המטרה של פרוטוקול זה היא הגילוי של סמן חמצון ה- DNA, 8-אוקסו-7,8-Dihydro-2'-deoxyguanosine (8-אוקסו-dGuo) על ידי HPLC-ED, בDNA מהתאים בתרבית או רקמות של בעלי חיים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
HPLC המדידה של ה- DNA חמצון ביומרקר, 8-אוקסו-7,8-Dihydro-2'-deoxyguanosine, בתאים בתרבית ורקמות בעלי החיים
במאמר זה
סיכום
תקציר
סטרס חמצונים קשור הרבה תהליכים פיסיולוגיים ופתולוגיים, כמו גם חילוף חומרים xenobiotic, מוביל לחמצון של Biomacromolecules, כולל DNA. לכן, זיהוי יעיל של חמצון ה- DNA הוא חשוב עבור מגוון רחב של תחומי מחקר, כוללים רפואה וטוקסיקולוגיה. סמן ביולוגי משותף של דנ"א פגום oxidatively הוא 8-אוקסו-7,8-Dihydro-2'-deoxyguanosine (8-אוקסו-dGuo; לעתים קרובות מכונה בטעות כ8-הידרוקסי-2'deoxyguanosine (8-OH-dGuo או 8 -oxo-DG)). כמה פרוטוקולים ל8-אוקסו-dGuo מדידה על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה עם זיהוי אלקטרוכימי (HPLC-ED) תוארו. עם זאת, אלה יושמו בעיקר ל- DNA מטוהר שטופל בפרו-חמצון. בנוסף, עקב הבדלים מתודולוגיים בין מעבדות, בעיקר בשל הבדלים בציוד אנליטי, האימוץ של שיטות שפורסמו לצורך זיהוי של 8-אוקסו-dGuo ידי HPLC-ED דורש אופטימיזציה זהירה בכל מעבדה.פרוטוקול מקיף, המתאר תהליך האופטימיזציה כזה, חסר. כאן, פרוטוקול מפורט מתואר לגילוי של 8-אוקסו-dGuo ידי HPLC-ED, בDNA מהתאים בתרבית או רקמות של בעלי חיים. זה מדגים כיצד הכנת דגימת DNA יכולה להיות מותאמת בקלות ובמהירות כדי למזער חמצון ה- DNA לא רצוי שיכול להתרחש במהלך הכנת מדגם. פרוטוקול זה מראה כיצד לזהות 8-אוקסו-dGuo בתאים בתרבית אדם אדנוקרצינומה מכתשי (כלומר, תאי A549) שטופלו בסוכן חמצון KBrO 3, ומהטחול של עכברים שנחשפו לdibenzo פחמימנים ארומטיים polycyclic (def, עמ ') chrysene (DBC, שנקרא בעבר פיר dibenzo (, יב), DalP). בסך הכל, עבודה זו מדגימה כיצד מתודולוגיה HPLC-ED יכולה להיות מותאמת בקלות לזיהוי של 8-אוקסו-dGuo בדגימות ביולוגיות.
מבוא
מינים תגובתי חמצן (ROS), מצב יציב שיכולים להגדיל את הרמות בהרבה מצבים פתולוגיים וחילוף חומרי xenotoxic, תורמים לשכיחות מוגברת של נזק לדנ"א חמצוני. בין כמה מוצרי חמצון nucleobases האפשרי, נזק לדנ"א חמצוני יכול בקלות למדוד באמצעות הסמן היציב 8-אוקסו-7,8-Dihydro-2'-deoxyguanosine (8-אוקסו-dGuo), שהוא אחת מצורות חמצון של 2 ' -deoxyguanosine (dGuo) 1. 8-אוקסו-dGuo הוא נגע DNA הנפוץ ביותר 2, ולכן, כבר למד לפירוט רב יותר כסמן ביולוגי חמצון ה- DNA למרות קיומם של מוצרי חמצון ה- DNA המרובים 3. בבני אדם, נזק זה ניתן לתיקון באמצעות תיקון כריתת בסיס על ידי glycosylase 8-oxoguanine 1 (hOGG1) 4.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
ודא שכל בעלי חיים, דיור, טיפול וניסויים לדבוק בכללים ותקנות מקומיים וכי פרוטוקולי ניסויים אושרו לפני תחילת כל מחקר. לניסויים שתוארו, טיפול בבעלי חיים, טיפול, וטיפול אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים הבריאות בקנדה. ראה "שולחן ריאגנטים" למידע של הספקים.
1. איסוף דגימות ביולוגיות
- תאים או רקמות בעלי החיים
- לגדל תאי A549 אדנוקרצינומה מכתשיים אדם בתקשורת F12-K המכילה 10% בסרום שור עוברי, ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
dGuo נצפה ליש זמן שמירה של 4.7 דקות ואילו 8-אוקסו-dGuo זמן שמירה של כ 6.4 דקות (איור 2 א 'וב'). יש הבדל כ -1,000 פי בגבה השיא בין שני analytes, כפי שניתן לראות באיור 2 ג. Voltammograms ל8-אוקסו-dGuo וdGuo התקבלו על ידי סטנדרטים פועלים בפוטנציאל עבודה בטווח של 0.2-1.1 V. פוטנציאל העבודה האופטימלי עבור 8-אוקסו-dGuo היה נחוש להיות 0.5 V, ו0.9 V לdGuo (איור 3). פוטנציאלים אלה הם בהסכם עם אלקטרודות פחמן מזוגגות אחרות המתוארות ב.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
למרות 8-אוקסו-dGuo דווח כסמן ביולוגי שימושי של חמצון ה- DNA, הכימות אמין שלה יכול להוות אתגר. למרות כמה שיטות שפורסמו קיימות, יש צורך בסקירה מקיפה, תיאורים של פרוטוקול להתיר לחוקרים לפרוס את השיטה במעבדות שלהם. כאן אנו מציגים סקירה מפורטת של פרוטוקול מבוסס HPLC שיאפשר למשתמשים חדשים להקים שיטה יעילה לגילוי 8-אוקסו-dGuo וכימות.
שלוש שיטות עיקריות שתוארו לכימות של 8-אוקסו-dGuo. אלה כוללים אנזים צמוד immunosorbent a.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
לא הוכרז על ניגוד עניינים או אינטרסים פיננסיים מתחרים.
תודות
מחקר זה מומן על ידי משרד הבריאות הקנדית ג'נומיקס המחקר ופיתוח היוזמה (GRDI) ותקינת האסטרטגיה הקנדית לביוטכנולוגיה (CRSB). יש הסופרים אין ניגוד האינטרסים.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| תקן 8-oxo-dGuo | Cayman Chemical Company | 89320 | מכונה באופן לא הולם "8-hydroxy-2'-deoxy Guanosine"; ראה <חזק>איור 1 וטקסט לפרטים. |
| פוספטאז אלקליין | סיגמא-אולדריץ' | P5931 | מE. coli |
| Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | כלאטים מתכות כבדות |
| Desferoxamine mesylate | Sigma-Aldrich | D9533 | |
| dGuo Standard | Sigma-Aldrich | D7145 | |
| נתרן פוספט דו-בסיסי | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| DNA מזרע סלמון | Sigma-Aldrich | D1626 | מלח נתרן |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D4527 | TypeII, מלבלב בקר |
| DNAzol | Invitrogen | 10503-27 | |
| Ethylenediaminetetraacetic חומצה דיסודיום מלח דיהידראט (EDTA) | Sigma-Aldrich | E4884 | התרכובת לא תתמוסס לחלוטין עד שה-pH של התמיסה יותאם ל-8.0 (למשל עם NaOH) |
| F12-K מדיה | ATCC | 30-2004 | |
| סרום בקר עוברי | ATCC | 30-2020 | |
| עמוד משמר | התמחויות כרומטוגרפיות | YBA 99S03 0204GC | מגן על הקולום מפני זיהום; עלול גם להוביל להצטברות לחץ |
| מגנזיום כלוריד | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| נתרן פוספט | מונו-בסיסיSigma-Aldrich | S9638 | |
| פניצילין-סטרפטומיצין | Invitrogen | 15140-122 | |
| פוספט חוצץ | מלח Invitrogen | 15190-250 | |
| פוספודיאסטראז I אנזים | Sigma-Aldrich | P3243 | סוג II מארס Crotalus adamaneus |
| הומוגנייזר טפלון | תומאס סיינטיפיק | 7724T-1 או 7724T-5 עבור 1 או 5 מ"ל, בהתאמה | נפח (יכולת החזקה) תלוי בכמות הדגימה שיש לעבד. |
| Trypsin | Invitrogen | 15050-065 | |
| עמודת YMC-BASIC עם סיליקה כדורית מלוכדת | התמחויות כרומטוגרפיות | YBA 99S03 1546WT |
מקורות
- Helbock, H. J., Beckman, K. B., Shigenaga, M. K., Walter, P. B., Woodall, A. A., Yeo, H. C., Ames, B. N. DNA oxidation matters: The HPLC-electrochemical assay of 8-oxo-deoxyguianosine and 8-oxo-guanine. Proc. Natl. Acad. Sci. 95 (1), 288-293 (1998).
- Valavanidis, A., Vlachogianni, T., Fiotakis, C.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
