 1, בניית AdCMVGag ידי החלפת גנים מוקדמים 1 (E1) עם גן איסור הפרסום של כשל חיסוני אנושיוירוס (HIV) 2, והבנייה של Z לאק מודעות על ידי החלפת E1 עם גן Z אק 3. היישום הרחב של אסטרטגית transgene המסורתית על Ad5 תלוי בגוף הבא: מגוון הרחב של מארחים לAd5, ההנדסה הגנטית אפשרית בנגיף והתפשטות וירוס, האירוח הגדול של הכנס גן זר והבטיחות של Ad5 4,5. עם זאת, efficacies המופחת של טיפולים קליניים וקטורים-Ad5 על ידי שימוש באסטרטגיה זו היה צוואר בקבוק עיקרי, אשר מופה להיות קשורות בעיקר עם Ad5 PEI, מאז Ad5 היא כל כך נפוץ בקרב רוב הילדים ומבוגרים 4,6.

כדי להתגבר על צוואר הבקבוק העיקרי של Ad5, המטרה העיקרית היא לפתח אסטרטגיה חלופית עקיפת Ad5 PEI. חסינות מולדת 7, חסינות אדפטיבית כגון נוגדנים מנטרלים תגובות תא (nabs) 8-10 וCD8 + T 10 נגד Ad5 הוכחו שיתוףntribute לAd5 PEI, עם Ad5 nabs מופיע לשחק את התפקיד הדומיננטי בתרומות לAd5 PEI 10,11. יתר על כן, Ad5 nabs epitopes היעד ממוקמת בחלבוני קפסיד, כולל hexon העיקרי החלבון, סיבים ובסיס פנטון. מזה, hexon הוא היעד העיקרי של Ad5 nabs 8,11-13. בהתבסס על ממצאים אלה, אסטרטגית Antigen capsid על-התאגדות חדשנית כבר הציגה. אסטרטגית רומן זה מדגישה את ההחלפה או שילוב של חלבונים של ריבית על חלבוני קפסיד Ad5, שעוברים או מסכות epitopes Ad5 נטרול, שמובילה להכרה ירד ב nabs וממשלי וקטור Ad5 יעילים. ראוי לציין כי אסטרטגיה זו היא תחרותית כי זה גם יכול לעזור מארחים לעורר חסינות הלחות חזקה וחסינות תאית חזקה ישירות על ידי הצגת אנטיגנים של עניין למערכת החיסונית 4,14,15. בהתבסס על אסטרטגיה זו, השיבוט המולקולרי והצלת וקטור נגיפי מודעות רקומביננטי ניתן לחלק מבנילארבעה שלבים עיקריים: (א) הכנת בר הגן-של-עניין מתגובה או שרשרת פולימרז (PCR) או סינתזה; (ב) קשירה של בר הגן לפלסמיד הסעות המכיל את קטע הגן-של-עניין וזרועות הומולוגיות לשדרת אדנווירוס; רקומבינציה ההומולוגית על ידי (ג) פלסמיד ההסעות המכיל בר הגן-של-עניין עם פלסמיד עמוד השדרה לינארית pAd5 / ΔH5 (GL) 16 הפיכת שותף; (ד) transfection של פלסמיד adenoviral רקומביננטי לינארית כדי להציל את וקטור מודעות רקומביננטי משולב עם אנטיגנים של עניין.

הקבוצה ועוד כמה שלנו הרחיבו את האסטרטגיה זו חלופת מודעות התאגדות לפיתוח חיסון וקטורי מודעות נגד פתוגנים זיהומיות שונים. דיווחנו הדור של וקטור רקומביננטי מודעת מודעה-HVR1-LGS-6 -V3 על ידי שילוב אנטיגן HIV-1 מתויג V3 לאזור HVR1 של hexon Ad5 (hexon5). וקטור שנוצר זה מופעל על strתגובת אונג הלחות חיסון ספציפית לאפיטופ V3 4. אנחנו גם דיווחו על ההתפתחות של Ad5 / HVR2-MPER-L15ΔE1 על ידי שילוב אזור HIV-1 קרום ectodomain הפרוקסימלי (MPER) לאזור HVR2 של hexon5 2. בנוסף, קבוצתו של ד"ר ג 'והשתמשה ביתרונות של אסטרטגית התאגדות מודעות זו לפתח מודעות סרוטיפ 3 (Ad3) חיסוני וקטורים, כלומר., הדור של R1SP70A3 וקטור הנגיפי על ידי שילוב SP70 epitope נטרול של Enterovirus 71 לHVR1 של Ad3 hexon (hexon3). R1SP70A3 נוצר nabs חזק וייצור IFN-γ הספציפי לSP70 epitope, שיוביל לשיעור הגבוה של הגנה מפני Enterovirus 71 אתגר 15.

לצורך ההתייחסות הטכנית, המחקר שלנו ניצל את אסטרטגית Antigen capsid על-ההתאגדות האיכותית להתמקד בדור של וקטור Ad5 דו ערכי Ad5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6 על ידי שילוב אנטיגן HIV-1 לHVR1דה תגו לHVR5 של hexon5. הווקטור הנגיפי שנוצר היה גם הערכת מערכת חיסון. אסטרטגית Antigen capsid על-ההתאגדות יכולה להיות מנוצלת לפיתוח גישות חיסון וקטורים-Ad5 נגד מחלות זיהומיות שונות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אוניברסיטת אלבמה בבירמינגהם בבעלי חיים מוסדי שימוש וטיפול הוועדה אישרה את השימוש בעכברים כמתואר במסמך זה תחת מספר הפרוטוקול שאושר על 101,109,272.

1. גנטי בנייה השתנה פלסמיד pAd5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6 עם capsid על-התאגדות האסטרטגיה Antigen

  1. בנייה של פלסמיד הסעות HVR1-קוואס-HVR5-6 / pH5S
    1. להזמין פלסמיד המכיל את רצף ה- DNA מסונתז HVR1-קוואס בין AgeI אתרי אנזים הגבלה לAccI של גן hexon5.
    2. לעכל 6 מיקרוגרם של הבר מסונתז (HVR1-קוואס) עם AgeI האנזימים (6 יחידות) וAccI (6 יחידות) במשך 3 שעות על 37 מעלות צלזיוס. לפתור את הבר מתעכל ב2% agarose ג'ל אלקטרופורזה על ידי, ולטהר את הקטע עם ערכת חילוץ ג'ל DNA על פי הפרוטוקול של היצרן.
    3. בהתבסס על היחס טוחנת של הכנס לוקטור ב -3: 1, להשתמש באנזים T4 DNA ואנזים בuffer לקשור 12 ng של הבר (HVR1-קוואס) לשל פלסמיד הסעות נבנה בעבר 100 ng HVR5-6/17 בpH5S 10 μl נפח ב RT עבור שעה 2, באמצעות האתרים של AgeI וAccI.
    4. להפוך 1 μl מתוך 10 μl של מוצר קשירה לתוך 50 μl של תאי DH5α electrocompetent בelectroporator (ב 1800 V). להוסיף 950 μl של מדיום SOC לתאי DH5α הפכו דגירה את התערובת למשך שעה 1 על 37 מעלות צלזיוס, עם 300 סל"ד. מורחים 100-200 μl של התערובת 1 מיליליטר על אגר לוריא-Bertani (LB) המכיל kanamycin דגירה O / N על 37 מעלות צלזיוס.
      1. למסך ~ 10 מושבות על ידי PCR מיקוד הבר HVR1-קוואס, לערבב פריימר קדימה (TATGTGTGTCATGTATGCGT), לאחור תחל (GGAGGCCCACTTGTCCAGCTC) ומושבת DH5α יחידה לפתרון תערובת אמן PCR (על פי הפרוטוקול של היצרן). הפעל דגימות על thermocycler על ידי פנייה למדריך שסופק עם פתרון תערובת אמן PCR.
      2. השתמש בפריימר קדימה (TATGTGTGTCATGTATGCGT) רצף הבר HVR1-קוואס בשיבוטים הוקרנו בסעיף 1.1.4.1.
  2. בנייה של פלסמיד pAd5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6
    1. תקציר 6 מיקרוגרם של HVR1-קוואס-HVR5-6 / pH5S עם האנזימים EcoRI (6 יחידות) וPmeI (6 יחידות) במשך 3 שעות על 37 מעלות צלזיוס, ולטהר את הבר המכיל נשק רקומבינציה הומולוגי וגן hexon5 שונה הכפול, כאמור בשלב 1.1.2. Linearize פלסמיד עמוד השדרה pAd5 / ΔH5 (GL) 16 עם שואי.
    2. שיתוף להפוך של בר היעד מפלסמיד ההסעות 100 ng ושל עמוד השדרה pAd5 / ΔH5 לינארית (GL) 100 ng לתוך 50 μl של תאי BJ5183 electrocompetent לרקומבינציה ההומולוגית בelectroporator (ב 1800 V). להוסיף 950 μl של מדיום SOC לתאים הפכו דגירה את התערובת למשך שעה 1 על 37 מעלות צלזיוס, 300 סל"ד. מורחים 100 - תערובת 1 מיליליטר 200 μlעל אגר LB המכיל kanamycin (50 מיקרוגרם / מיליליטר סופי) עבור O / דגירה N על 37 מעלות צלזיוס.
      1. פיק ~ 10 מושבות זעירות לתוך 3 מיליליטר LB הנוזלי המכיל kanamycin (50 מיקרוגרם / מיליליטר סופי) עבור O / דגירה N שבייקר (250 סל"ד, 37 ° C). לחלץ פלסמידים מהתרבות. השתמש ניתוח PCR מסך 10 מושבות על ידי מיקוד הבר HVR1-קוואס, כפי שמודגם בצעד 1.1.4.1.
      2. להקרין את אותו מושבות על ידי ניתוח PCR מיקוד בר PIX של הגנום עמוד השדרה, לערבב פריימר קדימה (AGCTGTTGGATCTGCGCCAGCAGGTT), לאחור תחל (CCAAACAGAGTCTGGTTTTTTATTTAT) וBJ5183 מושבה אחת לפתרון תערובת אמן PCR (על פי הפרוטוקול של היצרן). הפעל דגימות על thermocycler על ידי פנייה למדריך שסופק עם פתרון תערובת אמן PCR.
      3. לייעד את המושבות כפולות החיוביות PCR כpAd5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6.
    3. להפוך של פלסמיד pAd5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6 100 ng בלDH5α תאים כפי שמודגם בשלב 1.1.4.
      1. השתמש ניתוח PCR מסך ~ 10 מושבות על ידי מיקוד הבר HVR1-קוואס, כפי שמודגם בצעד 1.1.4.1.
      2. השתמש ניתוח PCR להקרין את אותו מושבות על ידי מיקוד בר PIX של הגנום עמוד השדרה, כפי שמודגם בשלב 1.2.2.2.
      3. השתמש בפריימר קדימה (TATGTGTGTCATGTATGCGT) רצף הבר HVR1-קוואס בpAd5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6.

2. הכנת השתנה Ad5 ויראלי וקטור Ad5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6

  1. מהווה את המדיום המלא על ידי הוספת FBS (סופיים 10%), חומצות אמינו 100X שאינו חיוניות (סופי 0.1 מ"מ), L-גלוטמין 200 מ"מ (סופי 2 מ"מ) ופניצילין / פתרון סטרפטומיצין (1% סופיים) לDMEM עם גלוקוז גבוה . שמור על תאים אנושיים כליה עוברית (HEK293) במדיום מלא בתרבות חממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 תחת 85% תנאי humidified).
  2. הצלה של נגיפי vector Ad5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6
    1. זרע 3.0 x 10 6 תאי HEK293 באחד בקבוק T-25 המכיל 5 מיליליטר של מדיום מלא ותרבות O / N להשיג monolayer עם מפגש 80%.
    2. Linearize 15 מיקרוגרם של pAd5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6 בנפח 100 μl עם אנזים הגבלת פאצ'י (15 יחידות) ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות.
      1. לחלץ ינארית pAd5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6 על ידי צנטריפוגה התגובה פעמיים (10,000 XG דקות 1) עם נפח שווה של פנול: כלורופורם: isoamyl אלכוהול (יחס של 25: 24: 1) במנדף , ועל ידי צנטריפוגה רציפה (10,000 XG במשך 10 דקות) עם פתרון מעורב (300 μl של 100% אתנול ו -10 μl של נתרן אצטט) ו -700 μl של 70% אתנול. בטל supernatant בכל שלב צנטריפוגה.
    3. Resuspend פלסמיד המטוהר ב~ 40 μl של מים מזוקקים או חיץ טריס-EDTA (TE). לכמת את ה- DNA פלסמיד על ידי מדידת דה האופטיתnsity (OD) ב 260 ננומטר.
    4. Transfect 3 מיקרוגרם של פלסמיד לינארית עם מגיב transfection liposomal מסחרי בבקבוק T-25, על פי הוראות היצרן. לשנות את מדיום transfection עם מדיום מלא ב6 שעות לאחר transfection ודגירה לאחר מכן בחממת התרבות. שמור על תאי transfected על ידי החלפה בינונית מלא כל שעות עד שלושה ימים, עד שצורת לוחות נגיפיים בודדת.
    5. כאשר לוחות לפתח להשפעה מלאה cytopathic (CPE), לגרד את התאים הנותרים את הבקבוק במנדף סטרילי, ותא קציר lysate ידי צנטריפוגה בינונית XG ב 300 במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. להשעות את התא גלולה ב~ 1 מיליליטר של מדיום המכיל 2% FBS, ולשבור תאים על ידי ארבע פעמים הקפאה-הפשרה. לאסוף את supernatant המכיל וירוס חולץ לאחר צנטריפוגה lysate על 10,000 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
  3. התפשטות בקנה מידה גדולה של הווקטור הנגיפי Ad5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6
    1. הפץ הוירוס דואר בבקבוק T-75 המכילים תאי HEK293 בשכונה סטרילי על ידי הדבקה עם 1/3 לlysate מלא מהבקבוק T-25. לאפשר CPE מלא לפתח בתוך יומיים עד שלושה ימים בחממת התרבות. קציר supernatant lysate כאמור בשלב 2.2.5.
    2. הפץ את הנגיף ב02:59 T-175 צלוחיות בשכונה סטרילי על ידי הדבקה עם 1/2 לlysate מלא מהבקבוק T-75, תלוי בתנאי התפשטות וירוס. לאפשר CPE מלא לפתח בתוך יומיים עד שלושה ימים בחממת התרבות. קציר supernatant lysate כאמור בשלב 2.2.5.
    3. הפץ את הנגיף בעשרות אחד או יותר T-175 צלוחיות בשכונה סטרילי על ידי הדבקה עם 1/2 לlysate מלא מהבקבוק הקודם T-175 (ים). לקבוע את כמות השימוש בבקבוק המבוסס על תנאי התפשטות נגיף ואת כמות הנגיף בצורך. קציר supernatant lysate כאמור בשלב 2.2.5 כאשר CPE המלא מתרחש בתוך יומיים עד שלושה ימים בחממת התרבות.
  4. מגעים תחנותication של Ad5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6 על ידי צזיום כלוריד
    1. הכן שתי צפיפויות של פתרונות CsCl ב5 מ"מ HEPES: 1.33 גר '/ מיליליטר ו1.45 גר' / מיליליטר, ואילו הימנעות ממגע עם CsCl.
    2. 4 מיליליטר עומס של CsCl (1.33 גר '/ מיליליטר) בצינור ultracentrifuge סטרילי, ובעדינות לטעון 4 מיליליטר של CsCl (1.45 גר' / מיליליטר) נגד חלק תחתון של הצינור. טען 4 מיליליטר של supernatant lysate לאט על גבי מילויים בשכונה סטרילי.
    3. צנטריפוגה הצינור ב110,000 XG במשך 3 שעות ב 4 ° C כדי להפריד את להקת הווירוס הבוגרת / נמוכה מהלהקה הווירוס הפגומה / גבוהה יותר. לאסוף את הרצועה התחתונה באמצעות מזרק 3 מיליליטר חמוש במחט G 33 ולדלל את הלהקה עם 5 מ"מ HEPES ל4 מיליליטר נפח בשכונה סטרילי.
    4. לטעון צינור אחר עם שתי צפיפויות של פתרונות CsCl והלהקה המדולל של וירוס כמתואר בשלב 2.4.2. צנטריפוגה הצינור ב110,000 O XG / N ב 4 מעלות צלזיוס. לאסוף את הלהקה הנגיפית כמתואר בשלב 2.4.3.
    5. להזריק את פתרון וירוס שנאסף בdialysהוא קלטת על ידי מזרק 3 מיליליטר חמוש במחט G 33 בשכונה סטרילי.
    6. מניחים את הקלטת ב700 מיליליטר של חיץ הדיאליזה 1x (מתכון L 1: של 10x PBS 100 מיליליטר, של גליצרול 100% 100 מיליליטר ו -800 מיליליטר של מים מזוקקים; לסנן את החיץ דרך פילטר 0.22 מיקרומטר) ולהחליף את חיץ הדיאליזה כל 3 שעות במשך 4 פעמים. לשאוב את פתרון וירוס דיאליזה באמצעות מזרק המחטניים.

3. אישור של וקטור ויראלי הציל

  1. Titrations וקטור ויראלי
    1. לכייל הנגיף הפיזי, לדלל שני וירוס וחיץ דיאליזה (שליטת רקע) ב 1: 10 ו -1: 20 במאגר תמוגה הווירוס (10% SDS בטריס-EDTA) בצינורות קטנים, ודגירה כל הצינורות על 56 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
    2. הפעל biophotometer ולהגדיר את המצב של הספיגה ב ננומטר OD 260. השתמש בחיץ המדולל הדיאליזה (1: 10) כדי לאזן את אות רקע על ידי לחיצה בתחתית "ריקה". סוג "10 + 90" בSCR biophotometereen, ולקרוא את האות של הנגיף בדילול מלא (1: 10).
    3. קרא את האות של הנגיף בדילול מלא (1: 20) על ידי ביצוע השיטה בשלב 3.1.2, אבל במקום להקליד "5 + 95" במסך biophotometer. להכפיל שני מספרי קריאת נתוני וירוס על ידי 1.1x10 12 ולחשב את כייל הממוצע עם יחידה כסמנכ"ל / מיליליטר, המבוסס על שני titers הבודד משני דילולים.
    4. לכייל הנגיף המדבק (IP / מיליליטר), להשתמש בTCID הסטטיסטי KARBER 50 השיטה 14 על מנת לקבוע את עומק הזיהום בHEK293 תאים שבלאחר זיהום 10 ימים (dpi)
  2. הערכה של תצוגת חשיפת אנטיגני על וקטור ויראלי
    1. מעיל וקטור ויראלי בצלחת ELISA ולהמשיך עם שאר צעדים בשיטת ELISA סטנדרטי 14. השתמש נוגדן אנושי אנטי-gp41 (2F5) חד שבטי (מב) ואנטי-מב תג העכבר לצורך זיהוי של אנטיגנים המתאימים שולבו 14.
    2. לפתור את וקטור ויראלי בdenatuאלקטרופורזה האדומה ג'ל החלבון (SDS-עמוד) ולהמשיך עם שאר צעדים בשיטה מערבי כתם סטנדרטי 14. השתמש נוגדן אנושי אנטי-gp41 (2F5) חד שבטי (מב) ואנטי-מב תג העכבר לצורך זיהוי של אנטיגנים המתאימים שולבו 14.
  3. בהערכת מבחנה של הווקטור על היכולת לעקוף סרה Ad5-positve
    1. לשמור על תאי הלה במדיום מלא בחממת התרבות (37 CO מעלות צלזיוס, 5% 2 תחת 85% תנאי humidified). מהווה את המדיום המלא על ידי הוספת FBS (סופיים 10%), 200 מ"מ L- גלוטמין (סופי 2 מ"מ) ופתרון פניצילין / סטרפטומיצין (1% סופיים) לנשר מינימום הכרחי בינוני (Meme).
    2. תאי הלה זרע ב6-גם צלחות ב1x10 6 תאים / טוב, ודגירת הצלחות בחממת התרבות (37 CO מעלות צלזיוס, 5% תנאי humidified 2 תחת 85%) עבור 2 שעות. דגירה סרה Ad5-חיובית (0.1 μl או 0 μl) עם 5 IP / תא של וקטור נגיפי (Ad5 או Ad5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6) בחממת התרבות עבור שעה 1 לפני הוספת התערובות על 6 צלחות המכילות גם תאים.
    3. בגיל 24 שעות שלאחר זיהום (HPI), לשטוף תאים פעם עם PBS ותאי lyse ב 0.5 מיליליטר של חיץ תמוגה. צנטריפוגה ב 15,000 XG במשך 5 דקות ולאסוף את supernatant. מערבבים 20 μl של supernatant עם מצע של לוציפראז לקריאת אות בלוציפראז 100 μl, מאז וירוסים מכילים את הגן בלוציפראז.

4. חיסוניות הערכה של וקטור ויראלי הציל

  1. הכן שתי קבוצות חיסון: Ad5 וAd5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6.
    1. הזרק עכברים (n = 8 / קבוצה) לשריר עם וירוסים ב1x10 10 סמנכ"ל / עכבר, במשטר הומולוגי "ראש-דחיפה" חיסון, עם מרווח של 2 שבועות.
    2. ב 2 שבועות לפרסם כל זריקה, לדמם עכברים ללא הרדמה על ידי הלחי דימום עם אזמלי בעלי חיים (אורך קצה 5 מ"מ) ללאסוף דם בצינורות 1.5 מיליליטר.
  2. מערבבים את הדם בצינורות על ידי היפוך למעלה ולמטה, ודגירת הדם על RT למשך 30 דקות. ספין הצינורות ב 10,000 XG במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס וסר העברה (שכבה עליונה) לצינורות 1.5 מיליליטר חדשים.
    1. ספין הצינורות החדשים ב10,000 XG במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס וסר להעברה מסומנת חדש 1.5 מיליליטר צינורות לאחסון ב -80 ° C.
  3. הערכה של חסינות הלחות אנטיגן הספציפי על ידי ELISA מבוסס סרה
    1. לדלל פפטיד (מניות ב1 מ"מ) ופפטיד HIV-1 (מניות ב1 מ"מ) בנפרד ב 100.
    2. מאגר מ"מ קרבונט (pH 9.5) כדי להשיג את ריכוז ציפוי פפטיד ב10 מיקרומטר. מעיל צלחות ELISA עם פפטידים מדוללים בנפרד על ידי הוספה בכל טוב 100 μl ודוגרי הצלחות O / N ב 4 מעלות צלזיוס.
    3. לשטוף את הצלחות עם PBST לארבע פעמים ב 200 μl / טוב ולחסום עבור שעה 1 בBSA 5% בPBST. החל סרה עכברים לצלחות בשעה 1: 100 דילול בbuf החסימהFER, 100 μl / טוב. דגירה הדגירה השעה 2 ב RT.
    4. לשטוף את הצלחות עם PBST לארבע פעמים. לחסום את הצלחות על ידי דוגרים על RT למשך 30 דקות במאגר החסימה ב 100 μl / טוב.
    5. החל עז אנטי עכבר IgG-HRP (1: 5000 במאגר החסימה) ב 100 μl / טוב לשתי הצלחות מצופות פפטיד ופפטיד HIV-1 בנפרד. דגירה עבור שעה 2 ב RT. לשטוף את הצלחות עם PBST.
    6. קראו את הצלחות בננומטר OD450 לאחר דוגרים עם מצע HRP למשך 30 דקות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אסטרטגית Antigen capsid על-ההתאגדות (איור 1 א) נוצלה ליצירה דו הערכי הווקטור הנגיפי Ad5 Ad5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6. ראשית, הסעות פלסמיד HVR1-קוואס-HVR5-6 / pH5S נבנה על ידי subcloning בר HVR1-קוואס לפלסמיד ההסעות נבנו הקודם HVR5-6 / pH5S 17. שנית, pAd5 פלסמיד / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6 14 נבנה על ידי רקומבינציה הומולוגית בין הבר של "EcoRI-HVR1-קוואס-HVR5-His6-PmeI" וpAd5 / ΔH5 לינארית-שואי (GL ) 16...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היישום של אסטרטגית transgene המסורתית על שינוי Ad5 לפיתוח של חיסונים כבר פחת בעיקר בשל צוואר הבקבוק הקשורים לAd5 PEI 4,6. צוואר בקבוק זה יכול להצטמצם באופן חלקי על ידי יישום של האסטרטגיה החלופית Antigen capsid על-התאגדות (איור 1 א), שכן אסטרטגיה זו יכולה להתחמק נטרול על ידי Ad5 nabs ידי החלפת epitopes נטרול של Ad5 עם אנטיגנים של עניין, ולהקל על הדור של חסינות חזקה לאנטיגנים של ריבית המשולב. במחקר זה, הדור של הווקטור הנגיפי דו הערכי שונה Ad5 / H5-HV...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי המכון הלאומי לבריאות מעניקה 5T32AI7493-20 ו5R01AI089337-03. היו הממנים לא היה תפקיד בעיצוב מחקר, איסוף נתונים וניתוח, החלטה לפרסם, או הכנה של כתב היד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1x DPBSThermo ScientificSH30256.01לפיצול תאים 
10x DPBSThermo ScientificSH30378.02להכנת מאגר דיאליזה
גליצרולSIGMAG5516-1Lלהכנת מאגר דיאליזה
SDSBIO-RAD161-0301להכנת מאגר ליזה של וירוסים
סרום בקר עוברי (FBS)Thermo ScientificSH30910.03רכיב של מדיום תרבית
100x חומצות אמינו לא חיוניות& נ.ב.פ;Thermo ScientificSH30238.01רכיב של תרבית בינונית
200 מ"מ L-גלוטמיןCellgro25-005-CIרכיב של תרבית
בינונית תמיסת פניצילין/סטרפטומיצין רכיב Cellgro30-002-CIשל מדיום תרבית
DMEM עם גלוקוז גבוהThermo ScientificSH30081.01לתרבית תאים HEK293
Minimum Essential Medium EagleSIGMAM5650לתרבית תאי HeLa
פנול: כלורופורם: אלכוהול איזואמיל SIGMAP3803-100MLלגודל גדול של טיהור DNA
צזיום כלוריד מוצרי מחקר בינלאומייםC68050לטיהור וירוסים
HEPESCellgro25-060-CIלהכנת תמיסת CsCl
HEK293ATCC51-0036להצלת וירוסים ושדרוג
HeLaATCCCCL-2לבדיקת נטרול
בקבוק T-25Thermo Scientific156367לתרבית תאים 
בקבוק T-75CORNING430641לתרבית תאים 
בקבוק T-175Thermo Scientific159910לתרבית תאים 
אולטרה-צנטריפוגהBECKMANNAלטיהור וירוסים
צינור אולטרה-צנטריפוגהBECKMAN344059לטיהור וירוסים
קלטת דיאליזה Thermo Scientific66380לדיאליזה וירוסית
צלחת ELISAThermo Scientific442404עבור ELISA
אנושי anti-gp41 (2F5) mAbNIH AIDS Reagent Program1475לבדיקות אימונולוגיות
עכבר אנטי-His tag mAbGenScriptA00186לבדיקות אימונולוגיות
SOC בינוניCORNING46-003-CRלטרנספורמציה
תמיסת תערובת מאסטר PCRQIAGEN201445ל-PCR
Animal lancet (אורך נקודה ב-5 מ"מ)MEDIpointלדימום עכברים 
ביופוטומטראפנדורףלטיטרציה פיזית של וירוסים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cheng, S. M., et al. Coexpression of the simian immunodeficiency virus Env and Rev proteins by a recombinant human adenovirus host range mutant. Journal of virology. 66, 6721-6727 (1992).
  2. Matthews, Q. L., et al. HIV antigen incorporation within adenovirus hexon hypervariable 2 for a novel HIV vaccine approach. PloS one. 5, e11815(2010).
  3. DeMatteo, R. P., et al. Long-lasting adenovirus transgene expression in mice through neonatal intrathymic tolerance induction without the use of immunosuppression. Journal of virology. 71, 5330-5335 (1997).
  4. Gu, L., et al. A recombinant adenovirus-based vector elicits a specific humoral immune response against the V3 loop of HIV-1 gp120 in mice through the 'Antigen Capsid-Incorporation' strategy. Virology journal. 11, 112(2014).
  5. Matthews, Q. L., Krendelchtchikov, A. L. G., Li, Z. C. Viral Vectors for Vaccine Development. INTECH. , (2013).
  6. Tang, D. C., Zhang, J., Toro, H., Shi, Z., Van Kampen, K. R. Adenovirus as a carrier for the development of influenza virus-free avian influenza vaccines. Expert review of vaccines. 8, 469-481 (2009).
  7. Flatt, J. W., Kim, R., Smith, J. G., Nemerow, G. R., Stewart, P. L. An intrinsically disordered region of the adenovirus capsid is implicated in neutralization by human alpha defensin 5. PloS one. 8, e61571(2013).
  8. Bradley, R. R., Lynch, D. M., Iampietro, M. J., Borducchi, E. N., Barouch, D. H. Adenovirus serotype 5 neutralizing antibodies target both hexon and fiber following vaccination and natural infection. Journal of virology. 86, 625-629 (2012).
  9. Zaiss, A. K., Machado, H. B., Herschman, H. R. The influence of innate and pre-existing immunity on adenovirus therapy. Journal of cellular biochemistry. 108, 778-790 (2009).
  10. Sumida, S. M., et al. Neutralizing antibodies and CD8+ T lymphocytes both contribute to immunity to adenovirus serotype 5 vaccine vectors. Journal of virology. 78, 2666-2673 (2004).
  11. Sumida, S. M., et al. Neutralizing antibodies to adenovirus serotype 5 vaccine vectors are directed primarily against the adenovirus hexon protein. Journal of immunology. 174, 7179-7185 (2005).
  12. Bradley, R. R., et al. Adenovirus serotype 5-specific neutralizing antibodies target multiple hexon hypervariable regions. Journal of virology. 86, 1267-1272 (2012).
  13. Gahery-Segard, H., et al. Immune response to recombinant capsid proteins of adenovirus in humans: antifiber and anti-penton base antibodies have a synergistic effect on neutralizing activity. Journal of virology. 72, 2388-2397 (1998).
  14. Gu, L., et al. Using multivalent adenoviral vectors for HIV vaccination. PloS one. 8, e60347(2013).
  15. Tian, X., et al. Protection against enterovirus 71 with neutralizing epitope incorporation within adenovirus type 3 hexon. PloS one. 7, e41381(2012).
  16. Wu, H., et al. Construction and characterization of adenovirus serotype 5 packaged by serotype 3 hexon. Journal of virology. 76, 12775-12782 (2002).
  17. Wu, H., et al. Identification of sites in adenovirus hexon for foreign peptide incorporation. Journal of virology. 79, 3382-3390 (2005).
  18. Qiu, H., et al. Serotype-specific neutralizing antibody epitopes of human adenovirus type 3 (HAdV-3) and HAdV-7 reside in multiple hexon hypervariable regions. Journal of. 86, 7964-7975 (2012).
  19. Parker, C. E., et al. Fine definition of the epitope on the gp41 glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1 for the neutralizing monoclonal antibody 2F5. Journal of virology. 75, 10906-10911 (2001).
  20. Farrow, A. L., et al. Immunization with Hexon Modified Adenoviral Vectors Integrated with gp83 Epitope Provides Protection against Trypanosoma cruzi Infection. PLoS neglected tropical diseases. 8, e3089(2014).
  21. Krause, A., et al. Epitopes expressed in different adenovirus capsid proteins induce different levels of epitope-specific immunity. Journal of virology. 80, 5523-5530 (2006).
  22. Omori, N., et al. Modification of a fiber protein in an adenovirus vector improves in vitro gene transfer efficiency to the mouse microglial cell line. Neuroscience letters. 324, 145-148 (2002).
  23. Dmitriev, I. P., Kashentseva, E. A., Curiel, D. T. Engineering of adenovirus vectors containing heterologous peptide sequences in the C terminus of capsid protein IX. Journal of virology. 76, 6893-6899 (2002).
  24. Xue, C., et al. Construction and characterization of a recombinant human adenovirus type 3 vector containing two foreign neutralizing epitopes in hexon. Virus research. 183, 67-74 (2014).
  25. Tian, X., et al. Construction and characterization of human adenovirus serotype 3 packaged by serotype 7 hexon. Virus research. 160, 214-220 (2011).
  26. Kim, J. W., et al. An adenovirus vector incorporating carbohydrate binding domains utilizes glycans for gene transfer. PloS one. 8, e55533(2013).
  27. Vasconcelos, J. R., et al. Pathogen-induced proapoptotic phenotype and high CD95 (Fas) expression accompany a suboptimal CD8+ T-cell response: reversal by adenoviral vaccine. PLoS pathogens. 8, e1002699(2012).
  28. Matthews, Q. L., et al. Genetic incorporation of a herpes simplex virus type 1 thymidine kinase and firefly luciferase fusion into the adenovirus protein IX for functional display on the virion. Molecular imaging. 5, 510-519 (2006).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Shuttle SystemHIVHis6

מאמרים קשורים