Assay למדידת ההשפעות של אתנול במהירות התנועה של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

סיכום

C. elegans הוא מודל שימושי לחקר ההשפעות של אתנול על ההתנהגות. אנו מציגים בדיקת התנהגותית שמכמתת את ההשפעות של אתנול על מהירות התנועה של תולעים זוחלות; ניתן למדוד עם הבדיקה הזו גם את הרגישות הראשונית וגם את התפתחות הסובלנות התפקודית החריפה לאתנול.

תקציר

הפרעות בשימוש באלכוהול הן דאגה בריאותית ציבורית משמעותית, שיש להן אסטרטגיות טיפול יעילות מעטות. אחת הקשיים שעיכבה את הפיתוח של טיפולים יעילים יותר היא חוסר ההבנה היחסי של היסודות המולקולריים של ההשפעות של אתנול על ההתנהגות. הנמטודה, Caenorhabditis elegans (C. elegans), מספקת מודל שימושי שבו ניתן לייצר ולבחון השערות לגבי ההשפעות המולקולריות של אתנול. כאן, אנו מתארים מבחן שפותח ושימש לבחינת התפקידים של גנים מסוימים וגורמים סביבתיים בתגובות התנהגותיות לאתנול, שבהן התנועה היא תוצאת ההתנהגות. אתנול גורם באופן מינון תלוי לדיכוי חריף של זחילה על משטח אגר. ההשפעות הן דינמיות; בעלי חיים שנחשפים לריכוז גבוה מפגינים דיכוי חזק ראשוני של זחילה, המכונה כאן רגישות ראשונית, ואז מתאוששים חלקית ממהירות התנועה למרות המשך נוכחות התרופה. הפלסטיות ההתנהגותית הנגרמת על ידי אתנול מכונה כאן התפתחות סובלנות תפקודית חריפה. מבחן זה שימש כדי להוכיח ששני הפנוטיפים הללו הם שונים וניתנים להפרדה גנטית. מבחן התנועה הפשוט המתואר כאן מתאים לבחינת ההשפעות של מניפולציות גנטיות וסביבתיות על תגובות התנהגותיות חריפות אלו לאתנול ב-C. elegans.

מבוא

הפרעות בשימוש באלכוהול (AUD) נפוצות וגורמות לבעיות בריאותיות, חברתיות וכלכליות חמורות. בבני אדם, הרגישות לפיתוח הפרעת שימוש באלכוהול מושפעת מאוד הן מגנטיקה והן מהסביבה^1,2. מדד פיזיולוגי חזק לנטייה להתמכרות הוא הרמה הראשונית של תגובה (LR) לאלכוהול (אתנול) שמוצגת על ידי שותים חסרי ניסיון^3-5. פנוטיפ LR זה מושפע מרכיבים גנטיים ושאינם גנטיים⁶. קביעת המנגנונים המולקולריים המשפיעים על ה-LR לאתנול היא מטרה חשובה במחקר על התנהגויות תגובה לאתנול.

הנמטודה, Caenorhabditis elegans, משמשת יותר ויותר כמודל לחקר ההשפעות של אתנול על ההתנהגות^7-9. ישנה שימור מולקולרי חזק במנגנון תפקוד מערכת העצבים בין תולעי....

פרוטוקול

1. צעדים לביצוע ביום לפני Assay

1. בחרו תולעי שלב L4 למדיום גידול נמטודות טרי צלחות (NGM) זורעים עם דשא של OP50 E. coli, ותרבותם בשיתוף 20 / N. כל מצב assay דורש 10 תולעים; לאסוף עודף של תולעים, כדי לאפשר O / הפסד N של תולעים.
   1. בעלי חיים רק assay כי הם מבוגרים ראשון-יום; מוטציות רבות לגדול במהירות איטית יותר מאשר סוג בר. התאם את עיתוי קטיף לזנים שיש לי עיכובים התפתחותיים, כך שכל בעלי החיים שנבדקו הם מבוגרים ראשון-יום.

תוצאות

נציגי נתונים (איור 1) מכמה גנוטיפים שונים ובקרות לזווגם מוצגים ^8,24; הנתונים שנבחרו במיוחד שהבדלי גולת הכותרת בבעלי החיים assayed. מידת ההשפעה על 10 דקות של חשיפה נחשבת הרגישות הראשונית של מתח, אשר מוצג על הצירים שנותרו באיור 1 ב-G. זנים מוטנטים עם מהירות היחסית גדולה יותר מהשליטה בשעה 10 דקות נחשבים לעמיד אתנול (איור 1F, G), ואילו זנים מוטנטים עם מהירות היחסית שהיא פחות מהשליטה נחשב לרגיש לאתנול (1D איור, E).

דיון

נוירוביולוגיה הפשוטה וכלים גנטיים זמינה ב C. elegans לעשות תולעת מודל מצוין שבו ללמוד את הבסיסים המולקולריים של ההשפעות של אתנול על התנהגות. כאן אנו מתארים assay שנעשה שימוש כדי לזהות כמה מתווכים מולקולריים וסביבתיים של התגובה התנהגותית החריפה כדי אתנול ^{8,10,20,24,25.} שיטה זו מאפשרת בידול ובדיקה בו זמנית של שני פנוטיפים שונים תגובת אתנול התנהגות, רגישות ראשונית והפיתוח של סובלנות פונקציונלית חריפה, שביחד מודל פנוטיפ שילוב של רמת התגובה ביונקים. אותו assay יכול .......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
C. elegans strains	Caenorhabditis Genetics Center
60 x 15 mm Petri plates, triple vented	Greiner Bio-One	628161	Other plate brands will suffice.
NGM agar	Various		NaCl (3 g/L), agar (17 g/L), peptone (2.5 g/L), 1 ml cholesterol (5 mg/ml in ethanol), 1 ml (1 M) MgSO4, 1 ml (1 M) CaCl2, 25 ml (1 M) KPO4, pH=6, 975 ml H2O
Forceps	Various		e.g., Fisher Scientific #10300
37 °C Incubator	Various		For drying agar
Digital balance	Various		For determining plate weights and agar volume
Copper rings	Plumbmaster	STK#35583 (48 cap thread gasket)	1.6 cm inner diameter, 1.8 cm outer diameter copper rings
100% ethanol	Various
Parafilm M	Bemis	PM996
CCD camera	QImaging	RET-4000R-F-M-12	This camera has a large field of view.
Stereomicroscope with C-mount and 0.5X objective	Leica	MZ6	Discontinued model, M60 is current equivalent.
Light source	Schott	A08923	3”x3”  backlight for even illumination across the field of view
Imaging and tracking software	Media Cybernetics	ImagePro-Plus v6.0-6.3	Newer versions of the software have tracking functions.