מאמר שיטה

בחירת גודל האוטומטי ג'ל כדי לשפר את האיכות של ספריות רצף הדור הבא הוכן מדגימות סביבתיות מים

10K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/52685

⸱

17 באפריל 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Faculty of Medicine, The University of British Columbia, 2Coastal Genomics, 3British Columbia Public Health Microbiology and Reference Laboratory

במאמר זה

סיכום

כתב יד זה מתאר גישה אוטומטית לבחירת גודל ג'ל לטיהור מקטעי DNA לריצוף הדור הבא. טכנולוגיית הריינג'ר מספקת אוטומציה מלאה של כל תהליך העמסת ג'ל אגרוז, ניתוח אלקטרופורטי ושחזור של שברי DNA ממוקדים המאפשרים ספריות ריצוף מהדור הבא בתפוקה גבוהה ובאיכות גבוהה.

תקציר

ריצוף הדור הבא של דגימות סביבתיות יכול להיות מאתגר בגלל כמות ואיכות ה-DNA המשתנה בדגימות אלה. יש צורך בספריות DNA באיכות גבוהה לקבלת תוצאות מיטביות מריצוף הדור הבא. דגימות סביבתיות כגון מים עשויות להיות באיכות נמוכה וכמויות נמוכות של DNA, כמו גם מזהמים המשקעים יחד עם DNA. התהליכים המכניים והאנזימטיים הכרוכים במיצוי והכנת הספרייה עלולים לפגוע עוד יותר ב-DNA. בחירת גודל ג'ל מאפשרת טיהור ושחזור של מקטעי DNA בגודל מוגדר ליישומי ריצוף. עם זאת, משימה זו היא אחד השלבים הגוזלים זמן רב ביותר בזרימת העבודה של הכנת ספריית ה-DNA. הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר אוטומציה מלאה של העמסת ג'ל אגרוז, ניתוח אלקטרופורטי ושחזור של מקטעי DNA ממוקדים.

במחקר זה, אנו מתארים גישה בעלת תפוקה גבוהה להכנת ספריות DNA באיכות גבוהה מדגימות מים מתוקים שניתן ליישם גם על דגימות סביבתיות אחרות. השתמשנו בגישה עקיפה כדי לרכז תאי חיידקים מדגימות מים מתוקים סביבתיים; ה-DNA חולץ באמצעות ערכת מיצוי DNA זמינה מסחרית, וספריות DNA הוכנו באמצעות פרוטוקול מסחרי מבוסס טרנספוזון. מקטעי DNA של 500 עד 800 bp נבחרו בגודל ג'ל באמצעות Ranger Technology, תחנת עבודה אוטומטית לאלקטרופורזה. ריצוף ספריות ה-DNA שנבחרו בגודל הראה שיפורים משמעותיים באורך הקריאה ובאיכות קריאות הרצף.

מבוא

מטגנומיקה כרוכה בריצוף של כל החומר הגנטי בדגימה כדי לאפיין את הקהילות המיקרוביאליות הקיימות. זהו תהליך מורכב ויקר הכולל המרה של חומצות גרעין שחולצו לספריות DNA ואחריו ריצוף מהדור הבא. ספריות באיכות גבוהה חיוניות לתפוקת נתונים מקסימלית ולניתוח מטא-גנומיקה מדויק. דגימות סביבתיות, כגון דגימות מים, מהוות לעתים קרובות אתגרים משמעותיים ליצירת ספריות באיכות גבוהה, בשל כמויות נמוכות של DNA שעלולות להתפרק גם1-3 ונוכחותם של מעכבי PCR4-6.

ספריות באיכות גבוהה מורכבות באופן אידיאלי ממקטעים ארוכים יותר של DNA בטווח צר של אורכים. על מנת למקסם את כמות הנתונים השימושיים שנוצרים בכל ריצת ריצוף, אורך ה-DNA בספרייה צריך להיות לפחות ארוך כמו אורך הקריאה המרבי של שיטת הריצוף שבה נעשה שימוש. בעת שימוש בטכנולוגיית ריצוף על ידי סינתזה כגון Illumina MiSeq, גודל שברי ה-DNA משפיע על היעילות שבה נוצרים אשכולות בתא הזרימה. לדוגמה, כאשר ספרייה מכילה מקטעי DNA קצרים וארוכים יותר, הקצרים יותר יהיו מיוצגים יתר על המידה בנתוני הריצוף7,8. לעומת זאת, ספרייה עם מקטעי DNA בגודל דומה תהיה מיוצגת באופן פרופורציונלי בנתוני הריצוף. ערכות הכנה רבות לספרייה משתמשות בשיטות מבוססות קשירה כדי להוסיף מתאמים לשברי ה-DNA ויש צורך בבחירת גודל כדי להסיר דימרים של מתאמים שאינם מכילים תוספת9,10. ישנן שיטות רבות11,12 כדי להשיג זאת, אך הטכניקה היחידה שנותנת את התוצאות העקביות ביותר היא ההפרדה האלקטרופורטית של ה-DNA ואחריה שחזור האורכים הרצויים של DNA13,14. ניתן לבצע תהליך זה באופן ידני עבור מספר קטן של דגימות, אך כאשר עומדים בפני עיבוד מאות דגימות, נדרשים פתרונות אוטומטיים. הפלטפורמות הזמינות כיום לבחירת גודל ג'ל אוטומטית הן תפוקה נמוכה ויש צורך בפלטפורמות חדשות לעיבוד מספר רב של דגימות לריצוף. ניתן לשלב את טכנולוגיית הריינג'ר עם תחנות עבודה קיימות לטיפול בנוזלים כדי לאפשר שימוש באלקטרופורזה של ג'ל אגרוז לבחירת גודל ולמטרות אנליטיות בקנה מידה העונה על סביבת התפוקה הגבוהה של ימינו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

אוסף מים 1. וסינון

  1. לאסוף דגימות מים מתוקים מאתרים שונים (איור 1). לעבור דגימות באמצעות סדרה של מסננים: מסנן 1 מיקרומטר, 0.2 מיקרומטר מסנן, וזרימה משיקה מסנן 30 הפסקת kDa לשיטתי אוקריוטים נפרד, חלקיקים בגודל חיידקי וירוסים, בהתאמה.
    שים לב: רק הטיהור והניתוח של החומר התאושש על 0.2 מיקרומטר המסננים (חיידקי חיים-חינם) מתואר בדוח זה, אבל גישות דומות יכולות לשמש לחלקיקים האחרים התאוששו מהמסננים.

2. ריכוז חיידקים, הפקת DNA וטיהור

  1. הסר את מסנן 0.2 מיקרומטר הקרום (ים) ממערכת סינון מים (תרשים סכמטי, איור 2). מקפלים את מסנן 0.2 מיקרומטר הדיסק במחצית ולמקם אותו לתוך צינור 50 מיליליטר עם הצד עד הפתוח. הוסף 5 מיליליטר של תמיסת פוספט שנאגרו 1x (PBS) ו0.01% Tween, pH 7.4 להצינור. אם מסנן אחד או יותר המשמש בתהליך להעסיק צינור שונה למסנן. צינור חנות (s) עם מסנן על 4 מעלות צלזיוס עד מעובד. אחרת, המשך לשלב 2.2.
  2. הסר את מסנן 0.2 מיקרומטר קרום מצינור 50 מיליליטר עם מלקחיים סטרילית. מסנן מקום (ים) על צלחת פטרי (לעזוב את חיץ PBS בצינור).
    1. עם מלקחיים סטרילית ומספריים סטרילי, לחתוך את המסנן לרצועות קטנות (1 סנטימטר x 1 סנטימטר). לחטא מלקחיים ומספריים על ידי השרייה בisopropanol 70%, מנגב עם decontaminant משטח DNA ושטיפה במי ultrapure מסוג 1 בין מדגמים שונים.
  3. הנח את המסנן חתוך לרצועות האחוריות לתוך צינור 50 מיליליטר. הוסף 10 מיליליטר של 1x PBS ו0.01% Tween, pH 7.4 למסנן ולכן יש בסך הכל 15 מיליליטר של חיץ בשפופרת 50 מיליליטר.
  4. הוסף 6 חרוזים נקיים טונגסטן (3 מ"מ קוטר) על צינור אחד 50 מיליליטר, לכסות את הצינור עם Parafilm, ומערבולת במרץ במשך 20 דקות (50 מיליליטר להשתמש מתאם מערבולת צינורות). אם multiple מסננים מעובדים ממדגם אחד, העברה והבריכה כל homogenate לתוך צינור 50 מיליליטר נקי. בצנטריפוגה הצינורות ב 3300 XG במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
  5. Resuspend גלולה וaliquot תאי החיידקים (~ 1 מיליליטר aliquots) ל1.7 מיליליטר צינורות microcentrifuge. שים לב שלא יהיו 5 צינורות microcentrifuge לדגימה.
  6. ספין למטה צינורות microcentrifuge ב10,000 XG במשך 10 דקות, ולהסיר את רוב supernatant עד ~ 200 סימן μl.
  7. אחסן את הדגימות ב -80 ° C, או להמשיך כדי לחלץ DNA חיידקים באמצעות ערכת בידוד DNA זמינה מסחרי בהתאם להוראות היצרן. במהלך שימוש בקטריאלי מיצוי DNA או PBS או מים כביקורת שלילית חילוץ, וא coli כביקורת חיובית חילוץ.
  8. בגלל DNA מצינורות מרובים חילוץ, בריכה תת-aliquots המקביל מהמדגם זהה לצינור 2 מיליליטר אחד. לאחר מכן לערוך O / N ממטרים באמצעות פתרון מורכב מ0.1כרכים של 3 אצטט M נתרן, 2 כרכים של 100% אתנול, ו -5 μl של 5 מיקרוגרם / acrylamide יניארי μl. מערבבים היטב ודגימות חנות ב -80 מעלות צלזיוס.
  9. צנטריפוגה במהירות המרבית (17,000 XG) במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לשטוף גלולה עם 1 מיליליטר של אתנול קר כקרח 70%, אוויר יבש בארון בטיחות ביולוגי לשום גלולה DNA דקות יותר מ 5 וגלול בμl 34 של 10 מ"מ טריס-Cl, pH 8.5.
    הערה: acrylamide ינארית תעזור לדמיין גלולה DNA לאחר O / הממטרים N.
  10. לקבוע כמות ה- DNA ואיכות באמצעות רגישות גבוהה assay quantitation חומצות גרעין הניאון וספקטרופוטומטר microvolume, בהתאמה, בעקבות הוראות היצרנים (ראה טבלה של חומרים).
    הערה: אם דוגמאות רבות מוכנות בזמן, assay הרגיש ביותר ניאון חומצות גרעין לכימות dsDNA וfluorometer / ספקטרופוטומטר פלייט מבוסס ניתן להשתמש במקום.

3. DNA ספריית הכנה

  1. נרמל DNA חיידקים הגנומי שחולץ מן דגימות מים לריכוז של 0.2 ~ ng / μl.
  2. ננוגרם אנזימי בר אחד של DNA חיידקים באמצעות שיטה המבוססת על transposon (tagmentation). להוסיף רצפי מתאם ומדד על DNA מקוטע הבאים הוראות היצרן. נושא tagmented דגימות עד 12 מחזורים של PCR כפי שצוין בהוראות היצרן, ובשלב זה מדדי הרצף משולבים.

בחירת גודל 4. האוטומטי ג'ל

  1. דלג על שלב ניקוי סטנדרטי פוסט-PCR המתואר בהוראות היצרן (ראה טבלה של חומרים). דגימות שלאחר PCR בחרו גודל ישירות באמצעות פלטפורמת בחירת גודל מבוסס ג'ל אוטומטי.
    1. להוסיף 3.5 μl של חיץ טעינה לכל דגימה.
    2. בעקבות הפרוטוקול של היצרן, לטעון את הדגימות על תחנת העבודה אלקטרופורזה, המפרט יעד גודל בחירה של 500-800 נקודות בסיס, בתמצית 300 μlיון נפח, באמצעות 1.5% קלטת agarose יצוקים מראש.
    3. לרכז את חומר גלם הפלט (300 μl) עד 25 μl באמצעות משקעים אתנול.
      הערה: לחלופין, להשתמש בתחנת העבודה אלקטרופורזה כדי להפוך ריכוז למספרים גדולים יותר של דגימות באמצעות צלחת מסנן וסעפת ואקום.
      1. לזרז גלם באמצעות 0.1 כרכים של 3 אצטט M נתרן, 2 כרכים של 100% אתנול ו 5 μl של 5 מיקרוגרם / acrylamide יניארי μl נפח elution. מערבבים היטב, דגימות מקום ב -80 CO ° / N. צנטריפוגה דגימות 17,000 XG למשך 30 דקות.
      2. בטל supernatants ולהמשיך לשטוף גלולה DNA עם 1 מיליליטר של אתנול 70% קרים כקרח.
      3. צנטריפוגה דגימות שוב ב17,000 XG למשך 30 דקות, להשליך supernatants, אוויר יבש, ולבסוף resuspend גלולה DNA ב -25 μl של 10 מ"מ טריס-Cl, pH 8.5.
  2. (אופציונאלי) μl 1 של ספריות DNA גודל שנבחר עם פלטפורמת בחירת גודל ג'ל האוטומטית השתמש לעשות חמשדילול -fold באמצעות פתרון חיץ טריס-EDTA, pH 8.0. לנתח ספריות באמצעות מכשיר אלקטרופורזה נימים מבוסס שבב לנתח איכות dsDNA על פי הוראות יצרן.

5. ספריית נורמליזציה ורצף

  1. המשך לנרמל דגימות באמצעות חרוזים ספריית נורמליזציה (כלולים בערכת הכנת ספרייה מבוססת transposon) כפי שמתואר במדריך להכנה של היצרן.
    1. לחלופין, למדוד ספריות dsDNA באמצעות assay רגישות גבוהה ניאון גרעין quantitation החומצה, ואחרי איגום ביחסי equimolar להגיע ריכוז dsDNA סופי של 2 ננומטר. המשך לפגל ספריות באמצעות 10 μl של ספריות ונקוו ו -10 μl של 0.2 N NaOH, דגירה של 5 דקות על RT. לדלל ספריות מפוגלים באמצעות מאגר הכלאה (כלול בערכת ההכנה מבוססת transposon) לנפח סופי של 1 מיליליטר וריכוז של 11.5 בערב.
  2. טען מדגםים בפלטפורמת רצף של הדור הבא על ידי ביצוע פרוטוקולי הרצף הסטנדרטי של היצרן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ריכוז ה- DNA, והערכת איכות

ריכוזי DNA חיידקים נעו 0.01-0.11 ng ​​/ ml לדגימה מים של אתרי פרשת מים השונים (טבלה 1). DNA מבודד מחלק חיידקים היה 260/280 ו260/230 יחסים של 1.4-1.8 ו0.3-1.6, בהתאמה. בעוד שחלק מ260/230 היחסים היו נמוך יחסית, אין עיכוב ניכר נצפה בספרייה מוכנה ויישומים במורד הזרם אחרים. יישומים אלה כללו PCR וqPCR בדיקות מיקוד rRNA 16S וCPN ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הנוכחות של הדימרים מתאם ואשכולות של גדלים להכניס קטנים מעדיפים להיות רצף בפלטפורמות הנוכחיות מייצגת ירידה בתשואות שמישים ותת-ביצוע ביכולתו של הציוד 15. השימוש בשיטות מכות חרוז בשילוב עם גישה מבוססת transposon להכין ספריות עלול לגרום ליותר גז DNA בהשוואה לשיטות אחרות של 4,5 חילוץ. עם זאת, כל השיטות של הכנת מיצוי וספריית פוטנציאל להציג את ההטיות לחלוקת הרצף קוראת 8,16. תצפיות ניסיוניות באמצעות פלטפורמה אוטומטית גרעין חילוץ חומצה, בשילוב עם שיטה המבוס...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

ג'ארד ר 'סלובודן ומתיו ג' נסביט הן להחזיק במניות של החוף Genomics, תאגיד קולומביה הבריטית בבעלות פרטית המציע את הטכנולוגיה Ranger.

תודות

עבודה זו מומנה על ידי Genome BC, Genome Canada ו-Coastal Genomics. המחברים מודים לקירבי קרונין ומייקל צ'אן על עזרתם באיסוף ועיבוד הדגימות. ברצוננו גם להודות לתיאה ואן רוסום ולד"ר פיונה ברינקמן על הסיוע בביואינפורמטיקה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
משאבה פריסטלטית Masterflex P/S 1400 SeriesThermo Scientific 1400-1620
0.2 ומיקרו; m Supor MembraneVWRCA28143-969Pall Corporation, Ann Harbor, MI
חרוזי טונגסטן קרביד 3 מ"מ (200)Qiagen69997
איזופרופיל אלכוהול 70%Jedmon Products825751Healthcare Plus
DNA awayVWR7010Molecular BioProducts, Inc. סן דייגו, קליפורניה
מערכת טיהור מים Milli-Qפישר סיינטיפיקZMQS6VF0Yמרק מיליפור. מערכת זו הופסקה.
20x PBS pH 7.5VWRE703-1LAmresco, Inc., Solon, OH
Tween 20Fisher ScientificBP337-100Fisher
כימיקלים מתאם מערבולת ל -2 (50  ml) צינורותVWR13000-V1-50MoBio, Carlsbad, CA
Vortex-Genie 2, 120  V (דגם G560)VWRSI-0236Scientific Industries, Inc.
בקמן צנטריפוגהRaeyco מעבדת ציוד ניהול מערכות בע"מדגם J-6B
PowerLyzer Powersoil ערכת בידוד DNAVWR12855-100MoBio, Carlsbad, CA
מתאם מערבולת ל-24 צינורות (1.5-2 מ"ל)VWR13000-V1-24MoBio, Carlsbad, CA
Microfuge 18 צנטריפוגהבקמן קולטר367160
Nimbus Select תחנת עבודה עם Ranger TechnologyHamilton Robotics92720-01כולל את תחנת העבודה לטיפול בנוזלים וערכת ריאגנטים משולבת של Ranger Tech (חומרת אלקטרופורזה)
RangerGenomicsCG-10600-150-12-21כולל מאגר טעינה וקלטות
אלכוהול אתילי (נטול מים)אלכוהול מסחריP016EAANGreenfield אתנול
נתרן אצטטSigma-AldrichS2889-250G
אקרילאמיד ליניארי (5  מ"ג/מ"ל)Life TechnologiesAM9520אמביון
אפנדורף צנטריפוגה בקירורRaeyco Lab Equipment Systems Management Ltd.5417R
Buffer EB (250 מ"ל)Qiagen19086
NanoDrop 1000 ספקטרופוטומטרThermo ScientificND-1000
Qubit פלואורומטרLife TechnologiesQ32857Invitrogen. מוצר זה הופסק.
ערכת בדיקת Qubit dsDNA HSLife TechnologiesQ32854Invitrogen
מגיב DNA רגישות גבוההAgilent Technologies5067-4626
שבבי DNA רגישות גבוההAgilent Technologies5067-4626
Agilent 2011 BioanalyzerAgilent TechnologiesG2938B
Nextera XT ערכת הכנת דגימותDNA IlluminaFC-131-1024
ערכת אינדקס Nextera XTIlluminaFC-131-1001
ערכת ריאגנטים MiSeq v2 (500 מחזורים)IlluminaMS-102-2003
מערכת MiseqIlluminaSY-410-1003

מקורות

  1. Siuda, W., Chrost, R. J. Concentration and susceptibility of dissolved DNA for enzyme degradation in lake water - some methodological remarks. Aquatic Microbial Ecology. 21, 195-201 (2000).
  2. Butler, J. M., Hill, C. R. Scientific Issues with Analysis of Low Amounts of DNA. , Available from: http://www.promega.ca/resources/profiles-in-dna/2010/scientific-issues-with-analysis-of-low-amounts-of-dna (2010).
  3. Ficetola, G. F., Miaud, C., Pompanon, F., Taberlet, P. Species detection using environmental DNA from water samples. Biology letters. 4, 423-425 (2008).
  4. Liles, M. R., et al. Recovery, purification, and cloning of high-molecular-weight DNA from soil microorganisms. Applied and environmental microbiology. 74, 3302-3305 (2008).
  5. Bey, B. S., Fichot, E. B., Dayama, G., Decho, A. W., Norman, R. S. Extraction of high molecular weight DNA from microbial mats. BioTechniques. 49, 631-640 (2010).
  6. Tebbe, C. C., Vahjen, W. Interference of humic acids and DNA extracted directly from soil in detection and transformation of recombinant DNA from bacteria and a yeast. Applied and environmental microbiology. 59, 2657-2665 (1993).
  7. Solonenko, S. A., et al. Sequencing platform and library preparation choices impact viral metagenomes. BMC genomics. 14, 320(2013).
  8. Aird, D., et al. Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries. Genome biology. 12, R18(2011).
  9. Quail, M. A., Swerdlow, H., Turner, D. J., et al. Improved protocols for the illumina genome analyzer sequencing system. Current protocols in human genetics / editorial board, Jonathan L. Haines .. [et al.]. 18, 18(2009).
  10. Head, S. R., et al. Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges. BioTechniques. 56, 61-64, 66, 68 (2014).
  11. Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias. Experimental cell research. 322, 12-20 (2014).
  12. Grunenwald, H., Baas, B., Caruccio, N., Syed, F. Rapid, high-throughput library preparation for next-generation sequencing. Nature Methods. 7, (2010).
  13. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning : a laboratory manual. , 3rd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (2001).
  14. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of visualized experiments. , (2012).
  15. Quail, M. A., et al. A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system. Nature methods. 5, 1005-1010 (2008).
  16. Marine, R., et al. Evaluation of a transposase protocol for rapid generation of shotgun high-throughput sequencing libraries from nanogram quantities of DNA. Applied and environmental microbiology. 77, 8071-8079 (2011).
  17. Rohland, N., Reich, D. Cost-effective high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome research. 22, 939-946 (2012).
  18. Lamble, S., et al. Improved workflows for high throughput library preparation using the transposome-based nextera system. Bmc Biotechnology. 13, (2013).
  19. Picelli, S., et al. Tn5 transposase and tagmentation procedures for massively scaled sequencing projects. Genome research. , (2014).
  20. Rhodes, J., Beale, M. A., Fisher, M. C. Illuminating Choices for Library Prep: A Comparison of Library Preparation Methods for Whole Genome Sequencing of Cryptococcus neoformans Using Illumina HiSeq. PloS One. 9, e113501(2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

DNARangerDNA500 800 bp

מאמרים קשורים