מאמר שיטה

Immunostaining לדמיין פיתוח מערכת עצבים Murine מעיים

DOI:

10.3791/52716

⸱

29 באפריל 2015

 ,  ,  , 
1Department of Surgery, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health, 2Department of Neurosciences, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health, 3Department of Pediatrics, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכת העצבים המעי נוצרת על ידי תאי פסגה עצבית שמתרבים, נודדים ומתיישבים במעיים. תאי פסגה עצבית מתמיינים לנוירונים עם סמנים ספציפיים לפנוטיפ המוליך העצבי שלהם. פרוטוקול זה מתאר טכניקה לניתוח, קיבוע וצביעה חיסונית של מערכת העיכול העוברית של העכברים כדי להמחיש ביטוי נוירוטרנסמיטר של מערכת העצבים המעי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכת העצבים המעי נוצרת על ידי תאי פסגה עצבית שמתרבים, נודדים ומתיישבים במעיים. לאחר הקולוניזציה, תאי הפסגה העצבית חייבים להתמיין לנוירונים עם סמנים ספציפיים לפנוטיפ המוליך העצבי שלהם. נוירונים כולינרגיים, פנוטיפ נוירוטרנסמיטר עיקרי במערכת העצבים המעי, מזוהים על ידי צביעה לכולין אצטילטרנספראז (ChAT), האנזים המסנתז לאצטילכולין. מאמצים היסטוריים לדמיין נוירונים כולינרגיים נפגעו על ידי נוגדנים בעלי ספציפיות שונה למערכת העצבים המרכזית לעומת מערכת העצבים ההיקפית ChAT. אנו ואחרים התגברנו על מגבלה זו על ידי שימוש בנוגדנים נגד ChAT שליה, המזהה ChAT מרכזי והיקפי כאחד, כדי לדמיין בהצלחה נוירונים כולינרגיים אנטריים עובריים. בנוסף, השווינו את הנוגדן הזה לדיווחים גנטיים עבור ChAT והראינו שהנוגדן אמין יותר במהלך האמבריוגנזה. פרוטוקול זה מתאר טכניקה לניתוח, קיבוע וצביעה חיסונית של מערכת העיכול העוברית של העכברים כדי להמחיש ביטוי נוירוטרנסמיטר של מערכת העצבים המעי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכת תפקוד מעי עצבים (ENS), השולטת בתנועתיות, מזין קליטה, וזרימת דם מקומית, היא חיונית לחיים 1. ENS נוצר על ידי תאים עצביים פסגה (NCC) שמתרבים, להעביר וליישב את הבטן, שבו הם להתמיין הנוירונים הגרעינים המכילים ותאי גלייה. מחלת הירשפרונג (תורשה של מנדל HSCR, באינטרנט באיש), הפרעה מולדת multigeneic עם שכיחות של 1 ב4,000 לידה חי, יכולה להיחשב המחלה אבטיפוס ללימוד היווצרות ENS שיבש. בHSCR, NCC לא מצליח להעביר ולליישב אורכים משתנה של המעי האחורי דיסטלי 2. בנוסף, במערכת העיכול נפוצה אחרת (GI) פגמים התפתחותיים באוכלוסיית הילדים, כגון מומים אנו-רקטליות, atresias מעיים, והפרעות תנועתיות קשורות עם הפרעות בתפקודים בסיסיים ENS, וצפויה הקשורים בשינויים קלים, אינם מוערכים, אנטומיים ושינויים תפקודיים ב3-6 ENS. לכן, טכניקות שתאפשרנה לנו להבין את הגורמים התפתחותיים של היווצרות ENS עשויות לשפוך אור על הפתוגנזה וטיפול פוטנציאלי של הפרעות בדרכי עיכול בילדים.

בעקבות הגירה והתישבות, NCC מבדיל לתוך הנוירונים עם סמנים ספציפיים לפנוטיפ העצבי שלהם. נוירונים כולינרגית מהווים כ 60% מתאי עצב מעיים 7, ויכולים להיות מזוהים על ידי מכתים לacetyltransferase כולין (צ'אט), אנזים הסינתזה להנוירוטרנסמיטר אצטילכולין מעורר. מבחינה הסטורית, מנסה לדמיין נוירונים כולינרגית היו מבולבל על ידי שונה סגוליות אנטיגן של נוגדנים המכוונים נגד מערכת עצבים מרכזית (CNS) צ'אט לעומת מערכת עצבים היקפית (PNS) צ'אט 8-10. עם זאת, נוגדנים המכוונים נגד צ'אט שליה להכיר שני צ'אט המרכזי והיקפי 11-13, ויש לנו טכניקות מתוארות לאחרונה המאפשרות לvisualization של נוירונים כולינרגית ENS עם רגישות גבוהה מוקדם יותר בפיתוח מאשר הושג עם קווי כתב צ'אט 14.

כאן, אנו מציגים טכניקה לנתח, לתקן וimmunostaining של מערכת העיכול עוברי עכברית לדמיין ביטוי עצבי ENS בתאי עצב. למחקרים אלה, שנוצלנו עכברי הצ'אט-Cre הזדווגו עם R26R: בעלי חיים tdTomato לייצר צ'אט-Cre; R26R: floxSTOP עכברי tdTomato (המוגדרים כצ'אט-Cre tdTomato ברחבי כתב היד): floxSTOP. בעלי חיים אלה ולאחר מכן היו הזדווגו עם עכברי כתב צ'אט-GFP הומוזיגוטים, להשיג עכברים להביע שני כתבי ניאון המזהים ביטוי צ'אט 14. שני בעלי חיים אלה הם כתב על רקע C57BL / 6J והם זמינים מסחריים (ג'קסון מעבדות, בר הרבור, ME).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אוניברסיטת ויסקונסין טיפול בבעלי חיים ושימוש הוועדה אישרה את כל הנהלים.

1. הכנה של פתרונות

  1. השתמש פוספט 1x שנאגרו (PBS) כחיץ לנתיחה ופתרון שטיפה.
  2. הכן סוכרוז 30% על ידי במשקל 30 גרם של סוכרוז ומקום לבקבוק. להוסיף 99 מיליליטר של 1x PBS ולהוסיף 1 מיליליטר 10% אזיד הנתרן. מערבבים היטב עד שכל סוכרוז הוא נמס. עד נדרשת חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
  3. הכן חסימת פתרון על ידי ערבוב 1x PBS, 3% אלבומין בסרום שור (BSA) ושל 0.1% Triton-X-100. מערבבים היטב ולאחסן במקרר עד צורך.
  4. הכן 8% paraformaldehyde פתרון (PFA) ב1x PBS על ידי שקילת הכמות המתאימה של PFA לPBS 1x ולאחר מכן לדגור על 65 מעלות צלזיוס עד שהוא נמס לגמרי. חנות ב -25 aliquots מיליליטר ב-20 ° C במקפיא עד צורך. לדלל את PFA 4% ב- ​​PBS 1x ביום שימוש.

2. העובר וגוט לנתחיון

  1. בהתאם למוסדי טיפול בבעלי חיים ושימוש הוועדה אישר פרוטוקולים, להרדים עכבר בהריון בעיתוי ולהעביר את הרחם לקרח קר המכיל 60 מ"מ צלחת פטרי 1x PBS.
  2. תחת מיקרוסקופ לנתיחה באמצעות מספריים חדים, לחתוך את דופן הרחם הפתוחה לחשוף את העוברים. הסר את העוברים מן הרחם והמקום ל-60 מ"מ צלחת פטרי המכילה נקייה קר כקרח 1x PBS.
  3. להרדים כל עובר על ידי עריפת הראש ב1x קר כקרח PBS. אם אתה משתמש בעכברים מהונדסים המכילים חלבוני ניאון, תחת תאורת הקרינה, לזהות את העוברים מהונדסים החיוביים.
  4. לנתח את מערכת עיכול מכל עובר באמצעות מיקרוסקופ לנתיחה. בעזרת מלקחיים בסדר, לכוון את העובר כך שצד השמאל פונה כלפי מעלה וצד ימין הוא נגד החלק התחתון של צלחת פטרי. הסר את קיר הגוף העליון מהעובר כדי לחשוף את האיברים הפנימיים. הכנס מלקחיים עדינים בין קיר גוף גב והאיברים הפנימיים. CrOSS מלקחיים אחד נגד השני בפעולת חיתוך כמו מספריים כדי להסיר את האיברים הפנימיים של העובר.
  5. בהמשך תת-לנתח את מערכת העיכול מהאיברים שמסביב ואז למקם את כל מערכת עיכול לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר המכיל קר כקרח 1x PBS.

3. קיבוע של קטעי GI

  1. יש לשטוף את כל מערכת עיכול 3 פעמים עם 1x קר כקרח PBS ולאחר מכן להחליף עם PFA 4%. תקן את שטחי GI בצינורות 1.5 מיליליטר microcentrifuge על פלטפורמת נדנדה ב RT תמורת 1.5 שעות. יש לשטוף את שטחי GI 3 פעמים במשך 5 דקות ב RT ולאחר מכן במשך שעה 1 על פלטפורמת הנדנדה. בשלב זה, לאחסן קטעי GI על 4 מעלות צלזיוס בסוכרוז 30% ב 1x PBS המכיל 0.1% אזיד הנתרן עד צורך.
    הערה: לחלופין, לאחסן את העוברים בסוכרוז 30% לשנה עד אחת ללא כל השפעה על שלמות הרקמות. אחסון של הדגימות בסוכרוז 30% מאפשר עיבוד מאוחר יותר של הדגימות או לimmunostaining או לאוקטובר לcryo-מדור שng. לחלופין, להמשיך בפרוטוקול immunostaining מפורט להלן.

4. Immunostaining פרוטוקול

  1. אם דגימות אוחסנו ב -30% סוכרוז, לשטוף אותם 3 פעמים במשך 20 דקות ב1x PBS על פלטפורמת נדנדה.
  2. מניחים את שטחי GI לפתרון חסימה על פלטפורמת נדנדה 1h ב RT.
  3. הסר את פתרון חסימת דגירה שטחי GI עם הכמות המתאימה של נוגדנים עיקריים מדולל חסימת פתרון גם עבור 4 שעות ב RT או O / N ב 4 ° C על פלטפורמת נדנדה. השתמש 1: 1,000 דילול של נוגדן אנושי אנטי-הו (סרום המתקבל ממטופל), 1: 1,000 דילול של נוגדן עוף אנטי-ירוק חלבון פלואורסצנטי (GFP) ו -1: של נוגדן אנטי צ'אט עז 100 דילול.
    הערה: אנו מנצלים נוגדן אנטי-הו אנושי שהושג באופן מקומי ממטופל, לעומת זאת, נוגדנים נגד הו זמינים מסחרי, למשל, עכבר אנטי-הו, (שימוש ב1: 500 דילול).
  4. יש לשטוף את שטחי GI ב1x PBS3 פעמים במשך 5 דקות ולאחר מכן עבור שעה 1 ב RT על פלטפורמת נדנדה.
  5. החלף את PBS 1x עם נוגדנים משני בדילול 1: 500 בחסימת פתרון על פלטפורמת נדנדה לאו 4 שעות על RT או O / N ב 4 מעלות צלזיוס. השתמש צבע אמין-reactive אנטי אנושי חמור כגון DyLight, Cy2 אנטי-עוף חמור וCy5 אנטי-העז החמור. אם נוגדן אנטי-הו העכבר באמצעות לאחר מכן להשתמש דילול 1: 500 של צבע אמין-reactive החמור אנטי עכבר 405.
    הערה: עוצמת GFP אנדוגני וביטוי tdTomato והבהירות של immunostaining עלייה עם גיל התפתחותי. אנחנו בדרך כלל immunostain אומץ עוברי בנפרד ב0.2 מיליליטר צינורות עם 150 μl של פתרון מכתים במטרה לצמצם את הנפח של נוגדן המשמש וגם כדי להבטיח צביעה יעילה של הרקמות.
  6. יש לשטוף את שטחי GI בPBS 3 פעמים 1x למשך 5 דקות ולאחר מכן עבור שעה 1 ב RT על פלטפורמת נדנדה.
  7. מניחים כמה טיפות של מדיום הרכבה הקרינה עם DAPI על גבי זכוכית. לטבול את tra GICT להרכבה בינוני הקרינה ולהוסיף מכסה זכוכית ישירות על גבי הרקמה. הקרינה ההרכבה -G הבינוני היא תרכובת מסיס במים המספקת חותם חצי קבוע.
    הערה: הרכבה בינונית הקרינה השימוש כגון Vectashield שהוא גליצרול מבוסס הרכבה בינונית שמונע דהייה וphotobleaching של נוגדנים. שני מוצרים אלה מאפשרים רקמות להיות מאוחסנות במשך תקופות ארוכות של זמן על 4 מעלות צלזיוס.
  8. צלם תמונות של כל אחד מfluorophore באמצעות מיקרוסקופ confocal. השתמש באורכי גל עירור לfluorophores ומסננים המועסקים מוצגת בלוח 3.
  9. לבצע ניתוח תמונה בעזרת מחשב באמצעות תוכנה מתאימה, בהתאם לסוג של confocal משמש ללכידת תמונות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שתארנו בעבר את הדור של עכברים המבטאים את שני כתבי ניאון GFP וtdTomato המזהים ביטוי צ'אט 14. בקצרה, עכברי צ'אט-Cre זווגו עם R26R: floxSTOP: בעלי חיים tdTomato לייצר צ'אט-Cre; R26R: עכברי tdTomato (נקראים צ'אט-Cre tdTomato): floxSTOP. בעלי חיים אלה ולאחר מכן היו הזדווגו עם עכברי כתב צ'אט-GFP הומוזיגוטים. עוברים היו מבודדים ורקמות נותחו לפני שקבועות immunostained כאמור לעיל, עם הנוגדנים המופיעים בטבלה 1...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המעבדה ואחרים שלנו הראו כי ליקויים במערכת העיכול בHSCR אינם מוגבלים למעי גס aganglionic אבל הרחיבו proximally, אפילו למעי הדק ganglionated 5,15,16. שינויים אלה כוללים שינויים בפנוטיפ צפיפות והעצבי העצבי ENS ועשויים להסביר dysmotility שנצפה בחולים עם HSCR. יש לנו מנוצלים הטכניקות לעיל במאמצינו להבין את הגורמים להיווצרות ENS. באופן ספציפי, טכניקות אלה היו מועסקים לדמיין נוירונים עצביים synthase תחמוצת חנקן (nNOS), תאי עצב פוליפפטיד מעיים vasoactive (VIP), כמו גם acetyltra...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על איגוד כירורגי ילדים אמריקאי פרס קרן (AG) והמכון הלאומי לבריאות K08DK098271 (AG) bythe.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מי מלח חוצץ פוספטBR0014G
סוכרוזFisherS2
נתרן אזידFisherBP9221
סרום בקר אלבומיןFisherBP1605
Triton X-100SigmaX100
ParaformaldehydeSigma158127
60 מ"מ צלחות פטריפישרFB0875713A
מיקרוסקופ פלואורסצנטיניקוןSMZ-18 סטריאוסקופ
דיסקציה מיקרוסקופניקוןSMZ-18
מלקחיים עדיניםכלי מדע עדינים11252-20
1.5 מ"ל צינורות אפנדורףVWR20170-038
פלואורומאונט-Gדרום-ביוטכנולוגיה, ברמינגהאם, AL0100-01
שקופיות זכוכיתפישר12-550-15
כיסוי זכוכיתVWR16004-330
מיקרוסקופ קונפוקליניקון ניקון A1
ניקון אלמנטים ניקון

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gershon, M. D. Developmental determinants of the independence and complexity of the enteric nervous system. Trends Neurosci. 33 (10), 446-456 (2010).
  2. Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a review. J Med Genet. 45 (1), 1-14 (2008).
  3. Erickson, C. S., Barlow, A. J., et al. Colonic enteric nervous system analysis during parenteral nutrition. J Surg Res. 184 (1), 132-137 (2013).
  4. Erickson, C. S., Zaitoun, I., Haberman, K. M., Gosain, A., Druckenbrod, N. R., Epstein, M. L. Sacral neural crest-derived cells enter the aganglionic colon of Ednrb(-/-) mice along extrinsic nerve fibers. J Comp Neurol. 20 (3), 620-632 (2011).
  5. Zaitoun, I., Erickson, C. S., et al. Altered neuronal density and neurotransmitter expression in the ganglionated region of Ednrb null mice: implications for Hirschsprung's disease. Neurogastroenterol Motil. , (2013).
  6. Margolis, K. G., Stevanovic, K., et al. Enteric neuronal density contributes to the severity of intestinal inflammation. Gastroenterology. 141 (2), 588-598 (2011).
  7. Qu, Z. -D., Thacker, M., Castelucci, P., Bagyánszki, M., Epstein, M. L., Furness, J. B. Immunohistochemical analysis of neuron types in the mouse small intestine. Cell Tissue Res. 334 (2), 147-161 (2008).
  8. Bian, X. -C., Bornstein, J. C., Bertrand, P. P. Nicotinic transmission at functionally distinct synapses in descending reflex pathways of the rat colon. Neurogastroenterol Motil. 15 (2), 161-171 (2003).
  9. Johnson, C. D., Epstein, M. L. Monoclonal antibodies and polyvalent antiserum to chicken choline acetyltransferase. J Neurochem. 46 (3), 968-976 (1986).
  10. Tooyama, I., Kimura, H. A protein encoded by an alternative splice variant of choline acetyltransferase mRNA is localized preferentially in peripheral nerve cells and fibers. J Chem Neuroanat. 17 (4), 217-226 (2000).
  11. Koga, T., Bellier, J. -P., Kimura, H., Tooyama, I. Immunoreactivity for Choline Acetyltransferase of Peripheral-Type (pChAT) in the Trigeminal Ganglion Neurons of the Non-Human Primate Macaca fascicularis. Acta histochemica et cytochemica. 46 (2), 59-64 (2013).
  12. Sang, Q., Young, H. M. The identification and chemical coding of cholinergic neurons in the small and large intestine of the mouse. Anat Rec. 251 (2), 185-199 (1998).
  13. Lei, J., Howard, M. J. Targeted deletion of Hand2 in enteric neural precursor cells affects its functions in neurogenesis, neurotransmitter specification and gangliogenesis, causing functional aganglionosis. Development (Cambridge, England). 138 (21), 4789-4800 (2011).
  14. Erickson, C. S., Lee, S. J., Barlow-Anacker, A. J., Druckenbrod, N. R., Epstein, M. L., Gosain, A. Appearance of cholinergic myenteric neurons during enteric nervous system development: comparison of different ChAT fluorescent mouse reporter lines. Neurogastroenterol Motil. 26 (6), 874-884 (2014).
  15. Teitelbaum, D. H., Caniano, D. A., Qualman, S. J. The pathophysiology of Hirschsprung's-associated enterocolitis: importance of histologic correlates. J Pediatr Surg. 24 (12), 1271-1277 (1989).
  16. Aslam, A., Spicer, R. D., Corfield, A. P. Children with Hirschsprung's disease have an abnormal colonic mucus defensive barrier independent of the bowel innervation status. J Pediatr Surg. 32 (8), 1206-1210 (1997).
  17. Puig, I., Champeval, D., De Santa Barbara, P., Jaubert, F., Lyonnet, S., Larue, L. Deletion of Pten in the mouse enteric nervous system induces ganglioneuromatosis and mimics intestinal pseudoobstruction. J Clin Invest. 119 (12), 3586-3596 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Enteric Nervous SystemMurine Embryonic GutCholine AcetyltransferaseImmunostaining TechniquePlacental ChAT AntibodyNeural Crest CellsCholinergic NeuronsGastrointestinal Tract DissectionEmbryonic DevelopmentNeurotransmitter Phenotype

מאמרים קשורים