הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

שיטה אנזימתי להציל תאי גזע mesenchymal מדוגמאות קרשו מח העצם

9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/52694

⸱

12 באפריל 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Swiss Paraplegic Research, 2Orthopaedics and Spinal Surgery, Swiss Paraplegic Centre, 3Department of Neurosurgery, Lucerne Cantonal Hospital (LUKS), 4Section of Small Animal Surgery/Neurology, Vetsuisse Faculty, University of Zurich

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

תאי גזע מזנכימליים מתקבלים בדרך כלל ממח עצם ודורשים תרבית הרחבה. כאשר דגימות נקרשות לפני העיבוד, ניתן ליישם פרוטוקול המשתמש בתרופה הטרומבוליטית (האנזימטית) אורוקינאז כדי לפרק את הקריש. לפיכך, תאים משתחררים וזמינים לתרבית הרחבה. פרוטוקול זה מספק אלטרנטיבה מהירה וזולה לדגימה מחדש.

תקציר

תאי גזע מזנכימליים (MSCs) - המתקבלים בדרך כלל ממח עצם - דורשים לעתים קרובות תרבית הרחבה. הפרוטוקול שלנו משתמש באורוקינאז בדרגה קלינית כדי לפרק קרישים במח העצם ולשחרר MSCs לשימוש נוסף. פרוטוקול זה מספק חלופה מהירה וזולה לדגימה מחדש של מח עצם. מח עצם הוא מקור עיקרי ל-MSCs, המעניינים להנדסת רקמות וטיפולים בתאי גזע אוטולוגיים. עם הגמילה מח העצם עלול להיקרש, מכיוון שהוא כולל את כל המערכת ההמטופויאטית. הקרישים המתקבלים מכילים גם MSCs שאבדו לצורך תרבית הרחבה או טיפול ישיר בתאי גזע. חווינו ש-74% מדגימות מח העצם של הכלבים הכילו קרישי דם והניבו פחות ממחצית ממספר תאי הגזע הצפוי מדגימות לא קרושות. לפיכך, פיתחנו פרוטוקול לעיכול אנזימטי של הקרישים האלה כדי למנוע דגימה מחדש של מח עצם אינטנסיבי ויקר. אורוקינאז - תרופה טרומבוליטית מאושרת קלינית וזמינה - מנקה את קרישי מח העצם כמעט לחלוטין. כתוצאה מכך, שאיבות מח עצם מטופלות מניבות מספרים דומים של MSCs כמו דגימות לא קרושות. כמו כן, לאחר הטיפול באורוקינאז התאים שמרו על פעילותם המטבולית ועל יכולתם להתמיין לשושלות כונדרוגניות, אוסטאוגניות ואדיפוגניות. הפרוטוקול שלנו מציל דגימות דם ומח עצם קרושות מבלי להשפיע על איכות התאים. זה מיישן דגימה מחדש, מפחית במידה ניכרת את עלויות הדגימה ומאפשר שימוש בדגימות קרושות למחקר או לטיפול.

מבוא

תאי גזע mesenchymal (MSCs) לשחק תפקיד מרכזי ברפואת רגנרטיבית והנדסת רקמות. הם יכולים להגר, להתמיין לסוגי תאים שונים 1 ונקלט, אשר הופך אותם למועמדים אידיאליים עבור טיפולי אוטולוגי 2,3. בזמן האחרון, ניסויים קליניים באמצעות MSCs לתיקון עצם וסחוס, שתל לעומת מחלה מארח או מחלת לב הושקו 4. ניתן לקצור MSCs אלה מרקמת חוט או שומן הטבור אבל תוצאות המבטיחות ביותר התקבלו מתאי גזע שמקורם במח עצם 5.

רכס הכסל מאפשר לאסוף כמות ניכרת של מח עצם ולכן משמש כאתר עיקרי של שאיפה 6. עם זאת, איכות לשאוב יורדת עם עלייה בנפח של מח עצם נסוג. בעוד 5 מיליליטר הראשון של לשאוב מח עצם מכיל תאי גזע באיכות גבוהה, נסיגה של נפחים גדולים יותר מובילה לדילול של לשאוב עם f דם ההיקפיROM עצם כלי הדם מאוד 7. בגלל megakaryocytes וטסיות הדם הנוכחיים, aspirates מח עצם נוטה קרישה, תרופות נגד קרישת דם, אלא אם כן נמצאים בשימוש. אבל אפילו עם תרופות נגד קרישת דם, קרישים עלולים להתרחש.

במח עצם, תאי גזע מייצגים רק חלק קטן מבריכת התא הכוללת 8 וצריכים להיות מורחב בתרבות עבור רוב הנדסת רקמות או יישומים טיפוליים 4. האיכות של תרבות כזו תלויה במידה רבה בברכת התא הראשונית, כלומר., גיוון ומוצא גבוה מספר 9. מספרים נמוכים של תאי גזע מנסיגות יכולים להיות מוסברים בחלקו על ידי השתנות תורם. מצד השני, MSCs מדגימות באיכות נמוכות דורש זמן רב יותר בתרבות ובpassaging הוארך להגיע למספר הרצוי של תאים. בכל מקרה, passaging המורחב הוא מקור להזדקנות תא ויכול להוביל לאובדן של בידול פוטנציאל 10. לכן, מותאם פרוטוקולים שיכולים למקסם y תאIELD ולמנוע מהשפעות מזיקות צריכה להיות מפותחות 11,12.

כשהתחלנו לעבוד עם MSCs כלבים, שהיינו נדהמתי לראות שעל שלושה בארבע דגימות מח עצם כלבי קרישים, ואילו דגימות קורשים למרבה המזל אדם (אחד מכל עשר) היו שכיחות פחות. מצד השני זה לא היה מפתיע, שנצפינו תשואות נמוכות בהרבה של תאי גזע מדגימות שנקרשו. כדי לפתור את הבעיה החוזרת של דגימות קורשים, שפיתחנו הפרוטוקול באמצעות האוריקינאז תרופת thrombolytic במקום דגימה מחדש.

טיפולים הטרומבוליטיות יכולים לנטרל מצבי מסכני חיים כגון חסימה של כלי דם גורמים התקף לב, שבץ או תסחיפים בגלל קרישה לא רצויה. הם עובדים על ידי פירוק של קרישים דרך מחשוף האנזימטית של הפיברין על ידי מפעילי פלסמין ופלסמינוגן האנזימטית. למרות השימוש הרחב לטיפול בחולים, רק מעט מאוד פרסומים קיימים שפעילות thrombolytic מנוצלתעבור יישומי מעבדה כדי להציל דגימות קורשות, בעיקר מתמקד לימפוציטים. בשינה 1987, Niku et al. תיארתי את השימוש בstreptokinase להמסת קרישי דם וכתוצאה מכך לימפוציטים תפקודיים 13 וארבע שנים מאוחר יותר, De Vis et al. הרחיב את השימוש בstreptokinase לבודד תאי סרטן דם מהדם ומח עצם עבור יישומי הזרימה cytometric 14. פרסום האחרון יותר מצביע על השימוש בAlteplase לאבחון הסרטן 15. תוך שימוש באותה הגישה האנזימטית, הפרוטוקול שלנו מתמקד בבידוד של מח עצם צורת multipotent MSCs לספק כלי לחוקרים בתחום תאי גזע.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: aspirates מח עצם אנושי מפסגת הכסל נאסף ממתורמים באישור ועדת האתיקה של לוצרן. aspirates מח עצם לכלבים מפסגת הכסל נאסף עם consent.Human של בעל כלב (כ. 20 מיליליטר) וכלבים (כ. 10 מיליליטר) aspirates מח עצם היו אנטי-קרוש על ידי תוספת של 15 מיליליטר של 3.8% נתרן ציטרט מייד לאחר נסיגה בחדר הניתוח. הדגימות הועברו לסביבת המעבדה לעיבוד באותו היום כמו נסוג.

1. הכנת האוריקינאז (לפני 1 st שימוש)

  1. מחדש האוריקינאז באמצעות תמיסת מלח סטרילית פוספט (PBS) על פי הוראות היצרן: הוסף 10 מיליליטר PBS לבקבוק המחיצה-כניסה באמצעות מזרק 10 מיליליטר. להמס את החומר היבש על ידי מתערבל להשיג 50,000 יחידות הזרקה (U) לכל מיליליטר.
  2. הכן 500 aliquots μl (25,000 U כל אחת) ליםצינורות terile. חנות aliquots -20 ° C ולהשתמש בו בעת צורך במשך לפחות 6 חודשים.

2. שלבי הכנה של (לפני כל מח עצם טיפול)

  1. להפשיר aliquot של האוריקינאז אחד (25,000 U) ללשאוב מח עצם קורש (כרכים לשאוב עד 25 מיליליטר טופלו בהצלחה באמצעות aliquot יחיד של 25,000 U).
  2. מחממים מים באמבטיה או רועד חממה עד 37 מעלות צלזיוס.

3. אנזימתי Digest של קריש

  1. לבצע את כל העבודה בממשלת זרימה למינרית בטיחות ביולוגית כדי למנוע זיהום חיידקים של דגימות מח העצם במהלך עיבוד. כאשר עובדים עם חומר אנושי שעלולים להיות מדבק, השימוש בכפפות מגן, כמו גם טיפול זהיר מומלצת.
  2. מניחים מסננת 100 מיקרומטר תא על גבי שפופרת 50 מיליליטר סטרילי. יוצקים בזהירות את לשאוב מח עצם דרך מסננת התא, הטיה המסננת או מסתובב חומר הקריש. השתמש טיפ pipet סטרילי לזרימה טובה יותר באמצעות רשת המסנן.
    הערה: הימנע מכל דילול של הקריש, למשל, על ידי שטיפת הקריש עם PBS. האוריקינאז פועל באופן עקיף ודורש מרכיבי הסרום (כלומר., פלסמינוגן) מהביופסיה לתקציר יעיל. תוך המשך התהליך עם חומר הקריש, התסנין יכול להיות כל הזמן בRT עד לשימוש נוסף בשלב 3.6.
  3. להעביר את חומר קריש מח עצם לתוך צלחת תרבית תאים ריקה באמצעות מלקחיים סטרילית. חותך את הפסולת לחתיכות קטנות של כ 2 מ"מ 3 באמצעות אזמל סטרילי.
  4. העבר את החתיכות הקטנות של הקריש לתוך צינור תגובה 50 מיליליטר באמצעות המלקחיים סטרילית. ודא שיש לו את הקריש הטחון מראה רטוב. אם זה נראה יבש, להשתמש בחלק מהתסנין מהצעד 3.1 כדי ללחלח.
  5. Triturate הקריש על ידי pipetting למעלה ולמטה במשך 5 פעמים באמצעות pipet microtiter 5 מיליליטר. להוסיף aliquot 1 של האוריקינאז למדגם. דגירה של 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס או באמבט מים או בחממה רועדת (בעדינות).
  6. Triturate ידי pipetting מעלה ומטה במשך 5 פעמים באמצעות pipet 5 מיליליטר. לבצע שלב זה בקבינט בטיחות ביולוגי. דגירה של 30 דקות נוספות על 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, triturate שוב 5 פעמים באמצעות pipet 5 מיליליטר. לעבור על מסננת תא 100 מיקרומטר טרי לברכה עם התסנין משלב 3.2.
  7. צנטריפוגה ההשעיה התא בטמפרטורת הסביבה של 10 דקות ב 500 x גרם. בטל supernatant. להשעות מחדש את התא גלולה בתקשורת כמפורט להלן או בהתאם לנוהל הסטנדרטי של המעבדה שלך לתרבות הרחבת MSC.

4. מתזמן תרבות תאי הרחבה וצלחות CFU

  1. Resuspend התאים (בהיקף של אריתרוציטים ותאי mononuclear) ב 50 מיליליטר של מדיום בסיסי: Alpha-ממ בתוספת 10% בסרום שור עוברי (FBS), 100 U / ml פניצילין, 100 מ"ג / מיליליטר סטרפטומיצין ו -2.5 מ"ג / מיליליטר amphotericin B . ספירת התאים 01:10 מדוללים בפתרון Trypan הכחול באמצעות chambe נויבאוארr.
  2. צלחת התאים בצלוחיות תרבית תאים בצפיפות של 5 x 10 7 תאים / 2 סנטימטר ודגירה בחממה humidified על 37 מעלות צלזיוס. אם זמין, להשתמש חוסר חמצן תנאים (5% חמצן). לשליטה assay CFU, צלחת 10 9 תאים בצלחת תרבית תאים של 10 סנטימטרים קוטר.
  3. לאחר 3 ימים של תרבות, תאי גזע mesenchymal מחוברים לצלחת תרבית תאים בזמן שתאים אחרים יישארו בהשעיה. לשנות את התקשורת עם מדיום בסיסי בתוספת 5 ng / ml גורם בסיסי צמיחת פיברובלסטים (bFGF). לשליטה assay CFU, טיפול בצלחת תרבית התאים באופן דומה.
  4. תמשיך תרבית תאים עבור הסכום כולל של 2 שבועות, החלפת מדיה שלוש פעמים בשבוע. אם תאים יעלו על 80% confluency, לפצל על ידי trypsinization. לשליטה assay CFU, להחליף את התקשורת באופן דומה, אך לא לפצל את התאים לקורס של השבועות.

5. Giemsa כתם לAssay CFU

  1. הכן 10 מיליליטר של Giemsa-פתרון לכל צלחת: דילאוטה פתרון המניות (7.6 גר '/ ליטר Giemsa בגליצרול: מתנול) 1:10 ב מים סטריליים (תמיד להכין דילול עבודה טרי).
  2. הסר את המדיה מצלחת תרבית תאים ולשטוף את התאים עם PBS. להיות מאוד precautious בעת החלת נוזל לצלחת פטרי ולהימנע משטיפה מהתאים.
  3. תקן תאים במתנול הטהור במשך 5 דקות בRT. מחק את מתנול. הוסף את Giemsa-הפתרון ודגירה של 60 דקות בחממה humidified על 37 מעלות צלזיוס.
  4. לשטוף פעמיים עם PBS. אוויר יבש ראש הצלחת ראשון על מגבת נייר. ספירת המושבות באופן ידני. זו מושגת הטובה ביותר באמצעות עט סימון על גביו של הצלחת.

6. בידול MSC

  1. בידול MSCs כלבים
    הערה: MSCs כלבים הובדל לchondrogenic, osteogenic ושושלות adipogenic על ידי גירוי עם המדיה המתאימה לארבעה שבועות.
  2. ל בידול Adipogenic, MSCs התרבות בmonolayer ב 4 x 10 5 ceLLS / 2 סנטימטר לסירוגין שני תנאי תרבות שונים כדלקמן;
    1. תרבות בתקשורת תחזוקת adipogenesis מכילה DMEM + Glutamax, FBS 3%, 100 יחידות / מיליליטר פניצילין, 100 מ"ג / מיליליטר סטרפטומיצין, 2.5 מיקרוגרם / מיליליטר amphotericin B ו -170 מ"מ אינסולין.
    2. תרבות בתקשורת גרימת adipogenesis עם מדיום תחזוקה בתוספת FBS 3%, 5% בסרום ארנבת, dexamethasone 1 מיקרומטר, 500 מיקרומטר 3-isobutyl-1-methylxanthine, 33 מיקרומטר ביוטין, 5 מיקרומטר rosiglitazone ו -17 מיקרומטר pantothenate 16.
    3. להתענג טיפות שומנים על ידי צביעה עם השמן האדום-O. בקצרה, לתקן תאים עם פורמלדהיד 10%, לשטוף עם PBS ואת הכתם עם O האדום נפט 0.35% בisopropanol.
  3. לתרבות בידול osteogenic MSCs בmonolayer בשעה 7 x 10 3 תאים / 2 סנטימטר ולעורר בפעולות הבאות:
    1. מתקדם DMEM (GIBCO) + Glutamax, FBS 5%, 100 יחידות / מיליליטר פניצילין, 100 מ"ג / מיליליטר סטרפטומיצין, 2.5 מיקרוגרם / מיליליטר amphotericin B, 501; חומצה אסקורבית L-M 2-פוספט, 10 SS-glycerophosphate מ"מ ו -100 ננומטר dexamethasone.
    2. זהה את פיקדונות מינרליזציה על ידי כתם פון Kossa (5% אגנו 3). בקצרה, לתקן את התאים עם פורמלדהיד 10%, לשטוף עם PBS ואת כתם עם 5% אגנו 3 במים מזוקקים.
  4. בידול Chondrogenic
    1. קוביות Cut (3 מ"מ לכל צד) מהתקן רפואי ספוג בצורה, היוו מאני lyophilized סוג קולגן, ומשמשות כחומר פיגום לתמוך תאים 17.
    2. MSCs זרע בחלק העליון של הקוביות בריכוז של 4 x 10 6 תאים / מיליליטר (~ 70,000 תאים / קובייה).
    3. לפני התוספת של תקשורת, לאפשר לתאים לדבוק בקוביות למשך 30 דקות.
    4. לשמור על מבני MSC-קולגן בתקשורת chondrogenic בהיקף של DMEM / F12 + Glutamax, FBS 2.5%, 100 יחידות / מיליליטר פניצילין, 100 מ"ג / מיליליטר סטרפטומיצין, 2.5 מיקרוגרם / מיליליטר amphotericin B, 40 ng / ml dexamethasone, 50 מיקרוגרם / מיליליטר אסקורבית החומצה 2-פוספט,50 מיקרוגרם L-פרולין / מיליליטר, 1x אינסולין-transferrin-סלניום X, ו- 10 ng / ml הפיכת גורם-β1 צמיחה.
    5. השתמש בכתמי כחולי alcian לדמיין הצטברות של proteoglycans בסעיפי מבנים. בקצרה, להכתים את החלקים O / N עם 0.4% הכחולים alcian מומסים בH 0.01% 2 SO 4 ו0.5m hydrochloride guanidine. בשלב הבא, לשטוף את החלקים נשטפו למשך 30 דקות ב -40% DMSO ו0.05M MgCl 2. תאים היו counterstained עם אדום מהיר גרעיני.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

העובדות כי 74% מהדגימות מח עצם כלבים (n = 54) הכילו קרישים כאשר הם הגיעו למעבדה (איור 1 א) זה יחד עם ירידה בתשואות MSC מדגימות אלה, גרמו לנו להאמין שמספר לא מבוטל של MSCs היה לכוד בתוך קרישים . ואכן, DAPI כתם פשוט של חומר קריש מחולק מאשר את הנוכחות של תאי בעלי גרעין בצפיפות גבוהה (איור 1). זה סופו של דבר מוביל למספרים נמוכים של תאי גזע זמינים לתרבות התרחבות, אשר מופעלים עלינו לפתח את הפרוטוקול באמצעות האוריקינאז. בדרך כלל קרישים נעלמים כמעט לחלוטי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

באופן שגרתי אנו דוגמים מח עצם בזמן שהמטופל עובר ניתוח (במקרה שלנו בעיקר ניתוח בעמוד השדרה), עם היתרון שיש לו רק קצת עבודה נוספת שבוצעה על ידי אנשים בחדר הניתוח. למרות שהדגימות מעורבבות עם נתרן ציטרט מייד לאחר נסיגה, דגימות רבות היו קרשו באופן חלקי, כאשר הם הגיעו למעבדה לעיבוד. בשלב זה, דגימה מחדש להחליף דגימות קרושנה תהיה התערבות נוספת נפרדת שחייב שוב הרדמה מקומית או כללית 6. זה מחייב את נכונותם של שני אנשי צוות הקליניים והתורם לתרום וצורכת הרבה משאבים 21.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענק הקרן הלאומית השוויצרית CR3I3_140717/1 והקרן השוויצרית לשיתוק.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
רכיבים בינוניים
PenStrep 100XGibco15140122
אנושי FGF-basicPeprotech100-18B
MEM אלפא עם נוקלאוזיד, עם גלוטמין יציבAmimed1-23S50-I
FBS מומתחום Amimed2-01F36-I
אמפוטריצין BApplichemA1907
רכיבים בינוניים
DMEM-HAM F12 + GlutaMAXAmimed1-26F09-I
אינסולין סרום סיגמאI5500
ארנב Gibco16120099
DexamethasoneApplichemD4902
3-Isobutyl-1-methylxanthineSigmaI5879
ביוטין סיגמאB4639
רוזיגליטזון סיגמאR2408
פנטותנט SigmaP5155
שמן אדום-O SigmaO0625
בינוניים אוסטאוגניים
חומצה L-אסקורבית 2-פוספטSigmaA8960
ß-גליצרופוספטSigmaG9422
כסף חנקתי (AgNO3)SigmaS6506
רכיבים
Biopad - מכשיר רפואי בצורת ספוג Euroresearch
L-פרולין SigmaP5607
אינסולין-טרנספרין-סלניום XGibco51500056
גורם גדילה טרנספורמטיבי אנושי-ובטא; 1 Peprotech100-21
Alcian Blue 8GXSigmaA3157
גרעיני מהיר אדוםSigmaN8002
גנרי
Tri-נתרן ציטראט דיהידראטApplichemA3901
PBSApplichem964.9100
UrokinaseMedac1976826
0.5% טריפסין-EDTAGibco15400054
כתם GiemsaApplichemA0885
פורמלדהידApplichemA0877
חומצה גופרתית (H2SO4)ApplichemA0655
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)ApplichemA1584
מגנזיום כלוריד (MgCl2)ApplichemA3618
גואנידין הידרוכלורידApplichemA1499
חומרים
50 מ"ל צינור תגובהAxygenSCT-50ML-25-S
10 מ"ל מזרקבראון4606108V
מחט סטריקנית (22 גרם)בראון4657624
1.7 מ"ל מיקרו-צינורותBrunschwigMCT-175-C
100 μ מסננת תאיםm Falcon6.05935
מלקחיים סטרילייםBastos Viegas, SA489-001
אזמל סטריליצלחת
פרימריהFalcon353803
C-Chip Neubauer בקבוקBioswisstech505050
- בקבוק T300TPP90301
ציוד
ארון בטיחות ביולוגית מיקרוביולוגית Class II82011500סקאן
Memmert1305.0377
Stripettes פיפטה סרולוגית 5 מ"למיקרוסקופ קורנינג4487-200ea
אולימפוסCKX41
חממה לחה Heracells 240Thermo 51026331
מדעי Heraeus Multifuge 1S-RThermo Scientific75004331
בסיסייםאדיפוגנייםרכיבים בינוניים כונדרוגנייםמתכלים חיתוך תאים בראון 5518059 תרבית תאים משופר אמבט מים

מקורות

  1. Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).
  2. Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).
  3. Bartholomew, A., et al. Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo. Exp Hematol. 30 (1), 42-48 (2002).
  4. Wang, S., Qu, X., Zhao, R. C. Clinical applications of mesenchymal stem cells. J Hematol Oncol. 5, 19(2012).
  5. Baksh, D., Song, L., Tuan, R. S. Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. J Cell Mol Med. 8 (3), 301-316 (2004).
  6. Malempati, S., Joshi, S., Lai, S., Braner, D. A., Tegtmeyer, K. Videos in clinical medicine. Bone marrow aspiration and biopsy. N Engl J Med. 361 (15), e28(2009).
  7. Cuthbert, R., et al. Single-platform quality control assay to quantify multipotential stromal cells in bone marrow aspirates prior to bulk manufacture or direct therapeutic use. Cytotherapy. 14 (4), 431-440 (2012).
  8. Veyrat-Masson, R., et al. Mesenchymal content of fresh bone marrow: a proposed quality control method for cell therapy. Br J Haematol. 139 (2), 312-320 (2007).
  9. Lazarus, H. M., Haynesworth, S. E., Gerson, S. L., Rosenthal, N. S., Caplan, A. I. Ex vivo expansion and subsequent infusion of human bone marrow-derived stromal progenitor cells (mesenchymal progenitor cells): implications for therapeutic use. Bone Marrow Transplant. 16 (4), 557-564 (1995).
  10. Bertolo, A., et al. An in vitro expansion score for tissue-engineering applications with human bone marrow-derived mesenchymal stem cells. J Tissue Eng Regen Med. , (2013).
  11. Casiraghi, F., Remuzzi, G., Abbate, M., Perico, N. Multipotent mesenchymal stromal cell therapy and risk of malignancies. Stem Cell Rev. 9 (1), 65-79 (2013).
  12. Bonab, M. M., et al. Aging of mesenchymal stem cell in vitro. BMC Cell Biol. 7, 14(2006).
  13. Niku, S. D., Hoon, D. S., Cochran, A. J., Morton, D. L. Isolation of lymphocytes from clotted blood. J Immunol Methods. 105 (1), 9-14 (1987).
  14. De Vis, J., Renmans, W., Segers, E., Jochmans, K., De Waele, M. Flow cytometric immunophenotyping of leukemia cells in clotted blood and bone marrow. J Immunol Methods. 137 (2), 193-197 (1991).
  15. St Antoine, A., et al. Application of thrombolytic drugs on clotted blood and bone marrow specimens to generate usable cells for cytogenetic analyses. Arch Pathol Lab Med. 135 (7), 915-919 (2011).
  16. Kisiel, A. H., et al. Isolation, characterization, and in vitro proliferation of canine mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, muscle, and periosteum. Am J Vet Res. 73 (8), 1305-1317 (2012).
  17. Bertolo, A., et al. Influence of different commercial scaffolds on the in vitro differentiation of human mesenchymal stem cells to nucleus pulposus-like cells. Eur Spine J. 21, Suppl 6. S826-S838 (2012).
  18. Makridakis, M., Roubelakis, M. G., Vlahou, A. Stem cells: insights into the secretome. Biochim Biophys Acta. 1834 (11), 2380-2384 (2013).
  19. Benvenuti, S., et al. Rosiglitazone stimulates adipogenesis and decreases osteoblastogenesis in human mesenchymal stem cells. J Endocrinol Invest. 30 (9), RC26-RC30 (2007).
  20. Jaiswal, N., Haynesworth, S. E., Caplan, A. I., Bruder, S. P. Osteogenic differentiation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells in vitro. J Cell Biochem. 64 (2), 295-312 (1997).
  21. Patel, A. Tissue banking for research--bench to bedside and back--myth, reality or fast fading reality at the dawn of a personalised healthcare era. Cell Tissue Bank. 12 (1), 19-21 (2011).
  22. Smith, H. W., Marshall, C. J. Regulation of cell signalling by uPAR. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (1), 23-36 (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

CFU
שיטה אנזימתי להציל תאי גזע mesenchymal מדוגמאות קרשו מח העצם
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.