מאמר שיטה

סטנדרטי שיטה לניתוח של תאי הכבד סינוסי האנדותל וFenestrations על ידי סריקה מיקרוסקופית אלקטרונים

DOI:

10.3791/52698

⸱

30 באפריל 2015

 ,  ,  , 
1Centre for Education and Research on Ageing & ANZAC Research Institute, University of Sydney and Concord Hospital, 2Ageing and Alzheimers Institute, Concord Hospital, 3Charles Perkins Centre, University of Sydney

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תא האנדותל הסינוסואידלי של הכבד הוא מערכת סינון חשובה מבחינה ביולוגית המושפעת מאוד ממחלות שונות, רעלים ומצבים פיזיולוגיים. שינויים אלה משפיעים באופן משמעותי על תפקוד הכבד. אנו מתארים שיטות לסטנדרטיזציה של מדידת הגודל ומספר הפנסטרציות בתאים אלה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי אנדותל סינוסואידיים בכבד הם השער לכבד, הפנסטרציות הטרנס-תאיות שלהם מאפשרות העברה ללא הפרעה של חומרים קטנים ומומסים מהדם לפרנכימת הכבד לצורך חילוף חומרים ועיבוד. Fenestrations הם מבנים דינמיים - ניתן לשנות את גודלם ו/או מספרם בתגובה למצבים פיזיולוגיים שונים, תרופות ומחלות, מה שהופך אותם למטרה חשובה למודולציה. הבנה כיצד מורפולוגיה של LSEC מושפעת ממצבים שונים, רעילים ופיזיולוגיים וכיצד שינויים אלה משפיעים על תפקוד הכבד דורשת מדידה מדויקת של גודל ומספר הפנסטרציות. במאמר זה, אנו מתארים טכניקות קיבוע ועיבוד של מיקרוסקופ אלקטרונים סורק המשמשות במעבדה שלנו כדי להבטיח הכנת דגימה ניתנת לשחזור ופרשנות מדויקת. השיטות כוללות קיבוע זלוף, קיבוע משני והתייבשות, הכנה למיקרוסקופ האלקטרונים הסורק וניתוח. לבסוף, אנו מספקים שיטה צעד אחר צעד לניתוח תמונה סטנדרטי שתועיל לכל החוקרים בתחום.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי הכבד סינוסי האנדותל (LSECs) הם מאוד תאי האנדותל מובחנים המרפדים את הקיר של סינוסואידה הכבד. LSECs הם מחוררים עם fenestrations ש- diaphragmed עישון, transcellular נקבוביות 50-250 ננומטר בקוטר. עד 20% מהשטח של LSECs מכוסה על ידי fenestrations, שהם בדרך כלל בקבוצות של עשרות עד מאות נקראים צלחות מסננת 1-3 (איור 1). Fenestrations לאפשר העברה של פלזמה וnanosubstrates בין הדם וhepatocytes, יצירת מערכת אולטרה סינון יעילה ביותר. Fenestrations הם מבנים דינמיים - שניהם בגודל ו / או מספר ניתן לשנות בתגובה למצבים שונים פיסיולוגיים, תרופות, ומחלות. לדוגמא, fenestrations גדול יותר בצם מאשר במדינה נמאס 4; 2-די-iodoamphetamine מגדיל מספר אשנוב; 5,6 וירידה בגודל ובמספר fenestrations לכל תא מתרחש במדינות הזדקנות ומחלות רבות 7-13 . מדידה מדויקת של הגודל ומספר fenestrations חשובה להבנה כיצד מורפולוגיה LSEC מושפעת מחלה שונות, רעילה, ומדינות פיסיולוגיות; ההשפעה שלהם על תפקוד כבד; ולפיתוח אשנוב-ויסות התערבויות טיפוליות 1.

המחקר של fenestrations קשה. הקוטר של fenestrations נמצא מתחת לרזולוציה של מיקרוסקופ אור הרגילה, כך במיקרוסקופ אלקטרונים רק בעבר תצפית באמצעות שני בLSECs רקמת כבד או מתורבתת שלם היה אפשרי. מיקרוסקופ האלקטרונים הסורקים (SEM) יש בתדירות הגבוהה ביותר נעשה שימוש כדי ללמוד גודל אשנוב, תדירות ונקבובית (אחוז קרום LSEC שהוא מחורר ידי fenestrations) כי SEM מאפשר התצפית של שטחים גדולים של פני השטח האנדותל והמדידה של אלפים, אם לא עשרות אלפים fenestrations. למרות השירות שלה, את התוצאות המדווחים מSEM מבוססות מחקרים לפרמטרים LSEC כגון גודל אשנוב, מספר, תדירות ונקבובית להשתנות במידה רבה בספרות (טבלת 1).

Fenestrations וצלחות מסננת הן מבנים שבריריים שחוזה, לשבור, להתרחב או להתגבש במהלך הכנת דגימה, יש צורך בעיבוד ובכך הקפיד לשמור על שלמותם. לחץ זלוף גבוה 14; osmolarity שגויה של מקבע ומאגרים 15; קיבעון לקוי או קיבעון זמן; ומהירות של התייבשות לאחר קיבוע-וייבושם בכל תחומי העיבוד לSEM שעשוי לייצר חפצים המפריעים לשימור ultrastructure (איור 2). אובדן fenestrations ('defenestration') והצטמקות אשנוב יכול להתרחש כתוצאה מקיבעון עני, וכתוצאה מכך קוטר אשנוב מופחת ונקבובי תא. שיטות כדי לשפר את השימור של דגימות לניתוח SEM תוארו בעבר 15-17 ותידוננהכאן עם טיפים נוספים על איך לשפר את שימור דגימה. המטרות העיקריות של שימור הדגימה הן להסיר דם מsinusoids כך את פני השטח של LSEC ניתן דמיינו וכדי למנוע נזק LSEC משני בלחץ גבוה או קיבעון מתעכב. זלוף הכבד השלם של מקבע דרך וריד הפורטל הוא השיטה המועדפת לקיבוע כבד. כפי שתואר בפירוט במקום אחר 16,18 זלוף חייבת להתבצע בלחץ נמוך (למשל 10 סנטימטר של H 2 0), כדי למנוע חפצי זלוף הקשורים ללחץ ונזק לLSEC, בא לידי ביטוי בדרך כלל פערים גדולים כמו בקרום התא. עם זאת, לעתים קרובות ניתן להשיג קיבעון סביר באמצעות זלוף מחט של ביופסית כבד מבני האדם ובעלי חיים, כפי שתואר בפירוט במקום אחר 19. טכניקה זו כרוכה בהזרקה ישירות מקבעת לתוך הרקמה עד דם סמוק מתוך המדגם והרקמות היא מוצקות וקבוע. קיבוע של דגימות למיקרוסקופ אלקטרונים צריך להיות Performed מהר ככל האפשר הבא הפסקת זרימת דם למניעת שינויי ultrastructural מתרחשים כתוצאה מתהליכי הכבדים autolytic מאוד מהירים.

כמו כן, אנו מציגים שיטה של ​​ניתוח תמונה שממזער את ההכללה של חפצים, וסטנדרטיזציה מדידת fenestrations. וריאציה בבחירת sinusoids לmicrographs, ניתוח תמונה של חפצים, ומדידה של שטח תא לתדר נקבוביות ואשנוב הובילו לפערים גדולים בתוצאות שפורסמו. גישה סטנדרטית להערכה ומדידה של fenestrations ודרישות מינימום להצגת נתונים שלא טופלה באופן ברור בספרות בעבר 4,10,20-31.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: כל הנהלים הקשורים לשימוש בבעלי החיים מתבצעות בהתאם לחקיקה המקומית. העבודה שלנו היא אושרה על ידי ועדת בעלי החיים בריאות המחוזית סידני המקומי הרווחה. הנהלים אפשרו מתוארים בתיעוד רישיון פרויקט ולעקוב אחר הנחיות שתבטחנה את שלומם של בעלי החיים בכל העת. להבטיח עמידה בחקיקה על ניסויים בבעלי חיים במדינה שבן העבודה נעשית.

1. פרוטוקול להכנת EM מקבע

  1. לשל מקבע 100 מיליליטר, להכין paraformaldehyde על ידי הוספת 2 גרם של אבקת paraformaldehyde 25 מיליליטר מים מזוקקים בבקבוק חרוטי, חום עד 65 מעלות צלזיוס, תוך ערבוב עם בוחש מגנטי כל הזמן.
    הערה: Glutaraldehyde, paraformaldehyde וחיץ cacodylate נתרן כל חומרים מסוכנים וחייב תמיד להיות מטופלים בfumehood.
  2. חום על 65 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות לאחר מכן להתקרר. במידת הצורך, להוסיף dropw פתרון נתרן הידרוקסידיISE תוך ערבוב כדי לנקות פתרון לחלוטין.
    הערה: נתרן הידרוקסידי הוא מסוכן, לטפל בזהירות.
  3. להוסיף 10 מיליליטר של glutaraldehyde מניית הכיתה EM, 50 מיליליטר של חיץ cacodylate 0.2 M נתרן ו -2 גרם של סוכרוז ומערבבים עם בוחש מגנטי. הוסף 2 מיליליטר של 1.0 M CaCl 2.
  4. התאם לpH 7.4 לפני קבלת פתרון עד במים מזוקקים 100 מיליליטר. מקבע הסופי מכיל glutaraldehyde 2.5%, Paraformaldehyde 2%, 2 mmol CaCl 2, 2% סוכרוז במאגר M 0.1 cacodylate. ודא שosmolality הכולל הוא 440 mOsmol / L. השתמש בתוך 24 שעות של הכנה.

2. זלוף קיבוע של כבד

  1. מאגר חם זלוף ומקבע ל35-37 מעלות צלזיוס. הטמפרטורה הנכונה של חיץ exsanguination ומקבע עוזרת להבטיח את שלמות רקמה.
  2. לטשטש את החיה עם זריקת intraperitoneal אחת של 50 מ"ג / קילוגרם קטמין ו5 מ"ג / קילוגרם Xylazine.
  3. ברגע שבעלי החיים נמצאים תחתהרדמה עמוקה, שהוערכה על ידי נסיגת גפיים אחוריות וקמצוץ זנב, חתך Y הוא עשה עם מספריים קהים הסתיים בבטנו של בעל החיים כדי לחשוף את הווריד הכבד ופורטל.
    הערה: ודא שהציוד הוא נקי, כדי למנוע זיהום של דגימות עם מיקרואורגניזמים וכללי פסולת שניתן לראות בקלות על SEM.
  4. לקשור שני תפרים רופפים מאוד מסביב לוריד הפורטל הפרוקסימלי אחד בכבד, יותר האחרים distally אל הכבד.
  5. Cannulate וריד השער עם צינורית בגודל המתאימה IV (18 G לחולדות, 22 G לעכברים) תפרי .Tighten לאבטח צינורית.
  6. להתחיל זלוף עם נאגר מלוח פוספט חימם עד 37 מעלות צלזיוס, ובלחץ של 10 סנטימטרים של H 2 0. בין 5 ל 20 מיליליטר של PBS נדרש בדרך כלל ללגרום לדימום מחודש הכבד.
    הערה: אל תאפשר לבועות אוויר להיכנס הכבד דרך הצינורות מחוברים לצינורית כפי שהם לגרום לחפצים משניים לאמבוליזציה ולחץ; נזק לhepatocytes, סיnusoids וfenestrations LSEC מתרחש אם לחץ זלוף הוא גבוה מדי.
  7. לנתק את הווריד נבוב בטן ובית חזה על מנת לאפשר לחיץ כדי לצאת באופן חופשי מהכבד. זה מונע נזק בחזרה בלחץ גבוה לLSECs.
  8. ברגע שהכבד הוא ללא דם, להחליף PBS עם מקבע EM וינקב עבור כ 5 דקות, עד שהכבד קשוח ומאוד חיוור.
  9. להפסיק זלוף ולחתוך את הכבד הקבוע ל1-2 מ"מ 3 בלוקים באמצעות אזמל חד.
  10. רקמה שלאחר תיקון במקבע EM ל24-72 שעות ב 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: באופן כללי, underfixation גורמת יותר מאשר חפצי overfixation.
  11. לשנות מקבע הבאים תקופה שלאחר תיקון לחיץ 0.1 cacodylate M נתרן לאחסון ב 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: דוגמאות מאוחסנות בדרך זו תישמר לתקופה משמעותית של זמן (עד 12 חודשים), קיבעון המשני בזמן זאת ובדיקה מומלצת לתוצאות הטובות ביותר.

3. המחט Perfusion

הערה: קיבוע מחט הנו נגזר של קיבעון זלוף שכרוך בהזרקה של מקבע ישירות לתוך רקמת כבד ביופסיה. המטרה היא למקבע להיות סמוקה דרך כלי הדם כדי לגרום לדימום המחודש ולחשוף את כל גוש הרקמה למקבע. יש להקפיד לשמור על לחץ הזרקה נמוך, כדי למנוע פגיעה בלחץ 18,19.

  1. הסר חתיכה קטנה של כבד מבעלי החיים או הנושא ולשטוף בתמיסת מלח כדי להסיר דם ופסולת.
  2. לצייר מלח הרגיל למצויד במחט עדינה מד (בדרך כלל מזרק אינסולין) מזרק.
  3. להזריק המלוח מאוד לאט לתוך הכבד עד דם סמוק מהרקמה. זריקות מרובות ייתכן שתידרש.
  4. צייר את מקבע EM למצויד במחט עדינה מד (בדרך כלל מזרק אינסולין) מזרק אחר.
  5. הזרק מקבע מאוד לאט לתוך הכבד עד שהוא הופך קשה ושיזוף בצבע. הזרקה מרובהים עשוי להידרש.
  6. חותך את הכבד הקבוע ל1-2 מ"מ 3 בלוקים באמצעות אזמל חד. דגירה במקבעת EM ל24-72 שעות 4 מעלות צלזיוס. לשטוף 3 פעמים ב 0.1 חיץ cacodylate M נתרן לפני תחילת קיבעון המשני.

4. הכנה לסריקה מיקרוסקופית אלקטרונים

  1. מדגם לשטוף 3 פעמים במאגר cacodylate 0.1 M נתרן. כדי לתקן שומנים, לאחר לתקן את המדגם ב 2% tetroxide אוסמיום במאגר cacodylate 0.1 M נתרן לשעה 2.
    הערה: שטיפה מלאה היא מאוד חשובה כמו צלב tetroxide glutaraldehyde ואוסמיום להגיב וליצור חפצים על SEM.
  2. יש לשטוף את הדגימות בהגדלת ריכוזים של אתנול להתחיל התייבשות. שטיפה ראשונה באתנול 50% במשך 5 דקות; 3 פעמים ולאחר מכן ל5 דקות עם 70% אתנול; לשטוף 3 פעמים במשך 5 דקות עם 90% אתנול; לשטוף 2 פעמים במשך 5 דקות ב 100% אתנול; ולבסוף לשטוף 2 פעמים במשך 10 דקות ב 100% אתנול (מסננת מולקולרית).
  3. הסר את כל אתנול מהדגימות ולהחליף עם hexamethyldisilazane (HMDS) בfumehood ולהשאיר למשך 10 דקות. הסר HMDS מדגימות הרקמה ולאפשר להתאדות.
    הערה: HMDS הוא hygroscopic מאוד כאשר קר ולכן מאפשרים להגיע RT לפני השימוש לצעד התייבשות סופי.
  4. לחלופין, הר הדגימות באופן מיידי או להכניס אותם לתוך תא ייבוש עד מוכן לעלות לSEM.

5. הרכבה

הערה: הרכבת דגימה נכונה תהיה למקסם את מספר sinusoids מסומן בצורה ברורה לניתוח תחת SEM.

  1. תווית הבסיס של ספחי SEM מתכת ולהחיל קלטת פחמן מוליך דו-צדדית לחלק העליון של הספחים.
  2. דמיינו דגימות באמצעות מיקרוסקופ לנתח לזהות את פני השטח עם sinusoids הטוב ביותר עבור SEM שלאחר מכן. מניחים משטח שכלפי מעלה על פני השטח קלטת פחמן של הבדל.
  3. דגימות מקל היטב לבדל, דגימות מוכנות לציפוי גמגום עכשיו.
> 6. ציפוי ove_title "

הערה: ציפוי הדגימה עם סרט משובח של מוליך מתכת (זהב או פלטינה) בטענת coater גמגום הדגימה ומגנה עליו מפני נזקי קרן האלקטרונים. אם הציפוי הוא מבנים עבים מדי של ריבית עשויים להיות מוסתרים.

  1. ספחי מקום לתא הוואקום של coater גמגום קנס האוטומטי, להגדיר את המצב לסיבוב וציפוי גמגום אוטומטי במשך 45 שניות. השתמש ציפוי פלטינה לעדין המפרט, אבל הזהב מתאים גם.
  2. למרוח שכבה דקה של צבע פחמן למשטחים החיצוניים של הדגימות כבד רכובים, נזהר שלא מעיל משטחי סינוסי.
  3. ברגע שהדגימות מצופות בפלטינה וצבע פחמן התייבש הם מוכנים לתצפית על SEM. דוגמאות ניתן לאחסן בתא ייבוש.

7. שימוש במיקרוסקופ אלקטרוני הסורק

  1. מקום דגימות למיקרוסקופ אלקטרונים סורק ולחזור מיקרוסקופ כדי ואקום.
  2. באמצעות נהלי הפעלה מיקרוסקופ רגילים להדמיה של דגימות על ידי החל בהגדלה נמוכה, להגדיל בהדרגה הגדלה.
  3. ודא מיקרוסקופ מותאם כראוי לעבודת מרחק, גודל נקודה ואסטיגמציה.
  4. בדקו את שלמות קיבעון. אם LSEC הוא לרוב ללא תשלום מפערים ומכיל fenestrations מדידת 30-250 קוטר ננומטר זה בדרך כלל מצביע על כך שהכנת הדגימה הייתה מוצלחת.
  5. אם sinusoids מלא של פערים או נטול fenestrations הכנת הדגימה לא הייתה מוצלחת או שיש פתולוגיה המשמעותית. במקרה זה, פורס את המדגם בסכין גילוח עדין מאוד, ומשטחי חיתוך שכבה על גבי שכבה ונותחו לsinusoids הקבוע בהצלחה.
  6. בכ 15,000-20,000 × הגדלה לבחור משטחי LSEC שטוחים שהם ללא פסולת עם קיבעון טוב ובי fenestrations גלוי לעין (בדרך כלל מכיל לפחות 10 fenestrations).
  7. לשמור תמונות של לפחות 10 sinusoids לכבד, מאזורים השונים של בלוקים, באמצעות לפחות שני רחובות לכבד. דגימת 10 micrographs ב15,000 - 20,000 × הגדלה לכל בעלי חיים היא בדרך כלל מספיק לכימות של fenestrations להיות נציג של כל הכבד.

8. ניתוח

הערה: תוכנת ImageJ אשר ניתן להוריד בחינם מNIH מנוצלת לכמת קוטר אשנוב ותדר (www.imagej.nih.gov/ij).

  1. תמונה הפתוחה J ולהגדיר את היקף שימוש בסרגל קנה המידה המוטבע בתמונה (צילום המסך 1).
  2. שימוש בכלי המצולע בImageJ, עקבות באזור השטוח של כל LSEC כוללים אזורי fenestrated וחלונות. פשוט לא זכר את צלחות המסננת כמו זה בטעות יהיה לנפח נקבוביות. תכלול כל חתיכות גדולות של פסולת שנמצאות על פני התא שעשויה להיות obscurifenestrations ng.
  3. כדי למדוד קוטר אשנוב, לעקוב אחר קו בקוטר הארוך ביותר של כל אשנוב על ידי בחירה בכלי השורה, ולחץ על "M" כדי למדוד את הקו, ו" ד "(לצייר) למתוח את הקו בתמונה באופן קבוע. קו זה מוגדר כקוטר אשנוב. אורך הקו יהיה זמין כעת בתיבת תוצאות ImageJ (צילום מסך 2).
  4. למדוד את כל הפערים שהם חורים גדולים יותר בציטופלסמה LSEC מעל 250 ננומטר, כמו גם fenestrations. פערים הם לעתים קרובות חפצים המשקפים זלוף העני או קיבעון, אולם פערים יכולים להתרחש גם כתוצאה ממחלה והרעילות. נתונים לפערים יהיו פטור מחישוב הפרמטרים אשנוב מאוחר יותר בניתוח.
  5. האזור של פערים שאינם מעגליים צריך להיות מחושב על ידי התחקות סביב הפערים וחישוב השטח שלהם על ImageJ.
  6. הדבק את הנתונים מתיבת התוצאות בImageJ לתוך גיליון אלקטרוני Excel למעיל-הפרווהניתוח r.

9. חישובים

  1. קוטר ממוצע = אשנוב הממוצע של כל קטרי אשנוב (לא כוללים פערים, שבו פערים ≥ 250 ננומטר).
  2. אשנוב אזור = πr 2, שבו r, הרדיוס, מחושב מקוטר fenestrations הבודד (r = ד / 2) הפערים, לא כולל.
  3. נקבוביות (%) = (Σ (πr 2) / שטח כולל ניתח - אזור Σ (פערים =)) (מיקרומטר 2)) × 100.
  4. תדירות אשנוב = מספר כולל של fenestrations / (שטח כולל ניתח-Σ (שטח של פערים) (מיקרומטר 2).

10. הצגת אשנוב נתונים

הערה: במידת האפשר, פרסומים כוללים כימות של נתונים אשנוב צריכים לכלול את הפרטים הבאים

  1. קוטר אשנוב, עם הצהרה המאשר את מה שקטרי גבול שבו משמשים להגדרת fenestrations (בדרך כללבין 50-250 ננומטר), תדירות אשנוב (מספר / מיקרומטר 2) ונקבובי (%).
  2. הצהרה המאשרת אם פערים נכללו בניתוח, גרף התפלגות תדירות קוטר אשנוב והמספר של כבדים, בלוקים, תמונות וfenestrations צריך להיכלל בניתוח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדמיה ראשונית בהגדלה נמוכה על ידי סריקה מיקרוסקופי אלקטרונים מגלה משטח שטוח של דגימת הכבד בשטח חשוף גדול מספיק כדי להתבונן רבים כלי כבד גדולים וsinusoids (איור 1 א). הבטחת מיקום בלוק כבד נכון על בדל ההרכבה היא חיונית לקבלת תמונות ברורות של sinusoids והכמוסה של Glisson של הכבד יש להימנע מסיבה זו (איור 1). הגדלת ההגדלה מאפשרת בדיקה מדוקדקת יותר של כלי הדם הצפופים של הכבד וחושפת את צלחות תא בודדות של hepatocytes שמחלק את כלי (איור 1 ג).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היכולת מדויקת וreproducibly למדוד את מעמדו של האנדותל סינוסי הכבד היא צעד חשוב בהבנת הביולוגיה של תאים מאוד מיוחדים אלה. טכניקות חדשות כגון מיקרוסקופיה המובנה התאורה 32, מיקרוסקופיה כוח אטומית 33 וד-STORM (ישיר סטוכסטיים אופטי Reconstrucion מיקרוסקופית) 34 תהיה להקנות מידע חשוב בנוגע למורפולוגיה של תאים אלה במבחנה אבל SEM נשאר המתודולוגיה העיקרית לחזות ולמדוד את המבנה שלהם ב אתרם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין אישורים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
25% דרגת EM GlutaraldehydeProSciTechC001אחסן מלאי ב-20 מעלות צלזיוס עד הצורך, הימנע מהקפאה מחדש
אבקת פרפורמלדהידסיגמא אולדריץ'158127טרייה פרפורמלדהיד
סיגמא אולדריץ'C0250הכינו מלאי 0.2 מ', pH 7.4 על ידי המסת אבקה ב-dH2O, בשימוש בעיקר ב-0.1 מ' על ידי הכנת דילול 1:2
סידן כלורידסיגמא אולדריץ'C1016הכן 1 M CaCl2 על ידי המסת אבקה ב-dH2O
אוסמיום טרטרוקסידProSciTechC011שטוף אמפולות בחומצה חלשה לפני השימוש כדי למנוע זיהום. הכינו 2% מלאי בבקבוק זכוכית
אתנול- אבסולוטסיגמא אולדריץ'459836 100% אתנול חייב להיות בדרגה גבוהה ומאוחסן עם מסננת מולקולרית
דרגות אחרות של אתנולLabtechEL5הכינו אתנולים מדורגים עם dH2O
HexamethyldisilazaneSigma Aldrich52619 יש לאפשר להגיע לטמפרטורת החדר לפני השימוש
CannulasTerumoTSROX1832C, TSROX2225C, TSROX2419C18 G מתאים לרוב החולדות, 22 G מתאים לרוב העכברים, אבל טוב שיהיו כמה 24 G בהישג יד במקרה של עכברים קטנים מאוד
סרט פחמן מוליךProSciTechIA0201
פחמןProSciTechI003
קטמיןחייב להיות מושג ברישיון
קסילזיןיש להשיג ברישיון
מסננת מולקולרית SigmaAldrich208647מסיר מים מ-100% אתנול
הכינו תמיד אבקת נתרן קקודילאט צבע

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cogger, V. C., Le Couteur, D. G., et al. The Liver: Biology and Pathobiology. Arias, I. M., et al. , John Wiley & Sons, Ltd. 387-404 (2009).
  2. Fraser, R., Dobbs, B. R., Rogers, G. W. Lipoproteins and the liver sieve: the role of fenestrated sinusoidal endothelium in lipoprotein metabolism, atherosclerosis, and cirrhosis. Hepatology. 21, 863-874 (1995).
  3. Wisse, W., De Zanger, R. B., Charels, K., Van Der Smissen, P., McCuskey, R. S. The liver sieve: considerations concerning the structure and function of endothelial fenestrae, the sinusoidal wall and the space of Disse. Hepatology. 5 (4), 683-692 (1985).
  4. Reilly, J. N., Cogger, V. C., Fraser, R., Le Couteur, D. G. The effect of feeding and fasting on fenestrations in the liver sinusoidal endothelial cell. Pathology. 42 (3), 255-258 (2010).
  5. Tian, Y., et al. Activation of serotonin receptor-2B rescues small-for-size liver graft failure in mice. Hepatology. 53 (1), 253-262 (2011).
  6. Cogger, V. C., Mitchell, S. J., Warren, A., de Cabo, R., Le Couteur, D. G. Age-Related Loss of Responsiveness to 2,5-Dimethoxy-4-Iodoamphetamine in Liver Sinusoidal Endothelial Cells. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 69 (5), 514-518 (2013).
  7. Reilly, J. N., Cogger, V. C., Le Couteur, D. G. Old age is associated with ultrastructural changes in isolated rat liver sinusoidal endothelial cells. J Electron Microsc. 59 (1), 65-69 (2010).
  8. Le Couteur, D. G., et al. Calorie Restriction, Aging and Longevity. Rattan, A. E., Le Couteur, D. G., de Cabo, R., et al. , 191-216 (2010).
  9. McLean, A. J., et al. Age-related pseudocapillarization of the human liver. J Pathol. 200 (1), 112-117 (2003).
  10. Le Couteur, D. G., et al. Pseudocapillarization and associated energy limitation in the aged rat liver. Hepatology. 33 (3), 537-543 (2001).
  11. Cogger, V. C., et al. The effect of acute oxidative stress on the ultrastructure of the perfused rat liver. Pharmacol Toxicol. 89 (6), 306-311 (2001).
  12. Horn, T., Christoffersen, P., Henriksen, J. H. Alcoholic liver injury: defenestration in noncirrhotic livers-a scanning electron microscopic study. Hepatology. 7 (1), 77-82 (1987).
  13. Jamieson, H. A., et al. Alterations in liver sinusoidal endothelium in a baboon model of type 1 diabetes. Diabetologia. 50 (9), 1969-1976 (2007).
  14. Fraser, R., et al. High perfusion pressure damages the sieving ability of sinusoidal endothelium in rat livers. Br J Exp Pathol. 61 (2), 222-228 (1980).
  15. Wisse, E. An electron microscopic study of the fenestrated endothelial lining of rat liver sinusoids. J Ultrastruct Res. 31 (1), 125-150 (1970).
  16. Wisse, E. An ultrastructural characterization of the endothelial cell in the rat liver sinusoid under normal and various experimental conditions, as a contribution to the distinction between endothelial and Kupffer cells. J Ultrastruct Res. 38 (5), 528-562 (1972).
  17. Fahimi, H. D. Perfusion and immersion fixation of rat liver with glutaraldehyde. Lab Invest. 16 (5), 736-750 (1967).
  18. Wisse, E., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World J Gastroenterol. 16 (23), 2851-2866 (2010).
  19. Vreuls, C., et al. Jet-fixation: a novel method to improve microscopy of human liver needle biopsies. Hepatology. 59 (2), 737-739 (2014).
  20. Furrer, K., et al. Serotonin reverts age-related capillarization and failure of regeneration in the liver through a VEGF-dependent pathway. Proc Natl Acad Sci U. S. A. 108 (7), 2945-2950 (2011).
  21. Zhang, Q., et al. OxLDL induced injury and defenestration of HLSECs via LOX-1. J Mol Endocrinol. , (2014).
  22. May, D., et al. A transgenic model for conditional induction and rescue of portal hypertension reveals a role of VEGF-mediated regulation of sinusoidal fenestrations. PLoS One. 6 (7), e21478(2011).
  23. Funyu, J., Mochida, S., Inao, M., Matsui, A., Fujiwara, K. VEGF can act as vascular permeability factor in the hepatic sinusoids through upregulation of porosity of endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun. 280 (2), 481-485 (2001).
  24. Venkatraman, L., Tucker-Kellogg, L. The CD47-binding peptide of thrombospondin-1 induces defenestration of liver sinusoidal endothelial cells. Liver Int. 33 (9), 1386-1397 (2013).
  25. Wack, K. E., et al. Sinusoidal ultrastructure evaluated during the revascularization of regenerating rat liver. Hepatology. 33 (9), 363-378 (2001).
  26. Morsiani, E., Mazzoni, M., Aleotti, A., Gorini, P., Ricci, D. Increased sinusoidal wall permeability and liver fatty change after two-thirds hepatectomy: An ultrastructural study in the rat. Hepatology. 21 (2), 539-544 (1995).
  27. Straub, A. C., et al. Arsenic-stimulated liver sinusoidal capillarization in mice requires NADPH oxidase–generated superoxide. J Clin Invest. 118 (12), 3980-3989 (2008).
  28. Barberá-Guillem, E., Arrue, J. M., Ballesteros, J., Vidal-Vanaclocha, F. Structural changes in endothelial cells of developing rat liver in the transition from fetal to postnatal life. JJ Ultrastruct Mol Struct Res. 97 (1-3), 197-206 (1986).
  29. Jamieson, H. A., et al. Caloric restriction reduces age-related pseudocapillarization of the hepatic sinusoid. Exp Gerontol. 42 (4), 374-378 (2007).
  30. Cogger, V. C., et al. Hyperlipidemia and surfactants: the liver sieve is a link. Atherosclerosis. 189 (2), 273-281 (2006).
  31. Cogger, V. C., et al. The effects of oxidative stress on the liver sieve. J Hepatol. 41 (3), 370-376 (2004).
  32. Cogger, V. C., et al. Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations. J Struct Biol. 171 (3), 382-388 (2010).
  33. Braet, F., de Zanger, R., Seynaeve, C., Baekeland, M., Wisse, E. A comparative atomic force microscopy study on living skin fibroblasts and liver endothelial cells. J Electron Microsc. 50 (4), 283-290 (2001).
  34. Monkemoller, V., et al. Imaging fenestrations in liver sinusoidal endothelial cells by optical localization microscopy. Phys Chem Chem Phys. 16 (24), 12576-12581 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Liver Sinusoidal Endothelial CellsScanning Electron MicroscopyFenestration AnalysisPerfusion FixationTissue DehydrationSputter CoatingImage J AnalysisFenestration DiameterFenestration FrequencyPercent Porosity

מאמרים קשורים