דוח זה מספק תיאור מפורט של השתלת תימי עכברים מעכברים בגילאים שונים מתחת לקפסולת הכליה של מושתלי עכברים חסרי חיסון. מטרת גישה זו היא למדל התפתחות תאי T ואירועי ברירה תימית in vivo.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בידוד והשתלה של שתלי הרתי Murine בני שונים.
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
המנגנונים המסדירים את היעילות של בחירת הרתי יישארו לא מוגדר. השיטה שהוצגה כאן מאפשרת in vivo ניתוחים של הפיתוח והבחירה של תאי T ספציפיים לעצמית ואנטיגנים זרים. הגישה כרוכה השתלה של שתלי הרתי נגזרים מעכברים בגילים שונים למקבלי SCID immunodeficient. על פני תקופה קצרה יחסית של זמן הנמענים מחדש באופן מלא עם תאי T הנגזרים משתל התימוס המושתל. רק thymocytes זריעת התימוס בעת הבידוד לעבור בחירה ולהתפתח לתאי T בשלים. ככזה, שינויים באופי והספציפיות של תאי T engrafted כפונקציה של אירועי הרתי תלוי גיל ניתן להעריך. למרות שנדרשה מומחיות טכנית להשתלה הרתי מוצלחת, שיטה זו מספקת אסטרטגיה ייחודית ללמוד in vivo מגוון רחב של פתולוגיות המגיעות לי או תוצאה של פונקצית הרתי חריגה ו / או homeostasהוא.
מבוא
התימוס הוא איבר שבו אירועים קריטיים בהתפתחות תאי T להתרחש 1. thymocytes התושב, עם סידורו מחדש של הקולטן תא T α (TCR) וגני β, לעבור סדרה של אינטראקציות עם תאי lymphostromal והצגת אנטיגן (APC) באזורים בקליפת המוח והלשדיים של בלוטת התימוס 2. בחירה חיובית הרתי מתווכת על ידי תאי אפיתל הרתי קליפת המוח (TEC) לייצר thymocytes שמכיר פפטידים אנטיגני בהקשר של מעמד מארח גדול המורכב histocompatibility (MHC) I ו- II מולקולות 2-3. סלקציה שלילית הרתי לאחר כרוכה טיהור של thymocytes אוטוריאקטיבים, מונעת על ידי אינטראקציה עם TEC הלשדי או תאים דנדריטים (DC) שפפטידים ההווה נגזרים מחלבונים עצמיים מחויבים אני כיתת MHC....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
המחקרים בעכברים אושרו על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) מאוניברסיטת צפון קרוליינה בצ'פל היל וכל הטיפול בבעלי החיים היה בהתאם להנחיות IACUC.
1. הכנת היילוד והמבוגרים Thymi
- הכן את כל חומרים כימיים וציוד לפני הרדמת חסד עכברים תורמים.
- לעקר מכשירי ניתוח על ידי מעוקר או שיטות מתאימות אחרות. כל הניתוחים חייבים להתבצע בזרימה למינרית לשמור על תנאים סטריליים ולמנוע זיהום. להרכיב את הכלים דרושים להפקת thymi מעכברי תורם.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
ההצלחה של הליך זה תלויה בטראומה כירורגית מינימאלית, כמו גם את המיקום מדויק של השתל מתחת לכמוסה בכליות. שתל הרתי יש לחתוך כדי להבטיח כראוי בגודל חלקי הרתי להשתלה הבאה, כפי שמוצג באיור 1. בעקבות סכמטי באיור 1, thymi מעכברים שזה עתה נולדו או מבוגר יכול לשמש להשתלת subcapsular מוצלחת עם תוצאות engraftment תא T עקביות ושחזור. כאמור, מיקום המתאים של השתל תחת הקפסולה הכליות הוא חשוב בשמירה על הישרדות לטווח ארוך, פונקציה, וכלי דם של השתל. כפי שניתן לראות .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
אירועים המסדירים את הברירה התימית אינם מובנים היטב. מחקרים אחרונים הראו שינויים אונטוגניים ביעילות הברירה. צימוד גישה זו עם עכברים שונים של תורם ותימוס טרנסגני יקל עוד יותר על מחקרים לזיהוי האירועים והפרמטרים המווסתים את הברירה התימית. יש לציין כי השתלת בלוטת התימוס משמשת לטיפול וניהול של תאי T והפרעות תימיות הנראות למשל בתינוקות אתימיים חסרי תאי T תפקודיים ובחולים עם תסמונת דיג'ורג', המאופיינים בהיפופלזיה תימית או אפלזיה תימית9-10. השתלת בלוטת התימוס, כמו רוב השתלות האיברים, אינה חפה מסיבוכים, הנובעים בעיקר מ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין אינטרסים פיננסיים מתחרים לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מימון שהתקבל מהמכונים הלאומיים לבריאות (1R01AI083269).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| אתנול | Decon Laboratories | 2705HC | |
| PBS | GIBCO | 14190-144 | pH 7.4 |
| תמיסת בטדין | Purdue Products | 67618-150-17 | |
| מחט 18 מד | BD | 305195 | |
| תפרים (1.0 מטרי) | Ethicon | J493G | 18 אינץ' (45 ס"מ) |
| קליפס פצע AUTOCLIP (9 מ"מ) | קליי אדמס® מותג | 427631 | |
| העברת פיפטה | פישר סיינטיפיק | 13-711-20 | סטרילי, חד פעמי |
| עכבר anti-CD3 Ab | eBioscience | 11-0031-85 | שיבוט: 1452C11 |
| עכבר anti-CD4 Ab | eBioscience | 48-0042-82 | שיבוט: RM4-5 |
| עכבר anti-CD8 Ab | eBioscience | 25-0081-82 | שיבוט: 53-6.7 |
| Lancet | Medipoint | Goldenrod 4 מ"מ | |
| פסיפיק תפוז Succinimidyl Ester, מלח טריאתילאמוניום | Invitrogen | P30253 | |
| 96 בארות צלחות פוליפרופילן בוטון עגולות | קורנינג | 3365 | |
| 1.2 מ"ל צינורות אשכול פוליפרופילן | קורנינג | 4401 | |
| 5 מ"ל צינורות פוליפרופילן תחתונים עגולים | BD | 352002 | |
| 40uM תא ניילון מסננת | Falcon | 352340 | |
| תמיסת פרפורמלדהיד 16%, | שירותי מיקרוסקופיה אלקטרונית | 15710 | |
| משחה אופטית מסוכנת Puralube | פישר NC0138063 | ||
| מדעי לימפוליט | Cedarlane | CL5030 | |
| צלחת תרבית תאים 60 מ"מ | קורנינג | 430196 | 60 מ"מ x 15 מ"מ, סטרילי |
מקורות
- Kappler, J. W., Roehm, N., Marrack, P. T cell tolerance by clonal elimination in the thymus. Cell. 49 (2), 273-280 (1987).
- Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nat. Rev. Immunol. 6, 127-135 (2006).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
