תאי גזע מזנכימליים מתקבלים בדרך כלל ממח עצם ודורשים תרבית הרחבה. כאשר דגימות נקרשות לפני העיבוד, ניתן ליישם פרוטוקול המשתמש בתרופה הטרומבוליטית (האנזימטית) אורוקינאז כדי לפרק את הקריש. לפיכך, תאים משתחררים וזמינים לתרבית הרחבה. פרוטוקול זה מספק אלטרנטיבה מהירה וזולה לדגימה מחדש.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
שיטה אנזימתי להציל תאי גזע mesenchymal מדוגמאות קרשו מח העצם
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
תאי גזע מזנכימליים (MSCs) - המתקבלים בדרך כלל ממח עצם - דורשים לעתים קרובות תרבית הרחבה. הפרוטוקול שלנו משתמש באורוקינאז בדרגה קלינית כדי לפרק קרישים במח העצם ולשחרר MSCs לשימוש נוסף. פרוטוקול זה מספק חלופה מהירה וזולה לדגימה מחדש של מח עצם. מח עצם הוא מקור עיקרי ל-MSCs, המעניינים להנדסת רקמות וטיפולים בתאי גזע אוטולוגיים. עם הגמילה מח העצם עלול להיקרש, מכיוון שהוא כולל את כל המערכת ההמטופויאטית. הקרישים המתקבלים מכילים גם MSCs שאבדו לצורך תרבית הרחבה או טיפול ישיר בתאי גזע. חווינו ש-74% מדגימות מח העצם של הכלבים הכילו קרישי דם והניבו פחות ממחצית ממספר תאי הגזע הצפוי מדגימות לא קרושות. לפיכך, פיתחנו פרוטוקול לעיכול אנזימטי של הקרישים האלה כדי למנוע דגימה מחדש של מח עצם אינטנסיבי ויקר. אורוקינאז - תרופה טרומבוליטית מאושרת קלינית וזמינה - מנקה את קרישי מח העצם כמעט לחלוטין. כתוצאה מכך, שאיבות מח עצם מטופלות מניבות מספרים דומים של MSCs כמו דגימות לא קרושות. כמו כן, לאחר הטיפול באורוקינאז התאים שמרו על פעילותם המטבולית ועל יכולתם להתמיין לשושלות כונדרוגניות, אוסטאוגניות ואדיפוגניות. הפרוטוקול שלנו מציל דגימות דם ומח עצם קרושות מבלי להשפיע על איכות התאים. זה מיישן דגימה מחדש, מפחית במידה ניכרת את עלויות הדגימה ומאפשר שימוש בדגימות קרושות למחקר או לטיפול.
מבוא
תאי גזע mesenchymal (MSCs) לשחק תפקיד מרכזי ברפואת רגנרטיבית והנדסת רקמות. הם יכולים להגר, להתמיין לסוגי תאים שונים 1 ונקלט, אשר הופך אותם למועמדים אידיאליים עבור טיפולי אוטולוגי 2,3. בזמן האחרון, ניסויים קליניים באמצעות MSCs לתיקון עצם וסחוס, שתל לעומת מחלה מארח או מחלת לב הושקו 4. ניתן לקצור MSCs אלה מרקמת חוט או שומן הטבור אבל תוצאות המבטיחות ביותר התקבלו מתאי גזע שמקורם במח עצם 5.
רכס הכסל מאפשר לאסוף כמות ניכרת של מח עצם ולכן משמש כאתר עיקרי של שאיפה 6. עם זאת, איכות לשאוב יורדת עם עלייה בנפח של מח עצ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: aspirates מח עצם אנושי מפסגת הכסל נאסף ממתורמים באישור ועדת האתיקה של לוצרן. aspirates מח עצם לכלבים מפסגת הכסל נאסף עם consent.Human של בעל כלב (כ. 20 מיליליטר) וכלבים (כ. 10 מיליליטר) aspirates מח עצם היו אנטי-קרוש על ידי תוספת של 15 מיליליטר של 3.8% נתרן ציטרט מייד לאחר נסיגה בחדר הניתוח. הדגימות הועברו לסביבת המעבדה לעיבוד באותו היום כמו נסוג.
1. הכנת האוריקינאז (לפני 1 st שימוש)
- מחדש האוריקינאז באמצעות תמיסת מלח סטרילית פוספט (PBS) על פי הוראות היצר....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
העובדות כי 74% מהדגימות מח עצם כלבים (n = 54) הכילו קרישים כאשר הם הגיעו למעבדה (איור 1 א) זה יחד עם ירידה בתשואות MSC מדגימות אלה, גרמו לנו להאמין שמספר לא מבוטל של MSCs היה לכוד בתוך קרישים . ואכן, DAPI כתם פשוט של חומר קריש מחולק מאשר את הנוכחות של תאי בעלי גרעין בצפיפות גבוהה (איור 1). זה סופו של דבר מוביל למספרים נמוכים של תאי גזע זמינים לתרבות התרחבות, אשר מופעלים עלינו לפתח את הפרוטוקול באמצעות האוריקינאז. בדרך כלל קרישים נעלמים כמעט לחלוטי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
באופן שגרתי אנו דוגמים מח עצם בזמן שהמטופל עובר ניתוח (במקרה שלנו בעיקר ניתוח בעמוד השדרה), עם היתרון שיש לו רק קצת עבודה נוספת שבוצעה על ידי אנשים בחדר הניתוח. למרות שהדגימות מעורבבות עם נתרן ציטרט מייד לאחר נסיגה, דגימות רבות היו קרשו באופן חלקי, כאשר הם הגיעו למעבדה לעיבוד. בשלב זה, דגימה מחדש להחליף דגימות קרושנה תהיה התערבות נוספת נפרדת שחייב שוב הרדמה מקומית או כללית 6. זה מחייב את נכונותם של שני אנשי צוות הקליניים והתורם לתרום וצורכת הרבה משאבים 21.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענק הקרן הלאומית השוויצרית CR3I3_140717/1 והקרן השוויצרית לשיתוק.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| רכיבים בינוניים | |||
| PenStrep 100X | Gibco | 15140122 | |
| אנושי FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| MEM אלפא עם נוקלאוזיד, עם גלוטמין יציב | Amimed | 1-23S50-I | |
| FBS מומת | חום Amimed | 2-01F36-I | |
| אמפוטריצין B | Applichem | A1907 | |
| רכיבים בינוניים | |||
| DMEM-HAM F12 + GlutaMAX | Amimed | 1-26F09-I | |
| אינסולין | סרום סיגמא | I5500 | |
| ארנב | Gibco | 16120099 | |
| Dexamethasone | Applichem | D4902 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
| ביוטין | סיגמא | B4639 | |
| רוזיגליטזון | סיגמא | R2408 | |
| פנטותנט | Sigma | P5155 | |
| שמן אדום-O | Sigma | O0625 | |
| בינוניים אוסטאוגניים | |||
| חומצה L-אסקורבית 2-פוספט | Sigma | A8960 | |
| ß-גליצרופוספט | Sigma | G9422 | |
| כסף חנקתי (AgNO3) | Sigma | S6506 | |
| רכיבים | |||
| Biopad - מכשיר רפואי בצורת ספוג | Euroresearch | ||
| L-פרולין | Sigma | P5607 | |
| אינסולין-טרנספרין-סלניום X | Gibco | 51500056 | |
| גורם גדילה טרנספורמטיבי אנושי-ובטא; 1 | Peprotech | 100-21 | |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A3157 | |
| גרעיני מהיר אדום | Sigma | N8002 | |
| גנרי | |||
| Tri-נתרן ציטראט דיהידראט | Applichem | A3901 | |
| PBS | Applichem | 964.9100 | |
| Urokinase | Medac | 1976826 | |
| 0.5% טריפסין-EDTA | Gibco | 15400054 | |
| כתם Giemsa | Applichem | A0885 | |
| פורמלדהיד | Applichem | A0877 | |
| חומצה גופרתית (H2SO4) | Applichem | A0655 | |
| דימתיל סולפוקסיד (DMSO) | Applichem | A1584 | |
| מגנזיום כלוריד (MgCl2) | Applichem | A3618 | |
| גואנידין הידרוכלוריד | Applichem | A1499 | |
| חומרים | |||
| 50 מ"ל צינור תגובה | Axygen | SCT-50ML-25-S | |
| 10 מ"ל מזרק | בראון | 4606108V | |
| מחט סטריקנית (22 גרם) | בראון | 4657624 | |
| 1.7 מ"ל מיקרו-צינורות | Brunschwig | MCT-175-C | |
| 100 μ מסננת תאים | m Falcon | 6.05935 | |
| מלקחיים סטריליים | Bastos Viegas, SA | 489-001 | |
| אזמל סטרילי | צלחת | ||
| פרימריה | Falcon | 353803 | |
| C-Chip Neubauer בקבוק | Bioswisstech | 505050 | |
| - בקבוק T300 | TPP | 90301 | |
| ציוד | |||
| ארון בטיחות ביולוגית מיקרוביולוגית Class II | 82011500 | סקאן | |
| Memmert | 1305.0377 | ||
| Stripettes פיפטה סרולוגית 5 מ"ל | מיקרוסקופ קורנינג | 4487-200ea | |
| אולימפוס | CKX41 | ||
| חממה לחה Heracells 240 | Thermo 51026331 | ||
| מדעי Heraeus Multifuge 1S-R | Thermo Scientific | 75004331 |
מקורות
- Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).
- Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).
- Bartholomew, A., e....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
