בסרטון הזה אנחנו מדגימים כיצד לבודד תאים mononuclear ממערכת העצבים המרכזית של חולדות עם Encephalomyelitis אוטואימונית ניסיונית.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בידוד של תאים mononuclear ממערכת העצבים המרכזית של חולדות עם EAE
במאמר זה
סיכום
תקציר
אם לומד מחלה אוטואימונית מכוונת למערכת העצבים המרכזית (CNS), כגון Encephalomyelitis אוטואימונית ניסויית (EAE, 1), או את התגובה החיסונית לזיהום של מערכת העצבים המרכזית, כגון שיתוק ילדים, ליים neuroborreliosis, או הנאורוסיפיליס, היא לעתים קרובות יש צורך לבודד את CNS-הסתננות תאים חיסוניים.
בפרוטוקול-video זה אנו מדגימים כיצד לבודד תאים mononuclear (MNCs) של מערכת העצבים המרכזית של עכבר עם EAE. השלב הראשון של הליך זה דורש זלוף הלב של מכרסם עם מלוחים פתרון על מנת להבטיח כי לא נשאר דם בכלי הדם להשקיית העצבים המרכזית. כל זיהום דם מלאכותי יהיה להגדיל את מספר ניכר CNS-הסתננות MNCs ועשויים לשנות את הרכב לכאורה של החיסון לחדור. לאחר מכן, אנו מדגימים כיצד להסיר את המוח ואת חוט השדרה של חולדה על dilaceration הבאים להכין ההשעיה תא בודד. השעיה זו מופרדים על שיפוע Percoll שתי שכבות על מנת לבודד את MNCs. לאחר כביסה, תאים אלה אז מוכן לעבור כל הליך הנדרש.
Mononuclear תאים מבודדים באמצעות הליך זה הם קיימא יכול לשמש electrophysiology, cytometry זרימה (FACS), או ביוכימיה. אם הטכניקה מבוצעת בתנאים סטריליים (בעזרת מכשירים סטריליים במנדף בתרבית רקמה) תאים יכול גם להיות מבוגר בינוני בתרבית רקמה. האוכלוסייה תא נתון יכול להיות מטוהרים נוסף או באמצעות הליכים הפרדה מגנטית או FACS.
פרוטוקול
- עמוק להרדים חולדות. תרסיס עם אתנול 70% ולעשות זלוף לב עם PBS עבור 10 דקות להסיר תאים כלי הדם (לחתוך את הפרוזדורים perfuse ימין דרך החדר השמאלי).
- הסר את המוח ואת חוט השדרה מקום בתוך שפופרת המכילה 50 מ"ל קר כקרח PBS. חותכים את המוח ואת חוט השדרה במסננת תא 70 מ"מ להציב צלחת פטרי 10 ס"מ המכיל 10 מ"ל של קר כקרח PBS. לחץ על כל פיסת איבר דרך מסננת התא באמצעות האחורי של הבוכנה סטרילי 1 מ"ל במזרק. אסוף את ההשעיה תא בודד לתוך שפופרת 50 מ"ל על הקרח. לשטוף את התא מסננת עם PBS ולהוסיף הצינור עד הפתרון הוא ברור.
- צנטריפוגה 8-10 דקות ב 390 גרם
- Resuspend התאים Percoll PBS 20 מ"ל + 30% ו כיסוי על 10 מ"ל של Percoll PBS + 70%.
- צנטריפוגה ב 390 גרם במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
- הסר את השומן על גבי הצינור. איסוף התאים מממשק ולשטוף פעמיים עם PBS. הרוזן.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הליך זה, כמו כל ההליכים הקשורים בבעלי חיים, חייב להיות מאושר על ידי שימוש בבעלי חיים המוסד שלך וועדת אכפת. אנו ממליצים כי וטרינר או טכנאי וטרינרי להיות נוכח בעת ביצוע perfusions הלב הראשון, כדי להבטיח רמה מספקת של ההרדמה ניתנת לבעל החיים לפני ובמהלך ההליך, וכי בעלי החיים אינם עוברים כאב מיותר או מצוקה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות | |
|---|---|---|---|---|
| PBS, 1x, סטרילי | ריאגנט | GIBCO, by Life Technologies | 14190-250 | |
| מסנן תאים, 70 um | כלי | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Percoll | ריאגנט | Sigma-Aldrich | P1644 |
מקורות
- Beeton, C., Chandy, K. G. Induction and clinical scoring of chronic-relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Visualized Experiments. 5, Forthcoming.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
