Assay למדידת ההשפעות של אתנול במהירות התנועה של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

סיכום

C. elegans הוא מודל שימושי לחקר ההשפעות של אתנול על ההתנהגות. אנו מציגים בדיקת התנהגותית שמכמתת את ההשפעות של אתנול על מהירות התנועה של תולעים זוחלות; ניתן למדוד עם הבדיקה הזו גם את הרגישות הראשונית וגם את התפתחות הסובלנות התפקודית החריפה לאתנול.

תקציר

הפרעות בשימוש באלכוהול הן דאגה בריאותית ציבורית משמעותית, שיש להן אסטרטגיות טיפול יעילות מעטות. אחת הקשיים שעיכבה את הפיתוח של טיפולים יעילים יותר היא חוסר ההבנה היחסי של היסודות המולקולריים של ההשפעות של אתנול על ההתנהגות. הנמטודה, Caenorhabditis elegans (C. elegans), מספקת מודל שימושי שבו ניתן לייצר ולבחון השערות לגבי ההשפעות המולקולריות של אתנול. כאן, אנו מתארים מבחן שפותח ושימש לבחינת התפקידים של גנים מסוימים וגורמים סביבתיים בתגובות התנהגותיות לאתנול, שבהן התנועה היא תוצאת ההתנהגות. אתנול גורם באופן מינון תלוי לדיכוי חריף של זחילה על משטח אגר. ההשפעות הן דינמיות; בעלי חיים שנחשפים לריכוז גבוה מפגינים דיכוי חזק ראשוני של זחילה, המכונה כאן רגישות ראשונית, ואז מתאוששים חלקית ממהירות התנועה למרות המשך נוכחות התרופה. הפלסטיות ההתנהגותית הנגרמת על ידי אתנול מכונה כאן התפתחות סובלנות תפקודית חריפה. מבחן זה שימש כדי להוכיח ששני הפנוטיפים הללו הם שונים וניתנים להפרדה גנטית. מבחן התנועה הפשוט המתואר כאן מתאים לבחינת ההשפעות של מניפולציות גנטיות וסביבתיות על תגובות התנהגותיות חריפות אלו לאתנול ב-C. elegans.

מבוא

הפרעות בשימוש באלכוהול (AUD) נפוצות וגורמות לבעיות בריאותיות, חברתיות וכלכליות חמורות. בבני אדם, הרגישות לפיתוח הפרעת שימוש באלכוהול מושפעת מאוד הן מגנטיקה והן מהסביבה^1,2. מדד פיזיולוגי חזק לנטייה להתמכרות הוא הרמה הראשונית של תגובה (LR) לאלכוהול (אתנול) שמוצגת על ידי שותים חסרי ניסיון^3-5. פנוטיפ LR זה מושפע מרכיבים גנטיים ושאינם גנטיים⁶. קביעת המנגנונים המולקולריים המשפיעים על ה-LR לאתנול היא מטרה חשובה במחקר על התנהגויות תגובה לאתנול.

הנמטודה, Caenorhabditis elegans, משמשת יותר ויותר כמודל לחקר ההשפעות של אתנול על ההתנהגות^7-9. ישנה שימור מולקולרי חזק במנגנון תפקוד מערכת העצבים בין תולעים ויונקים, ומספר גנים שהוכחו כמשפיעים על ה-LR לאתנול בתולעים הוכחו כמשפיעים על ה-LR לאתנול ביונקים^10-16, והוצגו כמרמזים על נטייה להתמכרות בבני אדם^17-19.

אתנול מרעיל תולעים, מה שבא לידי ביטוי בירידה במהירות התנועה שלהן. מספר מעבדות שונות פיתחו מבחנים התנהגותיים הנבדלים זה מזה במספר דרכים, לדוגמה, התנהגות התנועה שהם חוקרים (זחילה לעומת שחייה^{11,12,14,20,21}) או בהרכב הפתרונות שבהם מתבצעים המבחנים (מדיום גידול נמטודה לעומת תמיסת דנט^20,22). באופן מעניין, מבחנים מגוונים אלו חשפו פרופילי תגובת מינון שונים במקצת להשפעות האתנול. תוצאות אלו הצביעו על הבדלים חשובים בהתנהגויות הבסיסיות של זחילה ושחייה^9,23, כמו גם על תפקיד המשתנה הסביבתי אוסמולריות בתגובות לאתנול²⁰, והדגישו את החשיבות בתיאור פירוט ניסויי של המבחנים השונים.

מבחן למדידת ההשפעות החריפות של אתנול על התנהגות הזחילה מוצג כאן. מבחן זה שימש בהרחבה לחקר ההשפעות הגנטיות והסביבתיות על ה-LR לאתנול^{8,10,20,24,25}. פנוטיפ ה-LR של היונק הוא הרכב של לפחות שני רכיבים, רגישות ראשונית לאתנול וסובלנות תפקודית חריפה לאתנול^26,27. בתולעים, הוכח שפנוטיפ ה-LR ניתן להפרדה לשני הרכיבים הללו באמצעות מבחן התנהגותי זה. ניתן לבחון את ההשפעות של מניפולציות גנטיות וסביבתיות על שני הפנוטיפים באמצעות מבחן יחיד זה. חשוב לציין ששני הפנוטיפים הללו ניתנים להפרדה גנטית.

פרוטוקול

1. צעדים לביצוע ביום לפני Assay

1. בחרו תולעי שלב L4 למדיום גידול נמטודות טרי צלחות (NGM) זורעים עם דשא של OP50 E. coli, ותרבותם בשיתוף 20 / N. כל מצב assay דורש 10 תולעים; לאסוף עודף של תולעים, כדי לאפשר O / הפסד N של תולעים.
   1. בעלי חיים רק assay כי הם מבוגרים ראשון-יום; מוטציות רבות לגדול במהירות איטית יותר מאשר סוג בר. התאם את עיתוי קטיף לזנים שיש לי עיכובים התפתחותיים, כך שכל בעלי החיים שנבדקו הם מבוגרים ראשון-יום.

2. צעדים לביצוע ביום Assay

1. הכנה לassay:
   1. לבצע מבחני על צלחות unseeded סטנדרטיים 60 x 15 מ"מ NGM. ייבש את כל הצלחות לשימוש ב 37 צלזיוס למשך 2 שעות, עם מכסים מ. לכל ניסוי ניסוי, להשתמש בארבע צלחות NGM מיובשות; אלה יהיו 0 מ"מ ו -400 מ"מ צלחות assay אתנול וצלחות ההסתגלות אשר נלוו אליהם.
      הערה:השימוש בצלחות NGM הוא חשובה כאן; הבדלים בהרכב של הצלחות, בosmolarity בפרט, יכולים מאוד להשפיע על תגובת המינון של אתנול על התנהגות, וזאת בשל, לפחות בחלקו, לשינויים בכמות של אתנול שנצברה על ידי בעלי החיים ^20. אגר NGM הוא 160 mOsm.
   2. לאחר ייבוש, שוקל כל אחת מצלחות NGM unseeded לשימוש בassay ושם לב במשקל. לקבוע את עוצמת הקול של מדיה בצלחות המבוססות על המשקל של צלחת ריקה. כקירוב להמרת משקל של אגר להיקף, מניח שהתקשורת שוקלת כמו נפח שווה של מים.
      הערה: התוצאות עקביות ביותר שלנו כבר נמצאה עם תקשורת NGM שייבש מספיק שיש לו מקורי 10 מיליליטר נפח פוסט-ייבוש בין 8.3-8.9 מיליליטר נפח. אלטרנטיבה לזמן היבש 2 hr היא להתייבש עד הצלחות להגיע לטווח כרך זה כדי להסביר את הבדלים בחממות.
   3. להמס 4 טבעות נחושת (קוטר פנימי של 1.6 סנטימטרים) לתוך השטח של כל אחת מהצלחות לפעול כמכלאות לגנוטיפים או קבוצות טיפול של worms.Grasp כל טבעת עם מלקחיים, וחום השונים בלהבה (להבה חזקה ממבער בונזן עובדת היטב) למשך כ 3 שניות. מייד למקם את הטבעת על צלחת ועדיין מחזיק את הטבעת עם המלקחיים כדי למנוע ממנה 'דילוג'.
      1. ודא שהטבעת נשענת שטוחה נגד פני השטח של אגר על ידי לחיצה בעדינות עם המלקחיים במספר נקודות על הטבעת. בעת ביצוע הטבעת, להיות זהיר כדי להשאיר מקום לשלוש טבעות נוספות.
      2. ממסים שלוש טבעות נחושת נוספות לתוך השטח של הצלחת, דואג למקם אותם כקרוב זה לזה ככל האפשר, כך שכל ארבעת יהיו בשדה הראייה של המצלמה.
         הערה: ביצוע חותם טוב עם אגר הוא חיוני כדי לשמור על התולעים בטבעות במהלך assay. טבעות שלדלג סביב על הצלחת צפויים להפוך את החותם הנכון עם אגר וייתכן ויהיה הצלקת אגר, המאפשר תולעים להתחפר ומפריע לדמיין את התולעים.
      3. לכל צלחת assay להכין צלחת נלווית "הסתגלות", שאמור להיות יבשה וunseeded ויקבל שום אתנול. הנח ארבע טבעות נחושת על צלחות אלה.
   4. תווית התחתונה של הצלחות ליד כל טבעת עם מתח התולעת לשימוש בטבעת, נזהרת שלא לכתוב בשדה הראייה של הטבעת עצמה. התאם את התוויות על צלחת assay עם צלחת ההסתגלות הנלווית אליה.
   5. לחשב את הסכום של 100% אתנול להוסיף לכל צלחת assay כך שהריכוז הסופי הוא 0 מ"מ או 400 מ"מ אתנול (משקל לנפח). עבור כל ניסוי (n = 1), יהיה אחד 0 מ"מ וצלחת אתנול מ"מ אחד 400; צלחות הסתגלות אינן מקבלות אתנול. הוסף את אתנול, pipetting אותו סביב פני השטח של הצלחת. השתמש בסרט מעבדה כדי לאטום את הצלחת ולאפשר לו לאזן על גבי הספסל עבור שעה 2.
   6. כאשר 1.5 שעות חלפו, מתחיל שלב ההסתגלות של assay, שלב 2.2.
2. בצע assay תנועה: צלחות Assay
   1. זהירות להעביר 10 תולעים של כל קבוצת ניסוי למרכז טבעת נחושת על צלחת ההסתגלות. הסר את כל מזון המופיע על אגר בשלב זה על ידי גירוד עדין עם בחירת התולעת. להשתנות את הסדר שבו שמו את קבוצות ניסוי על הצלחות על פני ניסויים ניסיוניים, כך שאותו הזנים לא לשים על הצלחות באותו סדר על פני ניסויים.
      הערה: המטרה היא להעביר את בעלי החיים לצלחת עם כמויות מזעריות של מזון, כי אם אוכל על צלחת ההסתגלות מועבר לצלחת assay התולעים לצבור סביב האוכל ואת ההשפעה של התרופה על תנועה יהיה מוסתרת.
   2. היזהר שלא לשבור את פני השטח של אגר עם הבחירה, כפי שזה יאפשר התולעים להתחפר וישבש את assay. דגירה התולעים ב RT למשך 30 דקות.
   3. ודא שיש מרווח מתאים בין החניכות של כל צלחת. הנסיין מנוסה יכול להעביר 40 בעלי חיים, 10 / טבעת במשך 4 טבעות ב< 1.5 דקות, אבל כל מרווח של עד 2 דקות מקובל. יש assay הסטנדרטי סרטי הקלטה ב 10-12 דקות ו30-32 דקות של חשיפה לשני מ"מ 0 ו -400 מ"מ אתנול.
   4. ליזום את צלחת ההסתגלות לחשיפת 0 מ"מ וצלחת ההסתגלות לחשיפה של 400 מ"מ כ 2 דקות ו- 30 שניות לגזרים כדי לאפשר חיסכון של קובץ הסרט הראשון לפני חייב להתחיל את הסרט השני.
   5. לאחר תקופת ההסתגלות של 30 דקות, להעביר את התולעים מצלחות ההסתגלות לצלחות assay. העבר את התולעים לצלחות assay (0 מ"מ או 400 מ"מ אתנול) באותו סדר שבו נוספו לצלחת ההסתגלות, שמירה על המסלול של התזמון בין הגמר של כל צלחת. חותם את הצלחת עם סרט מעבדה כדי להקטין את איבוד של אתנול לאידוי.
   6. Use תנועה גורף עם בחירת תולעת שטוחה עם קצוות דקות כדי לאסוף תולעים על גבי הטנדר השטוח. לבצע את ההעברה של תולעים מצלחת הסתגלות unseeded לצלחת assay ללא השימוש בחיידקים, המשמש בדרך כלל בהעברת תולעים כמו זה עוזר להדביק את התולעת לבחירה.
      הערה: המהירות שבה בעלי החיים מועברים בשלב זה היא חשובה מאוד, כי התולעים הראשונים על הצלחת יהיו חשופים לאתנול יותר מהתולעים האחרונים שנוספו לצלחת, ונקודות זמן קודמות עשויות להראות כמה תופעות תלויות זמן. זו הסיבה העיקרית למסתובב אשר זנים מונחים על צלחת ראשונה על פני משכפל ניסיוני.
3. בצע תנועת Assay: צילומים
   1. השתמש בשילוב מיקרוסקופ / מצלמה המאפשר הדמיה בו זמנית של כל ארבע הטבעות בשדה הראייה (כ ² מ"מ המרובע 42x42), כגון מטרת מיקרוסקופ 0.5x, הגדלת 0.8x ומצלמה עם 2048x2048 7.481; CCD פיקסל מ '.
   2. השתמש אפילו תאורה על פני שדה הראייה, אשר מסייע בזיהוי אובייקט בשלב סף עוצמה (ראה להלן). תאורה אחורית "x3" 3 עובדת היטב.
   3. תמונת התולעים בתקשורת בצד את צלחת מיקום (מכסה למטה), אשר מייצר ניגוד כי הוא איבד בעת השימוש בתאורה האחורית לעומת מיקרוסקופ מסורתי מועבר מקור אור.
   4. הכן את תוכנת ניתוח תמונה כדי ללכוד זמן לשגות סרטים של התולעים נעו. הגדר את התוכנה לצילום תמונות בגוונים אפורים 12-bit כל 1 שניות, כסרט 2-דקות (120 מסגרת). כדי להקטין את הגודל של קובץ הפלט, תוך שמירה על רזולוציית תמונה מספיק, להשתמש במצב binning 2x2 כדי ללכוד תמונות 1024x1024 פיקסלים.
   5. רשום את הסרטים. להתחיל בהקלטת סרט 120-מסגרת של הצלחת הראשונה (0 אתנול מ"מ) 10 דקות לאחר התולעים שעבר הונחו על צלחת ש. שמור את קובץ הסרט.
   6. רשום את הצלחת השנייה (400 אתנול מ"מ). חזור על תהליך זה עבורשני הצלחות מתחילות 30 דקות לאחר התולעים שעבר הונחו על הצלחת הראשונה (0 אתנול מ"מ) כדי ללכוד את נקודות הזמן דק '30-32 לכל חשיפה.
      הערה: אפשר מספיק זמן כדי לשמור את קבצי תמונה לאחר כל פגישת לכידה לפני תחילת הקלטה של ​​הצלחת הבאה כדי להיות מנותחות.
   7. לעתיד-הגהה של סרטי ארכיון ולאפשר את הסרטים האלה שייפתחו ונותחו על ידי תוכנת הדמיה תוכניות אחרות ברשות הציבור בקוד פתוח, כגון ²⁸ ImageJ, להמיר עותק של כל סרט עד 8 ​​סיביות 256 קבצי TIFF בקנה מידה אפורה.
      הערה: תוכנת ניתוח תמונה המתוארת כאן משתמשת בפורמט קובץ קניינית.
4. ניתוח של סרטים באמצעות תוכנת ImagePro.
   1. ברגע שנתפס, לנתח את הסרטים באמצעות תמונה-Pro Plus תוכנה או שווה ערך.
      הערה: מגוון רחב של תוכנות מעקב אובייקט אחרות זמינה שנעשה שימוש כדי לעקוב אחר הצלחה מרובה C. elegans בפעם אחת ²⁹ וכאלהתוכנה יכולה להחליף באופן סביר לזה שתואר כאן כצעדי זיהוי אובייקטים מבוססים על עקרונות דומים. השיטה המתוארת מתייחסת לגרסאות תמונה-Pro Plus תוכנת 6.0-6.3 ו 7.0, גרסאות חדשות יותר של תמונה-Pro Plus תוכנה עשוי להיות הבדלים קלים.
   2. לנתח סרטים ב2-דקות (120 מסגרת) מגזרים. ראשית, להחיל מסנן לתמונות כדי לשטח את הרקע ולשפר את הניגודיות של אובייקטי התולעת. בחר את המסנן באופן הבא: תפריט> תהליך> מסננים> שיפור> לרדד: פרמטרים: רקע = Dark; כוללים רוחב = 20 Pix.
   3. Re-להציל את הסרטים לאחר שלב הסינון אבל תמיד לשמור את הסרט המקורי בצורה לא המסוננת שלה.
      1. לנתח את התנועה של בעלי חיים בכל טבעת בנפרד עם אזור מעגלי של העניין (ROI) הממוקם בגודל וחפיפה עם טבעת הנחושת. לזהות ולעקוב אחר התולעים עם התפריט> מדוד> לעקוב אחר אובייקטים ... הפקודה; זה מעלה את המעקב Dחלון טבלת אתא. לחצן אפשרויות המעקב מאפשר מסלולים ספציפיים שנכללו ולהגביל כל חפצים ניסיוניים.
   4. תחת הלשונית האוטומטית המעקב, השתמש בפרמטרים הבאים: פרמטרי מסלול: מגבלת מהירות (רדיוס חיפוש) = 400 מיקרומטר / מסגרת, גבול ההאצה = Auto, הכולל אורך מסלול מינימאלי = 400 מיקרומטר, סוג תנועה שולט = כאוטי; אובייקטים בפרמטרי מסלולים: אפשר מסלולים חלקיים = כן, אורך Min = 21 מסגרות, מעקב עומק חיזוי = 1 מסגרת.
   5. כדי להתחיל בתהליך המעקב, לחץ על הציגו את כל המסלולים באופן אוטומטי לתפקד כפתור כדי להעלות את ספירה / תיבת הדו-שיח אפשרויות גודל ותיבת הדו-שיח המעקב. בחר באפשרות ידנית לבחירת טווח עצימות בתיבת הדו-שיח רוזן / גודל, אשר מספקת את צעד הסף החשוב שמשתמש בעוצמה האפורה בקנה המידה של פיקסלים התולעת כדי להדגיש אובייקט תולעת לניתוח ולהתעלם פיקסלים רקע הבהירים יותר.
      1. התאם את SLI סף העצמהders (אחד כדי לקבוע את הגבול העליון, אחד כדי לקבוע את הגבול התחתון) כדי ליצור מגוון כולל שמדגיש אובייקטים כל חושך. מגוון של 0-1,500 בסולם של 0-4,095 הוא נקודת התחלה טובה לכוונון עדין יותר.
      2. החל מסנן גודל שלא לכלול אובייקטים שגודלם וקטנים יותר מאשר אובייקט תולעת אחת, כגון טבעת הנחושת ופסולת כלשהי על הצלחות. להגדיר שני פרמטרים גודל לעשות את זה כי לכסות גדלים לתולעים בודדים במגוון תנוחות עם מדוד> פריט תפריט מדידות בחרו בתיבת הדו-שיח אפשרויות רוזן / גודל. (פינת טווח: 28,000-120,000 מיקרומטר ² ומגוון היקפי: 600-2,500 מיקרומטר).
      3. אם מתח מוטציה הוא קטן יותר באופן משמעותי או גדול יותר מבעלי חיים אחרים על הצלחת להיות מנותח, להרחיב את מגוון הגדרות המסנן לזיהוי אובייקט כדי להתאים את הגדלים השונים של הזנים הראשונים לפני מעקב אחר בעלי חיים, כך שהגדרות לא צריכים להיות שונה אמצע ניתוח.
   6. השלם את תהליך המעקב על ידי לחיצה על המשך בתיבת הדו-שיח המעקב. מבחינה ויזואלית להשוות מסלולי פלט עם ההתקדמות של כל תולעת בסרט על מנת להבטיח שכל תולעת מיוצגת, אלא אם יש סיבה טובה שלא לכלול אותו מבוסס על הגדרות מסנן אוטומטיות. מחקו באופן ידני מסלולים שהופקו על ידי הנוכחות של אובייקטים שאינם תולעת אישרו כי עמדו בקריטריוני מסנן הגודל.
   7. להשתמש בתוכנה כדי לחשב את המהירות של כל תולעת בין כל מסגרת (המרחק נסע לcentroid של אובייקט ל1 שניות בין מסגרות) ולהציג את המהירות ממוצעת לכל מסלול ומהירות הממוצעת על פני כל המסלולים לאוכלוסייה של תולעים טבעת נחושת. שקול ממוצע סופי זה להיות n = 1 במונחים של ניסויים ניסיוניים. לייצא את הנתונים לתכנית גיליון אלקטרוני עבור ניתוחים סטטיסטיים ונתונים בארכיון.
   8. ברגע שהנתונים כבר נרשמו לטבעת הראשונה על הצלחת, להעביר את ההחזר על ההשקעה לטבעת הבאה וחזור על תהליך המעקב, מבלי לשנות כל אחד מהפרמטרים.
   9. לחשב את המהירות היחסית של תנועה באמצעות:
   10. מהירות היחסית (%) = טופל (400 מ"מ) מהירות / מטופל (0 מ"מ) מהירות x 100.
       הערה: מניפולציות גנטיות שונות לעתים קרובות לשנות את שיעור התנועה הבסיסי של בעלי חיים. על מנת לקבוע את ההשפעה של אתנול על מהירות התנועה של בעלי חיים ולהיות מסוגל להשוות את ההשפעות הללו על פני גנוטיפים או תנאים שונים, לחשב את מהירות היחסית.

תוצאות

נציגי נתונים (איור 1) מכמה גנוטיפים שונים ובקרות לזווגם מוצגים ^8,24; הנתונים שנבחרו במיוחד שהבדלי גולת הכותרת בבעלי החיים assayed. מידת ההשפעה על 10 דקות של חשיפה נחשבת הרגישות הראשונית של מתח, אשר מוצג על הצירים שנותרו באיור 1 ב-G. זנים מוטנטים עם מהירות היחסית גדולה יותר מהשליטה בשעה 10 דקות נחשבים לעמיד אתנול (איור 1F, G), ואילו זנים מוטנטים עם מהירות היחסית שהיא פחות מהשליטה נחשב לרגיש לאתנול (1D איור, E).

דיון

נוירוביולוגיה הפשוטה וכלים גנטיים זמינה ב C. elegans לעשות תולעת מודל מצוין שבו ללמוד את הבסיסים המולקולריים של ההשפעות של אתנול על התנהגות. כאן אנו מתארים assay שנעשה שימוש כדי לזהות כמה מתווכים מולקולריים וסביבתיים של התגובה התנהגותית החריפה כדי אתנול ^{8,10,20,24,25.} שיטה זו מאפשרת בידול ובדיקה בו זמנית של שני פנוטיפים שונים תגובת אתנול התנהגות, רגישות ראשונית והפיתוח של סובלנות פונקציונלית חריפה, שביחד מודל פנוטיפ שילוב של רמת התגובה ביונקים. אותו assay יכול ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
C. elegans strains	Caenorhabditis Genetics Center
60 x 15 mm Petri plates, triple vented	Greiner Bio-One	628161	Other plate brands will suffice.
NGM agar	Various		NaCl (3 g/L), agar (17 g/L), peptone (2.5 g/L), 1 ml cholesterol (5 mg/ml in ethanol), 1 ml (1 M) MgSO4, 1 ml (1 M) CaCl2, 25 ml (1 M) KPO4, pH=6, 975 ml H2O
Forceps	Various		e.g., Fisher Scientific #10300
37 °C Incubator	Various		For drying agar
Digital balance	Various		For determining plate weights and agar volume
Copper rings	Plumbmaster	STK#35583 (48 cap thread gasket)	1.6 cm inner diameter, 1.8 cm outer diameter copper rings
100% ethanol	Various
Parafilm M	Bemis	PM996
CCD camera	QImaging	RET-4000R-F-M-12	This camera has a large field of view.
Stereomicroscope with C-mount and 0.5X objective	Leica	MZ6	Discontinued model, M60 is current equivalent.
Light source	Schott	A08923	3”x3”  backlight for even illumination across the field of view
Imaging and tracking software	Media Cybernetics	ImagePro-Plus v6.0-6.3	Newer versions of the software have tracking functions.