בפרוטוקול הבא, אנו מתארים דרך פשוטה מאוד לבודד את מלכודות נויטרופילים תאיות (רשתות) מכל דם אנושי באמצעות ריאגנטים זמינים. לאחר מכן, אנו מדגימים כיצד ניתן להשתמש ברשתות המבודדות בassay הידבקות במבחנה עם תאים סרטניים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
פשוטה מלכודות תאיות נויטרופילים אדם בידוד (רשתות) וטיפול
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
מלכודות נויטרופילים התאיות (רשתות) זוהו לאחרונה כחלק מארסנל מיקרוביאלית של נויטרופילים. מלבד תפקידם במלחמה בזיהומים, מחקר שנעשה לאחרונה הראה כי הם עשויים להיות מעורבים בתהליכים רבים מחלה אחרות, ובכלל זה התקדמות הסרטן. בידוד רשתות מטוהרים הוא אלמנט חיוני כדי לאפשר המחקר של פונקציות אלה.
בסרטון הזה, אנחנו מדגימים שיטה פשוטה של בידוד NET תא מתוך כל דם אנושי באמצעות ריאגנטים זמינים. רשתות מבודדות לאחר מכן ניתן להשתמש עבור מכתים immunofluorescence, סופג או מבחני תפקודיים שונים. זה מאפשר הערכה של הנכסים הביולוגיים שלהם בהעדר תופעות של בלבול הפוטנציאליות של נויטרופילים עצמם.
טכניקת הפרדת שיפוע צפיפות מועסקת לבודד נויטרופילים מכל דם תורם בריא. אז נויטרופילים מבודדים מומרצים ע"י phorbol 12 myr13-אצטט istate (PMA) כדי לגרום לNETosis. אז נויטרופילים הופעל מבוטלים, ומניית NET-תא ללא מתקבלת.
לאחר מכן, אנו מדגימים כיצד מבודדים רשתות ניתן להשתמש בassay הידבקות עם תאי סרטן הריאות אנושיים A549. מניית NET משמשת למעייל הבארות של 96 O צלחת תרבית תאים היטב / תאי A549 N, ולאחר הבטחת היווצרות monolayer NET נאותה בחלק התחתון של הבארות, שכותרתו CFSE מתווספות. תאים חסיד הם לכמת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי Nikon TE300. בחלק מהבארות, 1000U DNAse1 מתווסף 10 דקות לפני הספירה להשפיל רשתות
מבוא
מלכודות תאי נויטרופילים (רשתות) הם שהתגלו לאחרונה אלמנטים הנגזרים נויטרופילים מורכבים מגדילי הדנ"א תאי מעוצבים על ידי מאות חלבונים וההיסטונים. הם מופרשים על ידי נויטרופילים בהקשר של זיהום ודלקת בעקבות גירויים מסוימים והם הוכרו בתחילה להיות חלק ממנגנוני ההגנה של נויטרופילים מפני זיהומים. הם הוצגו לראשונה לקידום לכידה של פולשים חיידקים שונים, כוללים חיידקים, וירוסים ופטריות 1-3. לכידתו של החיידק היה אז להוביל להרס שלו הן באופן ישיר על ידי החלבונים הקשורים NET 3,4 ובעקיפין באמצעות גיוס המקומי של תאי phagocytic 5,6. התפקיד של רשתות עם זאת נראה שלא יהיה מוגבל לארח הגנה. לאחרונה, הם הוכחו לשחק תפקיד ח....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: כל הניסויים נערכו בהתאם להנחיות אתיות מוסדיות מקומיות.
ציור 1. דם
- דרך venipucture antecubital, לאסוף 14 צינורות דם ממתנדב בריאה לראש ירוק צינורות (heparinized) ולהפוך כל צינור לפני שהתיישב על קרח. איסוף דם בתוך 10 - 15 דקות של ניסוי כדי להבטיח תשואת נויטרופילים אופטימלית.
2. בידוד נויטרופילים מדם מלא
- ל....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הישג מוצלח של assay הידבקות סטטית עם רשתות דורש ציפוי נאות של הבארות עם monolayer של רשתות לפני התוספת של תאים סרטניים (איור 1). כל הצעדים הבאים חייבים להיעשות בזהירות שלא לפגוע בשכבה ש. כאשר שכבה נאותה של רשתות נוצר, הוא צפוי לראות הידבקות תאים סרטניים משמעותית לרשתות כפי שניתן לראות באיור 2 א ו2C. השפעה זו בוטלה על ידי התוספת של DNAse1, אשר מדרדרת רשתות כפי שניתן לראות ב2B דמויות ו2D. לעומת זאת, לא צריך להיות שום ירידה משמעותית .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול בידוד מלכודת נויטרופילים התאי הפגין בסרטון זה משלב טכניקות שונות המשמשות בספרות לבידוד נויטרופילים והיווצרות NET. זה מפשט את תהליך מורכב למדי ומשתנה ומציע דרך אמינה מאוד ושכפול לבודד את רשתות תא ללא מטוהרים עם פחות שלבים מאשר פרוטוקולים אחרים. יתר על כן, חומרים כימיים זמינים מועסקים הוספה לפשטות הפרוטוקולים והפחתת עלותו באופן משמעותי. היישום של רשתות כלפי assay הידבקות סטטית משמש כדי להדגים את הגמישות המוענקת על ידי טכניקת הבידוד הזה, כמו ריכוז NET יכול בקלות לטפל כדי שית.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
יש לי המחברים אין לחשוף
תודות
המחברים מבקשים להודות לד"ר פול קובס על ההדרכה וההדרכה שלו שהיו מרכזיים בבניית עבודה זו.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| דולבקו s תמיסת מלח פוספט בופר (PBS), מעובד, ללא סידן כלורי ומגנזיום כלוריד | Wisent | 311-425-CL | |
| מדיום הפרדת לימפוציטים (LSM) | Wisent | 305-010-CL | |
| דקסטרן הידרוכלוריד (אבקה) | ספקטרום | DE130 | תמיסת דקסטרן 6% מיוצרת על ידי תוספת PBS עם Ca ו-Mg עם אבקת דקסטרן 6% |
| RPMI-1640 בינוני עם L-גלוטמין | Wisent | תמיסת 350-000-CL | 3% RPMI מיוצרת על ידי תוספת RPMI עם 3% סרום בקר עוברי |
| BD פארם ליז מאגר ליסינג | BD Biosciences | 555899 | |
| פורבול 12-מיריסטאט 13-אצטט (PMA) | סיגמא-אלרדיך | P8139 | |
| DNAse1 | Roche | 11284932001 | |
| F12 DMEM | Wisent | 319-075-CL | |
| סרום בקר עוברי (FBS) | Wisent | 080-150 | |
| פניצילין/סטרפטומיצין | Gibco | 15140-122 | |
| CFSE | Invitrogen | C1157 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| צלחת תרבית רקמה אינטגריד עם רשת 20 מ"מ (150 x 25 מ"מ) | Falcon | 353025 |
מקורות
- Saitoh, T., et al. Neutrophil extracellular traps mediate a host defense response to human immunodeficiency virus-1. Cell Host Microbe. 12 (1), 109-116 (2012).
- Bruns, S., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
